线粒体融合素基因2突变体Mfn2-1A抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖及机制研究

目的:研究线粒体融合素基因2(Mfn2)的突变体片段Mfn2-1A,对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞的增殖抑制作用,并进一步探讨相关作用机制。方法:用已构建的重组腺病毒Adv-Mfn2-1A感染大鼠血管平滑肌细胞,利用细胞计数、四甲基偶氮唑盐比色法检测血管平滑肌细胞增殖,流式细胞仪检测细胞生长周期,蛋白免疫印迹法分析Mfn2-1A对信号通路Mek-Erk1/2蛋白表达水平的影响。结果:重组腺病毒Adv-Mfn2-1A感染平滑肌细胞能正常表达相应蛋白;转染Adv-Mfn2-1A后能抑制平滑肌细胞增殖(P<0.05),第3天开始效果明显;Adv-Mfn2-1A较Adv-Mfn2作用效果更显著(P<0.05);转染Adv-Mfn2-1A和Adv-Mfn2后阻滞于G0/G1期的细胞明显增多,转染Mfn2-1A后阻滞在G0/G1期细胞达到(77.74±3.67)%;Mfn2-1A可降低平滑肌细胞中磷酸化Erk1/2蛋白的表达,效果比Mfn2更明显(P<0.05)。结论:Mfn2基因突变体片段1A可明显抑制血管平滑肌增殖,使细胞阻滞在G0/G1期,其机制与抑制Mek-Erk1/2信号通路有关。

线粒体融合素基因-2对人乳腺癌MCF-7细胞株增殖与化疗敏感性的影响

背景与目的:线粒体融合素基因-2(mitofusin-2gene,mfn2)是作用于线粒体外膜的一种增殖抑制基因,mfn2过表达可抑制血管平滑肌细胞的增殖。本研究探讨外源性mfn2对人乳腺癌细胞MCF-7增殖以及化疗敏感性的影响。方法:将含有mfn2cDNA的质粒在阳离子聚合物的介导下体外转染MCF-7细胞,Westernblot法检测绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的表达,细胞计数及MTT法检测mfn2对MCF-7细胞增殖的影响,流式细胞术检测MCF-7细胞周期分布及喜树碱处理前后细胞凋亡的变化。结果:转染mfn2基因的MCF-7细胞可以稳定高表达GFP。MTT实验提示转染mfn2cDNA后,MCF-7细胞增殖明显受到抑制,DNA直方图显示细胞停滞于S期,转染mfn2cDNA组S期细胞比率为(42.7±1.3)%,高于转染空质粒组的(17.2±2.0)%和空白对照组的(19.6±1.7)%(P<0.05)。mfn2基因转染后诱导的细胞凋亡率从(3.6±0.6)%升高到(16.0±0.3)%;加入喜树碱4h后转染mfn2基因的细胞凋亡率为(69.6±4.3)%,高于转染空质粒组的(31.0±1.8)%和空白对照组的(23.4±2.8)%(P<0.05)。结论:转染mfn2基因可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,增强MCF-7细胞对喜树碱的敏感性。

线粒体融合素基因-2与肿瘤

线粒体融合素基因-2(mitofusin-2 gene,Mfn-2)是作用于线粒体外膜的一种增殖抑制基因,在维持线粒体的形态、功能等方面起着重要作用。随着研究的不断深入,Mfn-2在细胞信号转导、能量代谢、增殖及凋亡等生命过程中的作用日益显现。而肿瘤发生与细胞过度增殖及凋亡不足等密切相关,因此,如何抑制肿瘤细胞的过度增殖和促进细胞凋亡已成为目前的研究热点。Mfn-2通过多条通路参与多种肿瘤传代细胞系的增殖和凋亡,其表达异常或功能缺失可能是肿瘤发生、发展的重要原因。Mfn-2在许多肿瘤组织中低表达,且表达情况与肿瘤病理类型及生物学行为密切相关,提示其有可能是新的抑癌基因;同时,Mfn-2过表达与喜树碱、放线菌酮(cycloheximide,CHX)等化疗药物联用具有协同作用,提示具有成为化疗增敏靶点的潜力。本文就Mfn-2的功能与肿瘤发生、发展的关系及其治疗学意义的相关研究进展进行综述。

线粒体融合素2基因突变体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的研究大鼠线粒体融合素2基因的蛋白激酶A磷酸化位点两种突变体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其相关的信号通路。方法利用两种携带蛋白激酶A磷酸化位点突变的线粒体融合素2基因重组腺病毒(Adv-Mfn2-alaPKA和Adv-Mfn2-asnPKA)和携带线粒体融合素2基因的重组腺病毒(Adv-Mfn2),感染培养的大鼠血管平滑肌细胞。水溶性四甲基偶氮唑盐法比较各组细胞增殖的变化;流式细胞术比较各组细胞周期的变化;免疫印迹法比较各组线粒体融合素2基因和磷酸化细胞外调节激酶1/2蛋白表达变化。结果感染重组腺病毒的三组细胞线粒体融合素2基因表达差异无显著性。与对照组相比,Adv-Mfn2-alaPKA和Adv-Mfn2组显著抑制细胞增殖(P<0.01),停滞于G0/G1期细胞比例显著增加(P<0.01),磷酸化细胞外调节激酶1/2蛋白表达水平显著降低(P<0.01),且Adv-Mfn2-alaPKA作用更明显(P<0.01),而Adv-Mfn2-asnPKA组较对照组差异无显著性。结论Mfn2-alaPKA通过细胞外调节激酶1/2信号通路抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用较线粒体融合素2基因更明显;而Mfn2-asnPKA对血管平滑肌细胞无抑制增殖的作用,对细胞外调节激酶1/2信号通路也无作用。蛋白激酶A磷酸化位点是调控线粒体融合素2基因抗血管平滑肌细胞增殖的重要功能位点。

去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因对血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的研究大鼠线粒体融合素2基因在去除蛋白激酶A磷酸化位点后对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响及其相关的信号通路。方法利用携带去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因重组腺病毒(Adv-Mfn2-PKA(△))和携带线粒体融合素2基因的重组腺病毒(Adv-Mfn2),感染培养的大鼠血管平滑肌细胞。免疫印迹分析相关蛋白的表达;激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位;细胞凋亡酶联免疫吸附法比较其对细胞凋亡的影响;免疫印迹法分析磷酸化蛋白激酶B蛋白表达变化。结果外源基因转染后可表达特异性蛋白产物;激光共聚焦显微镜显示去除蛋白激酶A磷酸化位点后的线粒体融合素2基因表达产物主要分布于线粒体外膜;酶联免疫吸附法检测显示去除蛋白激酶A磷酸化位点后,线粒体融合素2基因诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡作用显著减弱(P<0.01),与空白对照组差异无显著性;免疫印迹检测表明Mfn2-PKA(△)组磷酸化蛋白激酶B表达较Mfn2组显著升高(P<0.01),与空白对照组差异无显著性。结论去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因表达产物仍主要分布于线粒体外膜,但其诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用丧失,对蛋白激酶B信号通路也无抑制作用。这表明蛋白激酶A磷酸化位点是调控线粒体融合素2基因诱导血管平滑肌细胞凋亡的重要功能位点。

去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因与血管平滑肌细胞增殖(英文)

背景:线粒体融合素2基因作用于血管平滑肌细胞Ras蛋白,通过胞外信号调节蛋白激酶1/2通路抑制细胞增殖。线粒体融合素2基因氨基酸序列第442位丝氨酸为蛋白激酶A磷酸化位点,与其磷酸化状态密切相关,可能参与其功能调控。目的:观察大鼠线粒体融合素2基因在去除蛋白激酶A磷酸化位点后对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其相关信号通路。方法:利用已构建的携带绿色荧光蛋白基因、线粒体融合素2基因和去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因的3种重组腺病毒,感染大鼠主动脉血管平滑肌细胞,将其传代培养3～10代后以抽签法随机分为4组:①不加干预的对照组。②感染携带绿色荧光蛋白的对照组(Adv-GFP组)。③感染携带线粒体融合素2基因的实验组(Adv-Mfn2组)。④感染携带去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因的实验组(Adv-Mfn2-PKA(△)组)。激光共聚焦显微镜观察完整的和去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因在细胞中的定位。Westernblot检测p-ERK1/2表达水平及完整的和去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因在血管平滑肌细胞中的表达。MTT法绘制细胞生长曲线。结果与结论:完整的和去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因在血管平滑肌细胞中均表达蛋白特异性条带。两种基因表达产物都主要分布于线粒体外膜。与对照组和Adv-GFP组相比,Adv-Mfn2组吸光度值在第3,4,5,6天都显著降低(P<0.01),Adv-Mfn2-PKA(△)组吸光度值无明显变化。与对照组和Adv-GFP组相比,Adv-Mfn2组p-ERK1/2表达水平显著降低(P<0.01),Adv-Mfn2-PKA(△)组无明显变化。提示去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因定位于线粒体外膜,对血管平滑肌细胞的增殖无拮抗作用,对胞外信号调节蛋白激酶1/2通路无抑制作用。

线粒体融合素基因-2对乳腺癌细胞RECK基因表达的影响

目的探讨线粒体融合素基因-2(mfn2)对乳腺癌细胞株MCF-7细胞中RECK表达的影响。方法利用脂质体lipofectamine2000将构建的重组真核表达质粒pEGFP-mfn2转染MCF-7细胞。RT-PCR检测细胞mfn2和RECK基因mRNA的转录水平;Weastern blot法检测mfn2及RECK蛋白的表达。结果转染pEGFP-mfn2质粒的MCF-7细胞可以稳定高表达mfn2,RECK基因在转染空质粒组和未转染组细胞中无表达,转染mfn2基因后RECK基因mRNA转录及蛋白的表达显著升高。结论mfn2基因可激活MCF-7细胞中RECK基因的表达。

线粒体融合素基因-2对人骶韧带成纤维细胞增殖及功能的影响

目的：研究外源性线粒体融合素基因-2（Mfn2）表达对骶韧带成纤维细胞的增殖及其合成前胶原蛋白功能的影响。方法：取新鲜骶韧带组织，用组织块法在体外培养出成纤维细胞。将第2～4代细胞分组：转染LV-Mfn2-GFP组（Mfn2＋组），转染LV-GFP组（Mfn2-组）和未转染组（对照组）。流式细胞仪检测细胞绿色荧光蛋白（GFP）表达，RT-PCR和Western blot检测Mfn2表达。细胞计数和cck-8法检测Mfn2对细胞增殖的影响，流式细胞术检测细胞周期分布。RT-PCR和Western blot检测细胞前胶原1 A1/1A2/3A1的表达。结果：转染慢病毒的成纤维细胞GFP蛋白表达率73.2％～79.1％，转染Mfn2＋组成纤维细胞稳定高表达Mfn2蛋白，显著高于Mfn2-组和对照组（P＜0.05，both）。cck-8实验提示，转染表达Mfn2基因96h后，成纤维细胞增殖明显受到抑制，Mfn2＋组细胞数显著低于 Mfn2-组和未转染组（P＜0.05 both）；DNA直方图分析法测定显示转染Mfn2基因的细胞大部分停滞于G0/G1期，Mfn2＋组G0/G1期细胞比例（60.7％±3.26％），显著高于 Mfn2-组（43.2％±3.32％）和对照组（40.8％±2.28％），（P＜0.05， both）。半定量RT-PCR和Western blot示Mfn2＋组成纤维细胞合成表达前胶原1A1/1A2/3A1显著低于Mfn2-组和对照组（P＜0.05，all）。结论：Mfn2基因在体外转染成纤维细胞后，抑制细胞增殖并使成纤维细胞前胶原蛋白表达下降，可能是导致骶韧带细胞外基质减少，影响韧带纤维数量和质量的重要原因。

线粒体融合素-2对裸鼠移植瘤Ki-67、血管内皮生长因子的影响

目的:探讨瘤内注射vivo-jetPEITM/pEGFP Mfn2复合物对裸鼠移植瘤增殖的影响。方法:质粒pEGFPMfn2的构建及检测,将MCF-7细胞异种移植到裸鼠体内,建立人乳腺癌移植瘤模型,用vivo-jetPEITM试剂制备vivo-jetPEITM/DNA复合物,实验共分为实验组、空载体对照组和空白对照组。瘤内多点注射,RT-PCR检测肿瘤组织线粒体融合素-2(Mfn2)的表达,免疫组化检测Ki-67、血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果:pEGFPMfn2构建成功并测序证实,实验组的相对平均吸光度值为(1.12±0.05)高于空载体对照组的(0.16±0.05)和空白对照组(0.17±0.07)(P<0.05),Ki-67在实验组的相对平均吸光度为(0.25±0.06)高于空载体对照组的(0.11±0.02)和空白对照组(0.12±0.03)(P<0.05),而VEGF在实验组的相对平均吸光度为(0.09±0.01)低于空载体对照组的(0.14±0.08)和空白对照组的(0.13±0.03)(P<0.05)。结论:vivo-jetPEITM试剂能成功将Mfn2基因转染进瘤体细胞,Mfn2基因对人乳腺癌裸鼠移植成瘤后的Ki-67和VEGF有影响。

阿托伐他汀通过下调线粒体融合素2表达抑制大鼠心肌缺血再灌注后细胞凋亡

目的研究阿托伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注(I/R)损伤后细胞凋亡及线粒体融合素2表达的影响。方法选取雄性SD大鼠32只,随机分为假手术组(sham),缺血再灌注组(I/R),阿托伐他汀1组(statin 1)和阿托伐他汀2组(statin 2),每组8只。Statin 1组术前7 d开始每日给予阿托伐他汀10 mg/(kg·d)灌胃,statin 2组药物剂量为40 mg/(kg·d),I/R组以等体积蒸馏水灌胃,随后制备心肌I/R损伤模型。各组于再灌注3 h后剪取心脏I/R损伤区域,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,免疫印迹法检测磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的表达,免疫组化法检测线粒体融合素2的表达。结果与sham组相比,I/R组及statin 1组、statin 2组心肌细胞凋亡显著增加,p-Akt表达显著下降,线粒体融合素2表达显著增加(P<0.01);与I/R组相比,statin 1组、statin 2组心肌细胞凋亡和线粒体融合素2表达均显著降低(P<0.05),而p-Akt表达显著增高(P<0.05),且statin 2组较statin 1组变化更显著(P<0.05)。结论阿托伐他汀可抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤后的细胞凋亡,其作用可能与抑制线粒体融合素2表达有关。

瑞舒伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注后细胞凋亡及线粒体融合素2表达的影响

目的探讨瑞舒伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注损伤后细胞凋亡及线粒体融合素2蛋白表达的影响。方法选取雄性SD大鼠32只,随机分为假手术(Sham)组、缺血再灌注(I/R)组、瑞舒伐他汀1(Statin 1)组和瑞舒伐他汀2(Statin2)组,每组8只。Statin1组术前7天开始给予瑞舒伐他汀5 mg/(kg·d)灌胃,Statin2组药物剂量为20 mg/(kg·d),I/R组以蒸馏水灌胃,随后制备心肌缺血再灌注损伤模型。各组于再灌注3 h后剪取心脏缺血再灌注损伤区域,脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测细胞凋亡,免疫印迹法检测磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的表达,免疫组化法检测线粒体融合素2的表达。结果与Sham组相比,I/R组及Statin 1、2组心肌细胞凋亡显著增加,p-Akt表达显著下降,线粒体融合素2表达显著增加(P<0.01);与I/R组相比,Statin 1、2组心肌细胞凋亡和线粒体融合素2表达均显著降低(P<0.05),而p-Akt表达显著增高(P<0.05),且Statin 2组较Statin 1组变化更显著(P<0.05)。结论瑞舒伐他汀可抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤后的细胞凋亡,其作用可能与抑制线粒体融合素2表达有关。

阿托伐他汀下调大鼠心肌梗死后线粒体融合素2表达和细胞凋亡

目的研究阿托伐他汀通过下调线粒体融合素2表达抑制大鼠心肌梗死后细胞凋亡。方法雄性SD大鼠48只,随机分为假手术组(sham),心肌梗死组(MI),阿托伐他汀1组(statin 1)和2组(statin 2),每组12只。分别于术前7天开始每日灌胃,给予阿托伐他汀10和40 mg/kg,MI组以蒸馏水灌胃,随后结扎大鼠前降支建立心肌梗死模型。术后24 h用TUNEL法检测心肌细胞凋亡,免疫组化法检测线粒体融合素2表达,免疫印迹法检测磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达。结果与sham组相比,MI组心肌细胞凋亡显著增加,线粒体融合素2表达显著增加,p-Akt表达显著下降(P<0.01);与MI组相比,statin 1和2组心肌细胞凋亡和线粒体融合素2表达均显著降低(P<0.05),而p-Akt表达显著增高(P<0.05),且statin 2组较1组变化更显著(P<0.05)。结论阿托伐他汀可抑制大鼠心肌梗死后的细胞凋亡,其作用可能与下调线粒体融合素2表达有关。

瑞舒伐他汀对大鼠心肌梗死后细胞凋亡及对线粒体融合素2表达的影响

目的研究不同剂量瑞舒伐他汀对大鼠心肌梗死后细胞凋亡及线粒体融合素2蛋白表达的影响。方法选取雄性SD大鼠48只,随机分为假手术组(Sham),心肌梗死组(MI),瑞舒伐他汀1组(Statin 1)和瑞舒伐他汀2组(Statin 2),每组12只。Statin 1组术前7 d开始每日给予瑞舒伐他汀5 mg/kg灌胃,Statin 2组药物剂量为每日20 mg/kg,MI组以蒸馏水灌胃,随后制备心肌梗死模型。术后24 h采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,免疫印迹法检测磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的表达,免疫组化法检测线粒体融合素2的表达。结果与Sham组相比,MI组及Statin 1组、2组心肌细胞凋亡显著增加,p-Akt表达显著下降,线粒体融合素2表达显著增加(P<0.01);与MI组相比,Statin1组、2组心肌细胞凋亡和线粒体融合素2表达均显著降低(P<0.05),而p-Akt表达显著增高(P<0.05),且Statin 2组较1组变化更显著(P<0.05)。结论瑞舒伐他汀可抑制大鼠心肌梗死后的细胞凋亡,其作用可能与抑制线粒体融合素2表达有关。

Mfn2基因沉默对HepG_2细胞葡萄糖代谢和胰岛素信号通路的影响

目的研究线粒体融合素基因-2(mitofusin-2,Mfn2)沉默对人肝癌细胞株(HepG2)葡萄糖代谢和胰岛素信号通路分子丝/苏氨酸蛋白激酶(Akt1)的影响。方法构建Mfn2短发夹双链RNA(Mfn2shRNA)和阴性对照短发夹双链RNA(HK),将HepG2细胞株分为空白对照组(NC)、阴性对照组(HK)、Mfn2shRNA质粒转染组(Mfn2)。HK和Mfn2组细胞应用lipo-fectamine2000转染HepG2细胞株;采用葡萄糖氧化酶的方法和氚标记葡萄糖(3-3H-Glucose)放射性核素示踪法检测细胞葡萄糖消耗量和摄取率;Western blotting检测Mfn2和Akt1蛋白表达。结果与HK组比较,Mfn2组细胞Mfn2蛋白表达明显下降(0.23±0.05 vs 0.51±0.14,P=0.034),Akt1表达差异无统计学意义(0.13±0.00 vs 0.14±0.01,P=0.055);Mfn2组细胞葡萄糖消耗量明显下降(8.72±0.62 vs 9.75±0.35,P=0.001),葡萄糖摄取率亦显著下降(7.94±0.04 vs 9.64±0.13,P=0.002)。结论抑制Mfn2基因表达导致HepG2细胞葡萄糖代谢下降;Mfn2表达对葡萄糖代谢的影响是否通过PI3K/Akt信号通路介导还需要进一步研究。

Mfn2基因shRNA质粒的构建及其流体力学转染技术的实验研究

构建线粒体融合素基因2(Mfn2)短发卡RNA(Mfn2shRNA)表达质粒,观察流体力学注射法对绿色荧光蛋白器官靶向性。根据Mfn2基因序列,挑选1条目标基因序列和1条非特异性基因序列,构建质粒重组体并测序及鉴定。将24只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、阴性对照组和转染组(n=8),阴性对照组和转染组分别通过尾静脉快速注入阴性对照质粒(HK)和Mfn2shRNA质粒溶液1.5 ml。24 h后采集肝脏、心脏、肌肉、肾脏组织冰冻切片,荧光显微镜下观察,并取血清测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)浓度。结果表明:质粒HK和Mfn2shRNA构建成功;流体力学注射后,肝脏、心肌及肾脏可见绿色荧光蛋白的表达;与正常对照组比较,阴性对照组血清ALT、AST有明显差异,转染组血清ALT、AST较正常对照组及阴性对照组明显升高。Mfn2shRNA质粒载体的成功构建,流体力学肝脏靶向性的基因转染方法,为活体内研究Mfn2功能提供了可靠的材料和方法。

tMfn2基因诱导血管平滑肌细胞的凋亡(英文)

背景:线粒体融合素2蛋白,主要通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B诱导血管平滑肌细胞凋亡。去除穿膜区序列的线粒体融合素2蛋白,相对分子质量减小41%,诱导凋亡作用可能更强。目的:观察比较去除穿膜区序列的大鼠线粒体融合素基因2对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响及其相关的信号通路。设计、时间及地点:基因水平的对比观察实验。于2008-01/10在华中科技大学同济医学院附属同济医院分子心脏病中心实验室完成。材料:大鼠血管平滑肌细胞及携带半乳糖甘酶基因、携带线粒体融合素2基因和携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的重组腺病毒均由陈光慧教授惠赠。方法:将大鼠血管平滑肌细胞传代培养3～10代后随机分为4组,①空白对照组:不加干预。②携带半乳糖甘酶基因的对照组:感染携带半乳糖甘酶基因的重组腺病毒。③携带线粒体融合素2基因的实验组:感染携带线粒体融合素2基因的重组腺病毒。④携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的实验组:感染携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的重组腺病毒。主要观察指标:①重组腺病毒感染血管平滑肌细胞24h后观察完整的和去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因的表达情况。②感染后24,48和72h采用流式细胞术、酶联免疫吸附法观察细胞凋亡情况。③免疫印迹分析病毒感染血管平滑肌细胞24h后磷酸化蛋白激酶B表达变化。结果:①感染后完整的和去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因在血管平滑肌细胞中均有表达。②去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用显著增强,且呈时间依赖性(P<0.01)。③两个实验组中磷酸化蛋白激酶B水平均明显降低,但去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因实验组更显著(P<0.01)。结论:去除穿膜区序列的线粒体融合素基因2诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用更强,其机制与抑制蛋白激酶B磷酸化有关。

Mfn2基因过表达对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及EGFR、EGF蛋白表达的影响

目的通过使人乳腺癌MCF-7细胞过表达线粒体融合素基因-2(Mfn2),研究外源性Mfn2基因对MCF-7细胞增殖及对表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)蛋白表达的影响。方法实验分为对照组、转染空质粒pEGFP-N1组、转染Mfn2质粒的pEGFP-Mfn2组。转染48h后,检测各组细胞的转染效率、Mfn2mRNA及Mfn2蛋白表达。检测各组MCF-7细胞增殖情况、各组MCF-7细胞周期分布情况。同时检测各组EGFR及EGF蛋白表达情况。结果转染48h后pEGFP-N1组及pEGFP-Mfn2组转染效率分别为(49.15±2.04)%及(51.10±2.18)%,高于对照组[(0.58±0.21)%,P<0.05];pEGFP-Mfn2组的Mfn2mRNA及Mfn2蛋白表达均显著高于对照组及pEGFP-N1组(P<0.05);pEGFP-Mfn2组MCF-7细胞增殖抑制率显著高于其余两组(P<0.05),细胞周期主要阻滞于G0/G1期;pEGFP-Mfn2组EGFR和EGF蛋白表达水平显著低于其余两组(P<0.05)。结论 Mfn2基因过表达可显著抑制MCF-7细胞增殖,其机制可能与Mfn2基因过表达导致了EGFR及EGF表达下调有关。

氚示踪法评估RNAi介导Mfn2基因沉默对小鼠体内物质代谢的影响

采用同位素示踪技术研究RNAi介导线粒体融合素基因-2(Mfn2)沉默小鼠体内物质代谢变化。构建了含Mfn2短发卡RNA(short hair RNA,shRNA)干扰质粒和阴性对照质粒。24只BALB/c小鼠分为转染组和阴性对照组,每组各12只,转染组经尾静脉注射Mfn2干扰质粒,对照组注入阴性对照质粒。质粒注入5 d后,将氚水(3H2O)或氚标记葡萄糖(3-3H-Glucose)经腹腔或尾静脉注射到小鼠体内,留取血标本和组织标本,用液体闪烁计数仪测定标本放射性浓度,计算小鼠组织脂肪酸合成率和肝脏葡萄糖生成率,两组间均数比较采用t检验。结果显示,Mfn2基因转染组小鼠肝脏葡萄糖生成率为49.43±16.31,明显高于阴性对照组的24.91±4.07(P<0.05),肝脏、肌肉、心脏、脂肪组织的脂肪酸合成率分别为0.10±0.00、9.12±1.90、1.18±0.28、11.11±1.31,显著低于阴性对照组0.79±0.07,70.52±13.95,53.88±9.90,45.43±5.91。以上结果表明,Mfn2基因在体内葡萄糖和脂肪酸代谢中起重要作用。

Mfn2基因抑制Ras-PI3K-Akt信号途径并诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡

目的应用腺病毒介导的转基因技术,研究过表达线粒体融合素基因-2(mitofusin-2,Mfn2)对WKY大鼠主动脉血管平滑肌细胞(rVSMCs)凋亡的影响并探讨其相关的信号通路。方法体外培养rVSMCs,感染含有Mfn2基因的腺病毒载体(Adv-Mfn2-GFP)。通过免疫组化染色显示细胞凋亡的形态学特征;采用琼脂糖凝胶电泳,Cell DeathELISA观察过表达Mfn2基因对细胞凋亡的影响;用Western blot检测感染Mfn2基因后不同时间点的磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)水平的变化。结果rVSMCs感染Adv-Mfn2-GFP后能有效表达出相应蛋白;过表达Mfn2基因能明显促进rVSMCs凋亡,并抑制ET-1诱导的Akt活化和ERK活化,此作用显示出时间依赖性,且Akt活化受到的抑制更明显。结论过表达Mfn2基因能明显促进WKY大鼠主动脉血管平滑肌细胞凋亡,其分子机制是抑制Ras信号途径的活化,分子作用靶点可能是Ras-PI3K-Akt信号通路。

去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因对血管平滑肌细胞凋亡的影响(英文)

目的研究大鼠线粒体融合素2基因在去除蛋白激酶A磷酸化位点后对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响及其相关的信号通路。方法构建携带去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因重组腺病毒和携带线粒体融合素2基因的重组腺病毒并感染血管平滑肌细胞。Western blot分析两种基因表达产物;激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位;细胞凋亡ELISA法比较其对细胞凋亡的影响;Western blot分析磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达变化。结果外源基因转染后可表达特异性蛋白产物,都主要分布于线粒体外膜;细胞凋亡ELISA表明,去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用显著减弱(P<0.01),与对照组无显著差异;Western blot检测表明,血管平滑肌细胞感染去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因后,p-Akt表达较感染线粒体融合素2基因组显著升高(P<0.01),与对照组无显著差异。结论去除蛋白激酶A磷酸化位点后,线粒体融合素2基因表达产物亚细胞定位未发生改变,主要分布于线粒体外膜,但诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用丧失,对蛋白激酶B信号通路也无抑制作用。表明蛋白激酶A磷酸化位点是调控线粒体融合素2基因诱导血管平滑肌细胞凋亡的重要功能位点。