贵州本地山羊线粒体转录因子B2基因5′调控区SNP筛查与生物信息学分析

试验旨在筛选线粒体转录因子B2(mitochondrial transcription factor B2,TFB2M)基因启动子区SNP,并研究其对启动子功能元件的影响。选择贵州本地优良品种黔北麻羊、贵州白山羊及贵州黑山羊3种山羊构建不同DNA池,直接测序筛选SNP位点。TFB2 M基因5′调控区存在4个SNPs位点,分别为:G-601C、C-381A、C-286T和G-283T。生物信息学软件预测得到TFB2 M基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近大量转录因子新位点产生和原来结合位点消失,但并不改变CpG岛大小。TFB2 M基因5′调控区存在4个对启动子功能元件有较大影响的SNPs位点。本研究结果为进一步确定TFB2 M基因启动子功能奠定基础。

贵州白山羊线粒体转录因子B2基因在组织中的表达

为探明线粒体转录因子B2(TFB2 M)基因在贵州白山羊组织中的表达规律,采用实时荧光定量PCR技术测定TFB2 M基因在贵州白山羊心、肝、脾、垂体和下丘脑组织中的表达量。结果表明:目的基因TFB2 M和内参基因β-actin的熔解曲线均呈单一峰形,说明所选条件可准确定量TFB2 M基因在贵州白山羊各组织中的相对表达量。TFB2 M基因在贵州白山羊心、肝、脾、垂体和下丘脑组织中的相对表达量分别为1、0.5092、3.9228、1.9138和0.6744,表现为脾>垂体>心>下丘脑>肝。

小尾寒羊TFB2M基因遗传变异分析

试验旨在分析小尾寒羊线粒体基因转录因子B2(Mitochondrial Transcription Factors B2,TFB2M)基因遗传变异,采集小尾寒羊血液,采用直接测序方法,对该基因8个外显子、5’-UTR和3’-UTR多态位点进行分析。结果发现,编码区错义突变1个(G226A,GCC→ACC)导致76位苏氨酸变为丙氨酸,5’-UTR发现一处颠换(C58G);3’-UTR有三个突变位点(C98G、A206G和A429T)。生物学软件对启动子和5’-UTR转录因子预测结果显示共有54个转录因子结合位点,5’-UTR 58bp处没有结合位点,因此,该突变并没有改变结合位点。本研究为绵羊TFB2M基因变异及其功能研究奠定了分子生物学基础。

线粒体转录复合物相关蛋白原核表达与纯化

目的获取人线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体转录因子B1(TFB1M)、线粒体转录因子B2(TFB2M)基因片段,高效表达和纯化带有谷胱甘肽转移酶(GST)标签的GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白。方法设计引物扩增得到TFAM、TFB1M、TFB2M的cDNA片段,通过引入的酶切位点克隆至表达载体pET42a,构建重组表达载体,并导入E.coliBL21宿主菌中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组的GST融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠纯化表达产物,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析鉴定。结果获得pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M、pET42a-TFB2M表达质粒,测序结果与GenBank的基因序列一致。SDS-PAGE分析结果显示,重组GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白分别在相对分子质量56 000、67 000、69 000处出现特异性蛋白条带,经GST亲和层析纯化后,得到高纯度的融合蛋白。结论成功构建了基因重组体pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M、pET42a-TFB2M,制备了GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白。

哺乳动物细胞线粒体基因的转录与调控

线粒体是在各类真核细胞中广泛存在的一种细胞器,主要参与细胞内能量供给、自由基生成和细胞凋亡等生物学过程。大量研究结果表明,线粒体功能紊乱与线粒体疾病、肿瘤的发生发展和耐药性产生以及衰老等密切相关。近年来,在线粒体基因组功能领域的研究有了飞速的发展,已初步认识到线粒体DNA转录起始需要线粒体RNA聚合酶、线粒体转录因子A、两个同源的线粒体转录因子B1或B2的同时存在,线粒体转录终止因子(mTERF)家族的成员则有可能在转录终止的过程中发挥作用,但某些方面的具体机制还有待进一步阐明。本文中将简要介绍近年来国内外在线粒体DNA的转录及调控等领域的研究进展情况。

心阴片对慢性心力衰竭模型小鼠线粒体能量代谢的影响

目的探讨心阴片治疗慢性心力衰竭的可能作用机制。方法60只C57BL/6J小鼠随机分为假手术组8只,模型组、曲美他嗪组及心阴片低、高剂量组各13只。除假手术组外,其余各组采用主动脉弓缩窄术制备慢性心力衰竭模型。造模后心阴片低剂量组给予心阴片292.5mg/kg灌胃,心阴片高剂量组给予心阴片1170mg/kg灌胃,曲美他嗪组给予盐酸曲美他嗪片15mg/kg灌胃,假手术组和模型组给予0.1ml/10g蒸馏水灌胃。各组均每天1次,共8周。检测心功能各指标包括左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、左室舒张内径(LVIDd)、左室收缩内径(LVIDs),观察心脏组织形态学、心肌组织胶原纤维沉积、心肌细胞线粒体超微结构变化,检测心脏组织过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同活化因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)、线粒体转录特异因子B2(TFB2M)蛋白表达及心肌组织三磷酸腺苷(ATP)水平。结果与假手术组比较,模型组LVEF、LVFS明显下降,LVIDd、LVIDs明显升高,PGC-1α、NRF1及TFB2M蛋白表达显著降低,心脏组织ATP水平降低(P<0.05);心肌细胞明显增大,排列不规则,胶原纤维沉积明显增多,线粒体数量减少、体积肿胀,线粒体膜结构不完整,嵴模糊。与模型组比较,曲美他嗪组及心阴片低、高剂量组LVEF、LVFS、LVIDs改善,ATP水平显著提高(P<0.05);心阴片低剂量组PGC-1α、TFB2M蛋白表达,心阴片高剂量组PGC-1α、NRF1、TFB2M蛋白表达,曲美他嗪组NRF1、TFB2M蛋白表达均明显升高(P<0.05);各组心脏组织形态学明显改善,胶原纤维沉积明显减轻,线粒体超微结构破坏较少。结论心阴片能改善慢性心力衰竭模型小鼠心功能,其机制可能是调控PGC-1α/NRF1/TFB2M信号通路进而改善线粒体能量代谢。