衰老小鼠脑老化过程中线粒体结构功能与mtDNA缺失的生物学规律

目的:研究小鼠脑老化过程中线粒体的生物学变化规律,探讨衰老的机制。方法:实验于2002-01/2003-04在广州体育学院科学实验中心及中山大学医学院完成。利用电镜对线粒体进行观察计数,Clark氧电极法测定线粒体呼吸链细胞色素C氧化酶及NADH脱氢酶活性,分光光度法测定抗氧化酶活性,聚合酶链反应检测mtDNA3866bp片段缺失率。结果:与5月龄小鼠比较,20月龄的老年小鼠脑线粒体数量减少、体积增大,线粒体呼吸控制率减小,而ADP/O比值无显著性差异,呼吸链NADH脱氢酶、细胞色素C氧化酶活性下降,mtDNA3866bp片段缺失率增加,而抗氧化酶活性却增大。通过各指标间的相关分析发现呼吸控制率与mtDNA缺失率显著相关(r=0.739,P<0.01),NADH脱氢酶、细胞色素C氧化酶活性与mtDNA缺失率亦显著相关(r=0.582,P<0.05,r=0.810,P<0.01),但抗氧化酶活性与mtDNA缺失率无相关性(r=0.256,P>0.05)。结论:推测衰老时mtDNA的损伤积累可引起呼吸链酶复合物活性下降,导致呼吸链功能减退致生物衰老。

根结线虫种群的线粒体DNA分析

在同工酶和形态学鉴定的基础上, 利用引物#C2F3和#1108对42个根结线虫种群线粒体DNA(mtDNA)中的COII和LrRNA间区域进行特异性PCR扩增, 35个种群的扩增产物约为1. 7kb,其中29个是南方根结线虫, 6个是爪哇根结线虫; 3个花生根结线虫种群的扩增产物约为1. 1kb; 1个种群的扩增产物约为0. 7kb,为根结线虫属在中国的新记录种; 3个北方根结线虫种群的扩增产物约为0. 5kb。用单条2龄幼虫提取物作模板得到的结果与大量提取DNA作模板的结果相同。为了区分产生相同大小片段的南方根结线虫和爪哇根结线虫,用限制性内切酶HinfⅠ对扩增产物进行酶切,结果表明:所有供试的南方根结线虫都可以被HinfⅠ酶切,且产生约1. 3和0. 4kb的2个限制性片段;但供试的爪哇根结线虫种群不能被酶切。由此表明,利用mtDNA PCR及酶切实验可以作为快速而准确地鉴定常见根结线虫的方法。

呼和浩特等地区嗜尸性苍蝇mtDNA中COⅠ基因序列检测及法医学应用

目的通过对嗜尸性苍蝇线粒体DNA(mtDNA)上细胞色素氧化酶辅酶Ⅰ(COⅠ)中278bp基因序列的分析,对其成虫及其幼虫、蛹、卵的种属进行鉴定,解决依据形态学方法难以鉴定的难题。方法随机分别采集呼和浩特和甘肃敦煌地区兔和猪尸体上的嗜尸性苍蝇、幼虫、蛹及其腹中的卵,提取其mtDNA,经PCR扩增、产物检测与纯化、测序等,进行序列分析和构建系统发育树。结果双翅目嗜尸性苍蝇的种内基因差异均数小于1%,种间差异均数大于3%,成虫与幼虫、蛹、卵之间无显著性差异。结论mtDNA上COⅠ序列分析均可以有效地对嗜尸性苍蝇及其幼虫、蛹、卵进行种属鉴定,方法快速、简便和精确,可作为法医学嗜尸性苍蝇种属鉴别的可靠方法。

45岁以下发病的糖尿病患者线粒体DNA tRNA^(Leu(UUR))突变的研究

目的:探讨天津地区发病年龄≤45岁的糖尿病(DM)患者中线粒体DNAtRNALeu(UUR)3243A→G突变的发生率及其相关因素。方法:随机选取无亲缘关系、发病年龄≤45岁的糖尿病患者348例,同期健康体检者207例为对照组。以聚合酶链反应(PCR)、限制性片段长度多态性(RFLP)及克隆的方法检测线粒体基因tRNALeu(UUR)3243A→G突变,并进行家系研究。结果:糖尿病组发现2例3243A→G突变,检出率为0.6%,在有家族史的糖尿病患者中发生率为1.2%。对照组未发现此突变。结论:tRNALeu(UUR)3243A→G突变在天津地区发病年龄≤45岁的糖尿病患者中检出率低,在合并其他线粒体病的患者中发生率较高。

十字花科植物线粒体DNA的提取和纯化

以十字花科植物芸芥 Eruca sativa 、白菜型油菜 Brassica rapa 和甘蓝型油菜 Brassica napus :武39- 1、武4 3- 1、武5 0 - 2为试材,在蔗糖衬垫法分离纯化m t DNA方法优点的基础上,通过4组不同离心力配比,采用差速离心法、改变缓冲液A的成分以及增加缓冲液的用量,建立了一种简便提取十字花科植物mt DNA方法.研究结果表明:分离细胞破碎组织的离心力、分离线粒体的离心力以及纯化线粒体时的离心力分别为10 0 0 g、2 0 0 0 0 g、180 0 0 g时可分离到高产量的线粒体,且在缓冲液A 蔗糖0 .5 m ol·L- 1 ,Tris- Cl5 0 mm ol·L- 1 ,EDTA5 m mol·L- 1 ,BSA 0 .1% ,PVP 0 .5 % ,0 .1%β-巯基乙醇,p H=7.5 中加入0 .5 % PVP可提高mt DNA的产量,经DNA电泳检测、RAPD扩增证明此方法得到的mt DNA可完全达到RAPD标记和其它分子生物学研究的要求.

PCR-SSCP在检测Leber遗传性视神经病变线粒体DNA突变的应用

目的探讨PCR-SSCP技术检测Leber遗传性视神经病变(LHON)线粒体DNA(mtDNA)3个原发突变的最佳分析条件。方法应用PCR-SSCP技术检测LHONmtDNA,对主要影响SSCP分辨率的聚丙酰胺凝胶的浓度和组成优化分析,并与突变特异性引物PCR(MSP)、限制性片段长度多态性(FRLP)及测序结果相印证。结果80g/L交联度为66:1的非变性聚丙酰胺凝胶能同时检出LHONmtDNA的三个原发致病突变,与MSP、FRLP及DNA测序的结果一致。结论该分析条件简便、快速,能有效地检测LHONmtDNA突变。

线粒体DNA缺失细胞系的建立

目的 线粒体DNA缺失细胞系的建立和鉴定。方法 利用EB可以插入无核蛋白保护的线粒体DNA分子 层状排列的碱基对之间抑制mtDNA复制的特点,将Lewis肺癌细胞在含有低剂量的EB、丙酮酸钠、尿嘧啶的培养液长期培 养。结果 经EB诱导,可培育出具有嘧啶依赖性的mtDNA缺失细胞系。结论 线粒体DNA缺失细胞系的建立,为进一 步研究线粒体DNA分子的基因及功能提供了条件。

草菇栽培菌株DNA多态性的PCR-RFLP和RAPD分析

12个草菇栽培菌株的核糖体DNA(rDNA)、线粒体DNA(mtDNA)和基因组总DNA的多态性被研究了。应用PCR-RFLP技术,扩增了rDNA5.8s+ITS区段及mtDNA小区段,并进行限制性酶切分析,结果表明菌株间的rDNA在5.8s+ITS区段的遗传差异小,据此只能将测试的12个菌株分为两类;而对mtDNA小区段的检测未能显示出菌株间的差异,表明测试的菌株在所研究的区段具有很高的遗传相似性。在此基础上,对基因组总DNA的RAPD分析表明,菌株两两间的遗传相似系数在0.554到0.898之间,而平均相似系数为0.707。通过平均链锁聚类方式(UPGMA)聚类,发现在相似系数0.710水平上,供试菌株可分为四大类。这些研究结果为草菇的育种提供了科学依据。

从微量血中快速制备线粒体DNA片段

目的建立从微量血中快速制备线粒体DNA(mtDNA)片段。方法取50μl抗凝血和常规酶解法提取的血DNA,同时扩增核DNA(nDNA)上的基因片段和mtDNA上的基因片段,华美公司生产的RedyPCR(tm)微量全血DNA纯化系统进行比较,PCR相对定量分析比较这3种方法提取的mtDNA片段的纯度。结果RedyPCR(tm)微量全血DNA纯化系统得到的mtDNA和常规酶解法提取的mtDNA有nDNA污染,而作者建立的方法获得的mtDNA纯度较高。结论同时与该法简便快捷地排除了nDNA的污染,适合于对mtDNA进行PCR分析和研究。

大肠癌细胞线粒体DNAD-环区的突变

目的研究线粒体DNAD-环区在大肠癌细胞中的突变情况。方法用PCR与直接测序相结合的方法,对比分析三株大肠癌细胞系和一例原代培养的正常肠上皮细胞的线粒体DNAD-环区的突变位点。结果三株大肠癌细胞系和正常肠上皮细胞的线粒体DNAD-环区均存在不同程度的点突变,其中72位C→T,73位A→G,16298位C→T,16519位T→C这4个突变位点在3株癌细胞和正常肠上皮细胞中均可检测到。在SW480和Lovo细胞中检测到16224位T→C、16311位T→C两个相同的突变位点,在SW480和HT29中检测到114位C→T、498位C→T、16234位C→T3个相同的突变位点,不同大肠癌细胞系中相同的突变位点考虑为细胞的特征性改变。结论大肠癌细胞线粒体DNAD-环区具有多态性和特征性突变,细胞特征性的突变可能与大肠癌患者的易感性有关。

由mtDNA清除THP-1细胞构建的人单核/巨噬细胞系Rho0细胞周期、凋亡、吞噬功能、炎症因子表达变化

目的 观察由线粒体DNA(mtDNA)清除人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)构建的人单核/巨噬细胞系Rho0细胞周期、凋亡、吞噬功能、炎症因子表达变化。方法 取THP-1细胞,使用溴化乙锭(EB)清除细胞中mtDNA,构建新的人单核/巨噬细胞Rho0。取Rho0细胞,分别给予1 mg/mL LPS或溶媒刺激24 h(计为Rho0-LPS组、Rho0-溶媒组);另取未经EB处理的THP-1细胞,分别给予1 mg/mL LPS或溶媒刺激24 h(计为Control-LPS组、Control-溶媒组);采用流式细胞术PI染色检测各组细胞周期,流式细胞术Annexin V-FITC/PI法测算各组凋亡细胞数,Red-Zymosan染料吞噬实验评估各组细胞吞噬功能(平均荧光强度)。取Rho0细胞(Rho0组)和取未经EB处理的THP-1细胞(Control组),采用RT-qPCR法检测炎症因子(IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 mRNA)。结果 与Control-溶媒组比较,Rho0-溶媒组G0~G1期、S期、G2/M期比例降低及细胞凋亡数增加和平均荧光强度增强,Control-LPS组细胞凋亡数增加和平均荧光强度增强(P均<0.05);与Rho0-溶媒组比较,Rho0-LPS组G0~G1期比例降低及细胞凋亡数增加(P均<0.05)。与Control组比较,Rho0组IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-10 mRNA表达升高(P均<0.05)。结论 清除mtDNA可导致Rho0细胞周期停滞,促进细胞凋亡,增强细胞吞噬功能及促炎功能。

4个绵羊品种线粒体细胞色素b基因的序列差异和系统进化研究

测定了小尾寒羊、大尾寒羊、洼地绵羊、滩羊和鲁北白山羊5个品种羊415bp线粒体DNA细胞色素b基因片段,其中44个位点检出变异。分析其碱基组成和变异情况,并以鲁北白山羊为外群,用UPGMA和NJ法构建了一系列分子系统树,得到相同的拓扑结构,在分子水平从母系遗传的角度澄清4个绵羊品种的起源分化关系。结果显示:在4个绵羊品种之间,洼地绵羊与滩羊关系最近与小尾寒羊亲缘关系最远。绵羊品种内的平均差异为0185%,线粒体DNA多态性相对贫乏,推测4个品种绵羊具有共同的母系祖先。

延吉市土壤中分离的棘阿米巴CJY/S3线粒体DNA限制性片段长度多态性

[目的]观察棘阿米巴土壤分离株CJY/S3的线粒体DNA限制性片段长度多态性.[方法]从棘阿米巴CJY/S3提取线粒体DNA,用EcoRI进行酶切,与广东地区土壤分离株CG/S1进行比较观察限制性片段长度多态性.[结果]延吉市土壤分离株CJY/S3与广东地区土壤分离株CG/S1具有相同的片段模式.[结论]延吉市棘阿米巴土壤分离株CJY/S3与CG/S1具有密切的亲缘关系,而线粒体DNA限制性片段长度多态性分析是棘阿米巴分类简便且有效的方法.

DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒在案件中的应用研究

本文探讨DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒在案件中应用的可行性。应用DNATyper mtDNASNP60^(TM)试剂盒对100个汉族无关个体和20组全同胞进行mtDNA SNP检验;取25 pg/μL马、牛、羊、猪、鸡、鸭、猫、狗、兔、鼠和大肠杆菌的DNA样品进行种属特异性测试;取5、10、20、40μmol/L血红素进行抗抑制性测试;取两个批次的DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒经反复冻融10次后进行稳定性测试;分别应用VeriFiler^(TM)Plus PCR扩增试剂盒和DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒对100份陈旧、腐败、降解检材进行检验。结果表明,100个汉族无关个体均获得清晰的mtDNA SNP分型结果,其检验结果与通过mtDNA测序获得的结果完全一致;100个汉族无关个体含有100种不同的单倍型;20组全同胞中每组个体之间mtDNA SNP分型结果相同;DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒对马、牛、羊、猪、鸡、鸭、猫、狗、兔、鼠和大肠杆菌的DNA样品进行检测,均未出现特异性分型;当血红素浓度≤40μmol/L时,所有mtDNA SNP位点均获得正确分型;两个批次的DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒经反复冻融10次后,所有mtDNA SNP位点均可正确分型;对于100份陈旧、腐败、降解检材,STR检出率为55%,mtDNA SNP的检出率为86%,mtDNA SNP的检出率显著高于STR。当模板DNA浓度大于5 pg/μL时,DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒能得到完整的分型谱图。综上,DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒可应用于陈旧、腐败、降解检材的检验,具有很好的实战应用价值。

安徽新安江水牛mtDNA D-Loop区遗传多样性与系统进化研究

试验旨在分析安徽省黄山市新安江流域上游地区新安江水牛群体的分子遗传特性,探究其母系起源与遗传多样性。利用PCR扩增和测序技术测定28头新安江水牛的mtDNA D-Loop序列,下载GenBank数据库中24个中国水牛群体的693条D-Loop序列,利用生物信息学分析其遗传多样性,构建Neighbor-joining系统发生树和Media-joining网络,探索不同水牛群体的遗传距离。结果显示,28头新安江水牛的mtDNA D-Loop序列共有117个变异位点,构成25种单倍型,其核苷酸多样性为0.02602±0.00303,单倍型多样性为0.989±0.014。新安江水牛群体的变异性水平与中国其他水牛群体接近。N-J系统进化树显示,新安江水牛25个单倍型分为A、B两个支系,具有A支系和B支系2个母系来源,其中A支系占据主导地位。Media-joining进化网络显示,中国水牛主要为沼泽型水牛,分为沼泽型水牛A支系和B支系,B支系又分为b1亚支系和b2亚支系。综上,新安江水牛群体变异水平与中国其他地方水牛群体接近,群体遗传多样性丰富;且新安江水牛属于沼泽型水牛,具有2个线粒体母系来源,与我国其他地方水牛群体具有一定的遗传距离。

线粒体DNA与心血管疾病相关性的研究进展

线粒体作为人体的能量工厂,具有自己独立的基因组——线粒体DNA(mtDNA)。心肌作为一种高耗能组织,线粒体的正常供能至关重要,而mtDNA在一定程度上可以影响线粒体的供能。根据最新的全球疾病负担研究,心血管疾病(CVD)是导致死亡的主要原因,冠心病是CVD患者主要的死亡原因之一。mtDNA作为一种新发现的生物标志物,与冠心病的发生机制、潜在的治疗靶点、对预后的预测等具有很强的关联性,本文就mtDNA与冠心病相关性的研究进展进行综述。

线粒体DNA含量在结直肠癌中的预后价值

目的:探究组织线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)含量和结直肠癌预后相关性。方法:选取117例结直肠癌患者并收集临床病理资料。运用RT-qPCR检测患者癌组织与癌旁组织mtDNA含量,探究mtDNA含量与各项预后指标的相关性。绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线,根据截断值区分患者并绘制无病生存期(disease free survival,DFS)曲线。单因素和多因素Cox回归分析探究术后DFS相关的危险因素。结果:与癌旁组织相比,癌组织mtDNA含量差异无统计学意义(P=0.432);低mtDNA含量与肿瘤位于结肠、低分化、TNM分期差、淋巴结转移相关(P <0.05)。ROC曲线提示mtDNA含量为500.699可作为截断值。单因素和多因素分析显示,mtDNA含量低于500.699(HR=4.285,95%CI:1.938~9.475)、肿瘤低分化(HR=2.886,95%CI:1.428~5.835)是与DFS相关的独立危险因素。结论:结直肠癌患者中,组织mtDNA含量与临床病理特征有关,低mtDNA含量是患者预后相关的独立危险因素。

血浆无细胞线粒体外线粒体DNA与牙周炎临床指标的相关性研究

目的血浆无细胞线粒体外线粒体DNA(cf-exmtDNA)具有促炎潜能,本文探讨血浆cf-exmtDNA与牙周炎临床指标的相关性。方法纳入18~45岁受试者78人,其中牙周健康者11人,牙龈炎患者11人,牙周炎患者56人。检查并记录基线牙周指标、年龄、性别、体质指数(BMI)和空腹血糖(FBG)。取4 mL抗凝静脉血,采用二次离心法提取其中cf-exmtDNA,使用实时荧光定量聚合酶链式反应检测cf-exmtDNA拷贝数。比较不同牙周炎症状态组血浆cf-exmtDNA水平,并对血浆cf-exmtDNA与平均探诊深度(mPD)、平均附着水平(mCAL)、平均出血指数(mBI)、平均菌斑指数(mPLI)、年龄、FBG、BMI等指标进行相关性分析以及多重线性回归分析。结果牙周炎组血浆cf-exmtDNA水平显著高于牙周健康组(P=0.042);样本整体血浆cf-exmtDNA水平与年龄(P=0.023)、mPD(P<0.001)、mCAL(P=0.006)、mBI(P=0.026)呈正相关关系;多重回归分析中,血浆cf-exmtDNA水平主要取决于mPD。结论在18~45岁人群中,牙周炎患者血浆cf-exmtDNA水平较牙周健康者显著升高,血浆cf-exmtDNA水平与年龄、mPD、mCAL、mBI呈正相关关系。