用人外周血线粒体DNA 4977bp缺失检测辐射损伤初探

初步探索用聚合酶链反应(PCR)方法进行辐射诱导的线粒体DNA4977bp缺失分析的可行性。对正常人外周血进行2GyCoγ射线的照射,照射后提取包含线粒体DNA的全基因组DNA,用PCR方法进行线粒60体DNA4977bp缺失分析,同时扩增很少缺失的线粒体DNA片段(16S?ND1);进而比较照射前后线粒体DNA4977bp缺失水平。结果表明,用于分析线粒体DNA4977bp缺失的引物对在最佳试验条件下,可特异性扩增出所有2Gy照射诱导的线粒体DNA4977bp缺失;该扩增产物经纯化、测序和核苷酸同源性分析,证实线粒体缺失发生在线粒体DNA序列的8470?13446bp。用于扩增16S?ND1的引物对在很大的温度变动范围内,均能扩出目的DNA片段。所有外周血样品在照射前无线粒体DNA4977bp缺失,2Gy60Coγ射线照射后特异诱导出此缺失。说明用本研究中建立的PCR方法,可用来分析电离辐射诱导的外周血有核细胞线粒体DNA4977bp缺失水平。

维生素E和辅酶Q10对大鼠内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变的预防作用

目的 研究维生素E、辅酶Q10对大鼠线粒体DNA 4 834缺失突变的预防作用。方法Wistar大鼠 4 6只 ,采用抽笼法随机分为 3组 ,实验组 (A组 ,18只 )阿霉素 1mg/kg腹腔注射 ,每周 2次 ,共 3个月 ,同时给予维生素E 5 0mg/kg和辅酶Q10 10mg/kg灌胃 ,每天 1次 ;生理盐水对照组 (B组 ,18只 )在给予阿霉素的同时予以生理盐水灌胃 ;空白对照组 (C组 ,10只 )仅给予生理盐水灌胃。提取内耳组织总DNA ,利用巢氏聚合酶链反应技术检测内耳组织线粒体DNA 4 834bp缺失突变的发生情况 ,并检测血清中谷胱甘肽过氧化物酶活性的变化。结果 A组大鼠线粒体DNA 4 834bp缺失突变发生率为 2 3 0 8% (3/ 13) ,B组为 6 8 75 % (11/ 16 ) ,C组为 0 (0 / 8) ,经Fisher′s精确概率检验 ,单侧检验 ,A组和B组之间差异有显著性 (P =0 0 18) ,A组和C组之间差异无显著性 (P =0 2 15 )。A组血清谷胱甘肽过氧化物酶活性较B组高 ,差异有显著性 (校正t′检验 ,单侧检验 ,t′=6 4 74 ,P <0 0 1) ;A组和C组之间差异无显著性 (校正t′检验 ,双侧检验 ,t′ =1 92 0 ,P >0 0 5 )。结论 维生素E和辅酶Q10具有增加机体对自由基的清除能力 ,保护内耳组织线粒体DNA ,降低 4 834bp缺失突变发生率的作用。

线粒体DNA缺失细胞系的建立

目的 线粒体DNA缺失细胞系的建立和鉴定。方法 利用EB可以插入无核蛋白保护的线粒体DNA分子 层状排列的碱基对之间抑制mtDNA复制的特点,将Lewis肺癌细胞在含有低剂量的EB、丙酮酸钠、尿嘧啶的培养液长期培 养。结果 经EB诱导,可培育出具有嘧啶依赖性的mtDNA缺失细胞系。结论 线粒体DNA缺失细胞系的建立,为进一 步研究线粒体DNA分子的基因及功能提供了条件。

人卵母细胞和胚胎线粒体DNA缺失的研究

目的:检测人类卵子和胚胎线粒体DNA(mtDNA)4977bp缺失,并探讨这种缺失存在的病理生理学意义。方法:收集不受精的成熟卵母细胞和不适合移植及冷冻保存的胚胎;碱裂解法制备单个细胞DNA;单细胞巢式PCR检测人卵母细胞和胚胎mtDNA4977bp缺失情况。结果:122个卵母细胞中,56个(45.9%)发现有4977bp缺失;90个胚胎中,21个(23.3%)发现有缺失,二者间差异有显著性意义。将卵母细胞和胚胎分别按患者的年龄分为<30岁组、30-34岁组和>34岁组,卵母细胞缺失率分别为:43.6%、44.4%和51.7%,各组间差异无显著性意义;各组胚胎的缺失率分别为21.4%、20.0%和29.6%,差异亦无显著性意义。将卵母细胞和胚胎分别按患者是否妊娠分组,结果发现妊娠组与非妊娠组间mtDNA缺失率的差异也无显著性意义。结论:mtDNA4977bp缺失与受精失败有关,其是否参与卵子老化及其机制有待进一步研究。

线粒体DNA缺失对人淋巴瘤Namalwa细胞生长和侵袭能力的影响

目的探讨线粒体DNA(mtDNA)缺失对人淋巴瘤Namalwa细胞生长和迁移能力的影响。方法采用溴化乙锭处理Namalwa细胞获得mtDNA缺失的ρ0-Namalwa细胞;营养缺陷法、PCR扩增线粒体DNA片段、Western bloting检测COXII蛋白表达等方法鉴定ρ0-Namalwa细胞;MTT方法及细胞周期测定细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力;流式细胞术检测活性氧(ROS)及细胞内钙离子水平。结果ρ0-Namalwa细胞在选择性培养基中正常生长,而在非选择性培养基中逐渐死亡;ρ0-Namalwa细胞未扩增出mtDNA片段以及未表达COXII蛋白;与Namalwa细胞相比,ρ0-Namalwa的细胞增殖率、迁移及侵袭能力、ROS水平及细胞内Ca2+浓度明显降低,细胞阻滞于G0/G1期。结论ρ0-Namalwa细胞与亲本Namalwa细胞相比,生长及迁移能力减弱,可能与细胞内ROS产生减少及细胞内Ca2+浓度降低有关。

老年学习记忆减退大鼠脑线粒体DNA缺失

目的和方法 :测定老年大鼠脑mtDNA缺失型 (以下简称缺失型 ) ,缺失mtDNA比例 ,探讨mtDNA缺失与老年性学习记忆减退的关系 ,为研究其分子机制提供基础资料。用Morris水迷宫将老年大鼠 (2 4个月 )筛选为老年学习记忆正常和学习记忆减退两组。用稀释PCR法测定大鼠大脑皮质、海马和小脑缺失型mtDNA比例。结果 :青老年鼠大脑皮质、海马和小脑均存在mtDNA缺失 ,片段为 4834bp ;青年鼠的缺失比例约为0 0 0 0 18%。老年记忆正常鼠上述 3个脑区缺失型mtDNA缺失比例分别是青年鼠的 6倍、6倍和 2倍 ;老年记忆减退大鼠上述脑区的缺失型mtDNA比例分别是老年记忆正常鼠的 2倍、1 8倍和 3倍。结论 :衰老时脑组织缺失型mtDNA增多 ,而老年学习记忆减退鼠较老年学习记忆正常鼠mtDNA缺失进一步成倍增加 ,表明相关脑区的mtDNA缺失在老年学习记忆减退的细胞分子机制中发挥重要作用。

有氧运动训练对增龄小鼠线粒体DNA缺失的影响

应用PCR技术 ,检测小鼠心肌、骨骼肌、肝脏、肾脏和大脑等组织mtDNA的缺失 ,探讨衰老及有氧运动训练延缓衰老的可能机制。结果发现 ,老年小鼠各组织mtDNA 3 866bp片段缺失发生率高于青年鼠。在所测的五种组织中肝脏mtDNA的缺失比例最低 ,大脑最高 ,说明衰老线粒体的功能下降是多系统的 ,但程度表现不均衡。长期有氧运动训练可显著减少 3 866bp片段缺失在心肌及骨骼肌中的积累 ,但肾脏mtDNA片段缺失有增多趋势 ,提示运动训练可能通过提高机体心肌、骨骼肌抗氧化应激能力 ,降低自由基影响 ,进而保护mtDNA。

人外周血细胞线粒体DNA中存在特大片段缺失突变

目的 :了解线粒体 DNA大片段缺失突变及其意义。方法 :采用 6种方法提取人外周血细胞 DNA ,其中 1种方法先分离线粒体 ,再抽提线粒体 DNA。以得到的人外周血细胞 DNA为模板进行 PCR扩增 ,其产物经琼脂糖凝胶回收后与p GEM- T载体连接、转化、测序。 结果 :6种方法抽提 DNA进行 PCR扩增后 ,产物电泳行为相同 ,发现人血细胞线粒体 DNA存在 13 16 2 bp特大片段缺失突变。 结论 :此缺失是首次发现的 ,经测序证明为人线粒体 DNA最大片段的缺失。

大鼠不同组织器官线粒体DNA缺失定量分析及其与老化的关系

目的 :探讨线粒体DNA缺失的组织器官间差异及其与老化和老年性耳聋的关系。方法 :依月龄将大鼠分为青年、中年和老年组 ;测试ABR阈值后从其不同器官组织和外周血中提取DNA ;PCR检测线粒体DNA4 83 4缺失 ,定量分析 ;克隆、测序。结果 :①随年龄增加 ,大鼠的ABR平均阈值明显升高 ;②所有老年大鼠的耳蜗、蜗核、大脑、心肌 (1例除外 )、肝脏和肌肉组织中均存在mtDNA4 83 4缺失 ,外周血仅少数缺失 ;③中青年组线粒体DNA4 83 4缺失的发生率和缺失占总mtDNA的百分比均低于老年组 (P <0 0 1) ;④mtDNA4 83 4缺失存在明显的器官组织间差异 ,肝脏组织中缺失占总mtDNA的百分比最高。结论 :大鼠多种器官组织中mtDNA4 83 4缺失随增龄而增加 ,而且存在器官组织间差异 ,检测外周血白细胞的mtDNA缺失并不能反映体内各器官组织中mtDNA缺失的发生情况 ,与听觉有关的耳蜗、蜗核组织中mtDNA缺失与老年聋的发生有关。

人外周血线粒体DNA4934bp自发缺失及^(60)Coγ射线诱发缺失的剂量效应关系初探

为探索正常人群外周血样品中线粒体DNA(mtDNA)4934bp缺失的发生比例及电离辐射是否可以诱发该缺失,对109例正常人外周血样品进行分析,确定正常人外周血样品中发生该缺失的比例,将3例缺失阳性正常人外周血样品,使其受到0、2和6Gy60Coγ射线照射,对4934bp缺失发生情况进行研究;经分析发现,41%的正常人外周血样品具有该缺失,聚合酶链反应PCR产物经克隆、测序和核苷酸同源性分析证实该缺失发生在线粒体DNA重链nt8435-nt13368之间。自发缺失发生比例与供者年龄增长相关(p<0.01),与性别无关。使用半定量聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR),缺失阳性正常人外周血样品在接受0、2和6Gyγ射线照射后,检测其mtDNA4934bp的缺失情况,发现在照射前后外周血线粒体DNA均有该缺失;以正常人外周血所做的半定量分析发现在照射0、2和6Gy后该缺失水平分别为23、25和27。说明电离辐射诱发人外周血样品缺失水平随剂量增加而增高。

实时定量PCR分析健康人外周血线粒体DNA 4977 bp缺失

目的:用实时定量PCR方法分析健康人外周血线粒体DNA4 977 bp的缺失情况。方法:收集27例年龄在17～44岁的健康人外周血,用荧光实时定量PCR方法对每个样品同时检测线粒体DNA 4 977 bp缺失的量和无4 977 bp缺失的量,进行定量分析。结果:在27例健康人外周血样品中,线粒体DNA4 977 bp缺失的阳性率为70.37%(19/27);19例有线粒体DNA4 977 bp缺失的样品,其扩增产物的CT值在第35个循环到第39个循环之间;无线粒体DNA 4 977 bp缺失的扩增产物的CT值在第15个循环到第21个循环之间;不同年龄组间线粒体DNA 4 977 bp缺失和无线粒体DNA4 977 bp缺失的量均无统计学差异。结论:本文中超过2/3的健康人外周血含有线粒体DNA 4 977 bp的缺失;在有该缺失的样品中大约每106～107拷贝中携带有一个线粒体DNA4 977 bp缺失;随年龄的增长外周血中线粒体DNA 4 977 bp的缺失未显示出累积现象。

广东地区汉族群体线粒体DNA 9bp序列缺失频率研究

旨在研究中国广东省部分地区汉族人群线粒体DNA Region Ⅴ 9bp序列缺失情况。采用PCR-PAGE和直接测序法对3个群体144份样本mtDNA Region Ⅴ进行序列分析。结果只检测到标准型和短型(即9bp缺失)两种多态。广东汉族人群的平均缺失频率为21.5%,广州、东莞和湛江汉族人群的缺失频率依次为20.8%、19.2%和25.0%。由此得出,广东汉族人群mtDNA9bp缺失频率较高,与其它地区汉族群体存在一定的差异。

电离辐射诱导淋巴细胞线粒体DNA 889bp和3895bp缺失的分析

探索电离辐射是否诱导人淋巴细胞永生化细胞系mtDNA 889bp和3895bp缺失。对指数生长期的人淋巴细胞永生化细胞系照射10Gy ^(60)Coγ射线,照射后24h、48h提取纯线粒体DNA,用巢式巢式聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法进行线粒体DNA 889bp、3895bp缺失分析,与未照射细胞系进行比较;并将纯化的第二轮PCR产物进行测序和核苷酸同源性分析。结果表明,用于分析线粒体DNA 3895bp缺失的引物,可特异性扩增出10Gy照射诱导的淋巴细胞线粒体DNA 3895bp缺失,该扩增产物经纯化、测序证实线粒体缺失发生在线粒体DNA序列的548-4443bp之间。研究发现,用于扩增线粒体DNA 889bp的引物在扩增出目的DNA片段的同时,也可扩增出未发生缺失的DNA片段。第二轮缺失片段扩增产物经纯化、测序证实线粒体缺失发生在线粒体DNA序列的11688-12576bp之间。所有未照射细胞无线粒体DNA 889bp和3895bp的缺失。说明电离辐射可诱导淋巴细胞线粒体DNA 889bp和3895bp的缺失。

老年大鼠大脑皮质、海马和小脑的线粒体DNA缺失突变

目的】测定老年大鼠脑缺失型mtDNA比例,探讨mtDNA缺失与脑衰老的关系,为研究其分子机制提供基础资料。【方法】用碱裂解法抽提青年(3个月)SD大鼠10只和老年(24个月)SD大鼠17只的大鼠皮质、海马和小脑的mtDNA。稀释PCR法测mtDNA的缺失比例。【结果】青年鼠和老年鼠大脑皮质、海马和小脑均存在缺失型mtDNA,缺失片段为4834bp。青年鼠各脑区缺失型mtDNA比例分别为0000156%、0000148%、0000152%;老年鼠上述3个脑区缺失型mtDNA比例分别是0001446%、0001484%、0000987%,是青年鼠的9、10和65倍。【结论】衰老时脑缺失型mtDNA比例增多,以海马的mtDNA缺失增多最为显著。提示mtDNA缺失可能是神经元衰老性退变的主要因素之一。

广西壮、苗族和越南京族人线粒体DNA 9 bp缺失频率的分析

目的探讨广西壮、苗族和越南京族人的mtDNA V区的遗传多态性。方法PCR—PAGE扩增和检测COⅡ与tRNA^Lys基因之间的片段，随机选择部分PCR扩增产物进行测序予以确认。结果在广西壮、苗族和越南京族人样本中只发现标准型和短型两种类型的扩增产物。广西壮、苗族和越南京族人的9bp缺失频率分别为20．83％、33．01％和33．31％。结论来自不同地区种族和人群的9bp缺失频率有所不同。研究结果支持中国南方人群与越南人在遗传上有较为密切的关系。

冠心病心肌线粒体DNA5.0kb缺失的检测

目的探讨冠心病心肌线粒体DNA 5．0kb缺失的检测。方法120例心脏的左、右心室肌各1份，分为正常对照组、病例相关组和病例组，每组40例80个样本。用断裂点连接PCR分别扩增样本含线粒体DNA 5．0kb缺失的片段，巢式PCR检测含5．0kb缺失片段的扩增产物的准确性，半定量PCR对该产物进行定量，聚丙稀酰胺凝胶电泳检测PCR产物。结果在对照片段扩增成功的样本中，正常对照组未检出线粒体DNA 5．0kb缺失；病例相关组检出2例。占6．07％（2／33）；病例组检出29例，占85．29％（29／34）；左、右心室肌线粒体DNA 5．0kb缺失量分别为0．0015％～0．7813％和0．0008％～0．3906％。病例组与其他两组缺失率经χ^2检验，其差异具有极显著性意义（P〈0．001）；左、右心室肌的缺失量经t检验，其差异具有极显著性意义（P〈0．001）。结论冠心病心肌多有线粒体DNA 5．0kb缺失，缺血明显的区域其缺失量也较高。

老年耳聋的线粒体DNA^(4977)缺失研究

目的探讨mtDNA4977缺失与老年耳聋的关系。方法提取老年耳聋组(20例)与老年听力正常组(20例)的外周血DNA,采用聚合酶链反应(polymerase chainreaction,PCR)及巢式PCR技术,扩增正常及缺失区mtDNA片段。结果在6例老年耳聋中检测到了mtDNA4977缺失,而听力正常的老年组中未检测到mtDNA4977缺失。结论mtDNA4977缺失是老年耳聋的发病原因之一。

老年黄斑变性线粒体DNA缺失的初步研究

目的:研究与衰老和氧化磷酸化功能缺陷有关的细胞线粒体DNA(mtDNA)突变,从基因水平探讨老年黄斑变性(ARMD)的发病机理。方法:应用聚合酶链反应(PCR)对20例老年黄斑变性(ARMD)病人之血细胞线粒体DNA(mtDNA)缺失进行了初步研究。结果:有6例湿性ARMD扩增出2条异常DNA片段,提示在mtDNA位点7901～13650之间存在有2种mtDNA缺失,其缺失片段大小分别为5.0kb和5.2kb。另有5例湿性ARMD扩增出1条1.2kb的异常片段,提示在mtDNA位点8531～13400之间还存在1种长度为3.67kb的缺失片段,10例对照均未扩增出异常mtDNA片段。结论:提示在湿性ARMD病人血细胞mtDNA存在有包括与年龄相关的长度为5.0kb在内的多重缺失,mtDNA突变与ARMD发病机制的关系还需进一步深入研究。眼科学报 1997;

广西壮族线粒体DNA9-bp缺失频率的分析

目的:研究广西不同地区壮族的mtDNA Region V区的遗传多态性及其遗传结构的相关性。方法:采用PCR-PAGE和直接测序广西地区壮族样本线粒体DNA Region V区进行序列分析。结果:在广西壮族样本中只发现标准型和短型两种多态。广西壮族的9-bp缺失频率平均为18.94%;其中广西南宁、柳州、百色和河池等地区的壮族9-bp缺失频率分别为22.22%、14.58%、12.50%和22.45%(P>0.05)。结论:来自广西不同地区的壮族人群的9-bp缺失频率虽有所不同,但没有明显差异。

碳离子辐射引起Hela细胞线粒体DNA 4977 bp的缺失

背景:线粒体DNA4977bp缺失的累积对衰老的多细胞动物来说是一个显著的特征,同时也与各种肿瘤细胞的转移和凋亡有关。目前的研究已证明辐射可特异性地诱导此缺失的产生,有望将其作为新的DNA水平的辐射损伤生物剂量标记。目的:用聚合酶链反应方法检测碳离子辐射引起的Hela细胞线粒体DNA4977bp突变缺失,并观察碳离子辐射剂量及辐射时间与线粒体DNA4977bp缺失的相关性。设计、时间及地点:细胞DNA水平的对照实验,于2008-10/11在甘肃省兰州市近代物理研究所完成。材料:人宫颈癌细胞Hela细胞株。方法:Hela细胞经2～8Gy的碳离子辐射后,于2～24h各个时间点分别提取包含线粒体DNA的全基因组DNA,并用聚合酶链反应法扩增线粒体DNA4977bp缺失的特异片段,通过限制反应模板浓度和聚合酶链反应循环数的方法进行定性分析。主要观察指标:碳离子辐射剂量及辐射时间对线粒体DNA4977bp缺失的影响。结果:经2Gy辐照处理的Hela细胞在2,4,8,24h4个时间点的检测中均无聚合酶链反应阳性产物,8Gy辐照处理的Hela细胞在12,16,24h3个时间点可检测到线粒体DNA4977bp缺失,且随时间延长而累积。辐照后12hHela细胞在8Gy辐照处理后可检测到线粒体DNA4977bp缺失,辐照后16和24hHela细胞在6,8Gy辐照处理后可检测到线粒体DNA4977bp缺失。结论:碳离子辐射引起的Hela细胞线粒体DNA4977bp缺失存在剂量相关性,且其累计程度可能与辐射时间有关。