线粒体DNA缺失细胞系的建立

目的 线粒体DNA缺失细胞系的建立和鉴定。方法 利用EB可以插入无核蛋白保护的线粒体DNA分子 层状排列的碱基对之间抑制mtDNA复制的特点,将Lewis肺癌细胞在含有低剂量的EB、丙酮酸钠、尿嘧啶的培养液长期培 养。结果 经EB诱导,可培育出具有嘧啶依赖性的mtDNA缺失细胞系。结论 线粒体DNA缺失细胞系的建立,为进一 步研究线粒体DNA分子的基因及功能提供了条件。

线粒体DNA缺失细胞系对凋亡诱导剂敏感性的研究进展

线粒体DNA（mtDNA）缺失细胞系及其转线粒体细胞系在一些线粒体相关疾病的研究中得到广泛的应用.凋亡是疾病发生发展过程中的重要环节,目前关于mtDNA缺失细胞对凋亡敏感性的研究结果存在较大争议.本文就mtDNA缺失细胞系对各种凋亡诱导剂刺激的敏感性研究进展进行综述.

电离辐射诱导淋巴细胞线粒体DNA 889bp和3895bp缺失的分析

探索电离辐射是否诱导人淋巴细胞永生化细胞系mtDNA 889bp和3895bp缺失。对指数生长期的人淋巴细胞永生化细胞系照射10Gy ^(60)Coγ射线,照射后24h、48h提取纯线粒体DNA,用巢式巢式聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法进行线粒体DNA 889bp、3895bp缺失分析,与未照射细胞系进行比较;并将纯化的第二轮PCR产物进行测序和核苷酸同源性分析。结果表明,用于分析线粒体DNA 3895bp缺失的引物,可特异性扩增出10Gy照射诱导的淋巴细胞线粒体DNA 3895bp缺失,该扩增产物经纯化、测序证实线粒体缺失发生在线粒体DNA序列的548-4443bp之间。研究发现,用于扩增线粒体DNA 889bp的引物在扩增出目的DNA片段的同时,也可扩增出未发生缺失的DNA片段。第二轮缺失片段扩增产物经纯化、测序证实线粒体缺失发生在线粒体DNA序列的11688-12576bp之间。所有未照射细胞无线粒体DNA 889bp和3895bp的缺失。说明电离辐射可诱导淋巴细胞线粒体DNA 889bp和3895bp的缺失。

无线粒体DNA的人肺腺癌A549细胞系的构建

目的:建立无线粒体DNA(mtDNA)的人肺腺癌ρ~0A549细胞系。方法:在含50 ng/mL溴化乙锭(EB)、100μg/mL丙酮酸钠和50μg/mL尿嘧啶核苷的RPMI1640细胞培养基中传代培养A549细胞;用低剂量EB连续诱导培养35 d后,采用光镜观察、TaqMan探针法实时荧光定量PCR(qPCR)和Western印迹鉴定无mtDNA的ρ~0A549细胞系;采用MTT法测定ρ~0A549细胞增殖曲线。结果:倒置显微镜下野生型ρ^+A549细胞为多角形,ρ~0A549细胞形态呈拉长枝状;qPCR结果显示,低剂量EB诱导35 d的ρ~0A549细胞中无mtDNA的存在。Western印迹结果显示,ρ^+A549细胞中能表达核基因编码的线粒体蛋白SDHA和ATP5A,也能表达线粒体基因组编码的蛋白MT-COXI和MT-ATP6;ρ~0A549细胞中无MT-COXI和MT-ATP6蛋白表达,但核基因编码的SDHA和ATP5A蛋白能够正常表达。MTT结果显示,与ρ^+A549细胞相比,ρ~0A549细胞生长速度明显减慢,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:构建和鉴定了无mtDNA的人肺腺癌ρ~0A549细胞系,为后续探讨mtDNA缺失或突变与人肺腺癌发生之间的关系奠定了实验基础。

胃癌细胞系和胃癌组织中线粒体DNA 4977 bp缺失及其生物学意义

目的 明确线粒体DNA 4 977bp大片段缺失在胃癌细胞系、胃癌组织及胃癌患者血清中的频率 ,为胃癌的早期临床诊断寻找简便准确的分子标记。方法 运用Primer shiftPCR和直接测序的方法对 13个胃癌细胞系、5 2对胃癌组织及对应的癌旁正常组织 (年龄从 2 8～ 78岁 )、4 0例胃癌患者血清及 4 0名正常人血清进行筛查。取 10例胃癌组织的石蜡切片 ,采用显微切割技术在同一患者的切片上同时分离 3种组织 (包括胃粘膜正常腺体、肠化上皮及胃癌组织 )对mtDNA 4 977bp缺失进行了分析比较。结果 在 13个胃癌细胞系中 12个有mtDNA 4 977bp缺失 (缺失率为 92 3% ) ,5 2例胃癌组织中 38例有缺失 (缺失率为 73 1% ) ,5 2例癌旁正常组织中 2 7例有缺失 (缺失率为 5 2 % ) ,4 0名胃癌患者血清中 17例有缺失 (缺失率为 4 2 5 % ) ,4 0名正常人血清中 8例有缺失 (缺失率为2 0 % )。胃癌组织和癌旁正常组织mtDNA 4 977bp缺失差异有显著意义 ,癌组织mtDNA4 977bp缺失率与胃癌的分型和患者的性别没有关联。胃癌患者血清与正常人血清mtDNA 4 977bp缺失差异也有显著意义。 10例显微切割组织中 2例肠化上皮及胃癌组织中有缺失 ,而胃粘膜正常腺体未见缺失。结论 线粒体DNA 4 977bp大片段缺失可能在胃癌发生和胃粘膜病变演化及?

MtDNA缺失的人肺癌ρ~0 A549细胞系构建

目的诱导建立线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)缺失的肺癌A549细胞系(ρ0A549)以探究mtDNA与肿瘤发生和治疗敏感性的关系。方法将A549细胞培养于含50ng/ml溴化乙锭(ethidium bromide,EB)、100μg/ml丙酮酸钠和50μg/ml尿嘧啶1640细胞培养液中传代培养,利用光镜、电镜和PCR方法鉴定ρ0A549细胞系构建的真实性。结果 RT-PCR结果显示,未经EB等处理的A549细胞可同时扩增出定位于mtDNA的1528bp片段和位于核DNA上的18SrDNA的559bp片段,而经EB等处理后的A549细胞RNA反转录只能扩增出定位于mtDNA的1528bp片段。光镜下,ρ0A549细胞形态呈成拉长枝状,明显不同于EB未处理A549细胞的多角形状。ρ0A549细胞传代时间为5d。在诱导成功后继续传代约20代时,细胞生长开始出现迟滞,传代时间大于7d。结论成功建立缺乏mtDNA的人肺癌ρ0A549细胞系,为进一步研究线粒体和mtDNA与肿瘤发生之间的关系提供了方法。

线粒体DNA数目不同的人角质形成细胞模型的建立

该研究采用溴化乙锭(ethidium bromide,Et Br)对人永生化角质形成细胞(HaCaT)进行诱导,采用RT-PCR法、MTT法和健那绿染色技术联合鉴定Et Br对HaCaT细胞线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)拷贝数的影响,建立不同mt DNA拷贝数目的HaCaT细胞模型。结果显示,HaCaT细胞经100 ng/m L和50 ng/m L Et Br分别处理10 d后,细胞形态随着处理时间的延长发生改变,由规则铺路石形状逐渐变圆,某些细胞体积变小,成团生长,细胞膜边缘不光滑,且随着mt DNA数目的减少,细胞增殖速率明显下降。RT-PCR分析结果显示,与对照组相比,50 ng/m L和100 ng/m L Et Br处理10 d的HaCaT细胞中,mt DNA的拷贝数分别减少了52.9%和97.6%[以线粒体DNA脱氢酶1(mitochondrial NADH dehydrogenase 1 gene,ND1)与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的比值来表示mt DNA的相对拷贝数变化情况]。健那绿染色显示,对照组HaCaT细胞中可见分散存在的蓝绿色线粒体颗粒,100 ng/m L Et Br处理10 d后的HaCaT细胞中,显微镜下蓝绿色线粒体颗粒明显减少。综上所述,该研究证明了HaCaT细胞可通过Et Br诱导被成功培养成ρ–细胞,且Et Br浓度与HaCaT细胞mt DNA拷贝数的变化在一定的范围内存在着剂量–效应关系。

溴化乙锭诱导无线粒体DNA宫颈癌HeLa细胞系的构建和鉴定

[目的]构建和鉴定由溴化乙锭(EB)诱导的无线粒体DNA(mtDNA)宫颈癌ρ~0HeLa细胞系,探讨mtDNA与宫颈癌发生的关系。[方法]采用含50ng/ml溴化乙锭、100μg/ml丙酮酸钠和50μg/ml尿嘧啶核苷的高糖DMEM完全培养基中传代培养HeLa细胞。低剂量EB连续诱导60d后,采用营养缺陷鉴定、PCR和WesternBlot鉴定无mtDNA的ρ~0HeLa细胞系;采用透射电子显微镜观察ρ~0HeLa细胞内线粒体形态变化;采用CCK8法测定ρ~0HeLa细胞增殖曲线。[结果]经溴化乙锭诱导60d,可以培养出具有尿嘧啶核苷依赖性的无mtDNA宫颈癌HeLa细胞系。普通PCR和qPCR结果均显示,低剂量EB诱导60d的ρ~0HeLa细胞中mtDNA完全缺失。WesternBlot结果显示,HeLa细胞中能表达核编码的NDUFA9蛋白,也能表达线粒体编码MT-ND1蛋白。而ρ~0HeLa细胞中已无MT-ND1蛋白表达,但核编码的NDUFA9蛋白能够正常表达。透射电子显微镜观察显示,ρ~0HeLa细胞内部分出现空泡改变,线粒体嵴被破坏。CCK8细胞增殖实验结果显示,ρ~0HeLa细胞系生长速度显著低于正常HeLa细胞系,且差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]无mtDNA的宫颈癌HeLa细胞系的建立,为后续研究mtDNA突变和线粒体功能在宫颈癌发生发展中的作用及机制奠定了基础。