盆腔器官脱垂患者子宫骶韧带线粒体DNA^(4977)缺失及其生物学意义

目的通过研究线粒体DNA^4977缺失在盆腔器官脱垂(pelvic organ prolapse,POP)患者子宫骶韧带中的变化,初步探讨POP可能的发生机制。方法取2016年9月～2017年4月我科因POPⅡ～Ⅳ期切除子宫26例为研究组,同期因良性疾病切除子宫的非POP患者21例为对照组,取子宫骶韧带组织,提取其中的线粒体DNA,应用荧光定量PCR方法检测线粒体DNA和DNA^4977缺失的相对含量,应用琼脂糖凝胶电泳方法对PCR产物进行比对分析。结果①研究组子宫骶韧带组织中线粒体DNA^4977缺失明显高于对照组,差异有统计学意义(Z=-2. 086,P=0. 037);而2组总线粒体DNA含量无明显差异(P=0. 447)。②研究组线粒体DNA^4977缺失与年龄、孕次、产次、BMI、初产年龄、绝经年龄均无明显相关性(P>0.05);对照组患者线粒体DNA^4977缺失与年龄有明显相关性,随着年龄的增加,线粒体DNA4977缺失增多(r=0. 465,P=0. 034),而与孕次、产次、BMI、初产年龄、绝经年龄无明显相关性(P>0.05)。结论子宫骶韧带线粒体DNA^4977缺失在POP患者中显著增加,可能是导致POP的原因之一。

人听觉器官线粒体DNA^(4977)缺失与老年聋的关系

目的 探讨mtDNA4 977缺失与老年聋的关系。方法 采用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)及套式PCR技术 ,扩增正常及缺失区mtDNA片段 ,pGEM TEasy载体连接扩增产物 ,重组、克隆目的DNA进行序列分析。检测 6 7耳 (4 1例 )颞骨切片、2 1例蜗核 (双侧 )、2 0例颞叶脑组织、2 0例心肌和 2 2例肝脏组织中mtDNA4 977缺失的发生率 ,根据患者生前的临床资料分为老年组与非老年组、老年聋组与老年听力正常组进行比较分析。结果 被检所有标本均成功扩增到正常mtDNA编码tRNA和ND1片段的NADH基因。在老年人多种组织中检测到了mtDNA4 977缺失 ,老年组不同器官组织中mtDNA4 977缺失发生率均明显高于非老年组 ,两组之间的差异具有显著性意义 (χ2 检验 ,P <0 0 5 )。老年聋患者颞骨切片和蜗核组织中mtDNA4 977缺失的发生率明显高于老年听力正常组 ,其差异具有显著性意义 (χ2 检验 ,P <0 .0 5 ) ;而与听觉无关的心肌和肝脏组织中mtDNA4 977缺失发生率在两组之间差异无显著性。结论 mtDNA4 977缺失的发生与老化有关 ;内耳和蜗核组织中mtDNA4 977缺失与老年聋的发生有关。

转化生长因子β1对长波紫外线照射皮肤成纤维细胞线粒体DNA 4977 bp缺失的影响

背景:长波紫外线与人体皮肤光老化关系密切,线粒体的损伤是细胞衰老和死亡的分子基础。目的:观察长波紫外线照射对体外培养的皮肤成纤维细胞的线粒体脱氧核糖核酸缺失损伤的影响,以及转化生长因子β1对长波紫外线引起的线粒体DNA缺失有无保护作用。为皮肤光老化研究提供实验依据。设计、时间及地点:实验于2007-03/2008-04于解放军第四军医大学西京医院全军整形外科研究所完成。材料:转化生长因子β1为PerProtech公司产品;线粒体DNA 4977 bp引物由上海生工合成;长波紫外线光源为北京光学仪器厂生产;紫外线辐照计为北京师范大学光电仪器厂生产。方法:收集20～23岁成年男性包皮环切术后的皮肤组织12例,体外培养成纤维细胞。将细胞分组为对照组、长波紫外线累计照射达到30,60,90J/cm2组,半定量PCR检测DNA 4977 bp缺失情况。不同质量浓度转化生长因子β1(0.1,1,10μg/L)干预长波紫外线累积照射达90J/cm2的皮肤成纤维细胞。主要观察指标:观察不同累积照射剂量产生的DNA 4977 bp缺失;观察累积照射剂量90J/cm2后不同浓度转化生长因子干预对DNA 4977 bp缺失的影响。结果:体外培养的皮肤成纤维细胞经长波紫外线照射,长波紫外线累积剂量为长波紫外线60J/cm2后发生线粒体DNA 4977 bp缺失,长波紫外线90J/cm2时缺失加重。吸光度值和PCR产物电泳及条带密度扫描结果显示,在照射前2h加入不同剂量转化生长因子处理后,大剂量组(10μg/L)线粒体DNA表达降低,中、小剂量组与长波紫外线照射组比较,差异无显著性意义。结论:一定剂量(10μg/L)转化生长因子对体外培养的成纤维细胞线粒体DNA缺失起到保护作用。

实时定量PCR分析健康人外周血线粒体DNA 4977 bp缺失

目的:用实时定量PCR方法分析健康人外周血线粒体DNA4 977 bp的缺失情况。方法:收集27例年龄在17～44岁的健康人外周血,用荧光实时定量PCR方法对每个样品同时检测线粒体DNA 4 977 bp缺失的量和无4 977 bp缺失的量,进行定量分析。结果:在27例健康人外周血样品中,线粒体DNA4 977 bp缺失的阳性率为70.37%(19/27);19例有线粒体DNA4 977 bp缺失的样品,其扩增产物的CT值在第35个循环到第39个循环之间;无线粒体DNA 4 977 bp缺失的扩增产物的CT值在第15个循环到第21个循环之间;不同年龄组间线粒体DNA 4 977 bp缺失和无线粒体DNA4 977 bp缺失的量均无统计学差异。结论:本文中超过2/3的健康人外周血含有线粒体DNA 4 977 bp的缺失;在有该缺失的样品中大约每106～107拷贝中携带有一个线粒体DNA4 977 bp缺失;随年龄的增长外周血中线粒体DNA 4 977 bp的缺失未显示出累积现象。

用人外周血线粒体DNA 4977bp缺失检测辐射损伤初探

初步探索用聚合酶链反应(PCR)方法进行辐射诱导的线粒体DNA4977bp缺失分析的可行性。对正常人外周血进行2GyCoγ射线的照射,照射后提取包含线粒体DNA的全基因组DNA,用PCR方法进行线粒60体DNA4977bp缺失分析,同时扩增很少缺失的线粒体DNA片段(16S?ND1);进而比较照射前后线粒体DNA4977bp缺失水平。结果表明,用于分析线粒体DNA4977bp缺失的引物对在最佳试验条件下,可特异性扩增出所有2Gy照射诱导的线粒体DNA4977bp缺失;该扩增产物经纯化、测序和核苷酸同源性分析,证实线粒体缺失发生在线粒体DNA序列的8470?13446bp。用于扩增16S?ND1的引物对在很大的温度变动范围内,均能扩出目的DNA片段。所有外周血样品在照射前无线粒体DNA4977bp缺失,2Gy60Coγ射线照射后特异诱导出此缺失。说明用本研究中建立的PCR方法,可用来分析电离辐射诱导的外周血有核细胞线粒体DNA4977bp缺失水平。

老年耳聋的线粒体DNA^(4977)缺失研究

目的探讨mtDNA4977缺失与老年耳聋的关系。方法提取老年耳聋组(20例)与老年听力正常组(20例)的外周血DNA,采用聚合酶链反应(polymerase chainreaction,PCR)及巢式PCR技术,扩增正常及缺失区mtDNA片段。结果在6例老年耳聋中检测到了mtDNA4977缺失,而听力正常的老年组中未检测到mtDNA4977缺失。结论mtDNA4977缺失是老年耳聋的发病原因之一。

碳离子辐射引起Hela细胞线粒体DNA 4977 bp的缺失

背景:线粒体DNA4977bp缺失的累积对衰老的多细胞动物来说是一个显著的特征,同时也与各种肿瘤细胞的转移和凋亡有关。目前的研究已证明辐射可特异性地诱导此缺失的产生,有望将其作为新的DNA水平的辐射损伤生物剂量标记。目的:用聚合酶链反应方法检测碳离子辐射引起的Hela细胞线粒体DNA4977bp突变缺失,并观察碳离子辐射剂量及辐射时间与线粒体DNA4977bp缺失的相关性。设计、时间及地点:细胞DNA水平的对照实验,于2008-10/11在甘肃省兰州市近代物理研究所完成。材料:人宫颈癌细胞Hela细胞株。方法:Hela细胞经2～8Gy的碳离子辐射后,于2～24h各个时间点分别提取包含线粒体DNA的全基因组DNA,并用聚合酶链反应法扩增线粒体DNA4977bp缺失的特异片段,通过限制反应模板浓度和聚合酶链反应循环数的方法进行定性分析。主要观察指标:碳离子辐射剂量及辐射时间对线粒体DNA4977bp缺失的影响。结果:经2Gy辐照处理的Hela细胞在2,4,8,24h4个时间点的检测中均无聚合酶链反应阳性产物,8Gy辐照处理的Hela细胞在12,16,24h3个时间点可检测到线粒体DNA4977bp缺失,且随时间延长而累积。辐照后12hHela细胞在8Gy辐照处理后可检测到线粒体DNA4977bp缺失,辐照后16和24hHela细胞在6,8Gy辐照处理后可检测到线粒体DNA4977bp缺失。结论:碳离子辐射引起的Hela细胞线粒体DNA4977bp缺失存在剂量相关性,且其累计程度可能与辐射时间有关。

血细胞线粒体DNA 4977缺失与年龄的相关性

目的检测不同年龄组人活体血细胞线粒体DNA4977碱基缺失情况及其与年龄的相关性。方法根据Anderson标准序列设计mtDNA恒定区和mtDNA4977特异缺失区引物,采用实时荧光定量PCR技术,对110份不同年龄组人活体血细胞mtDNA4977缺失水平进行检测。结果在23岁以下个体中未检出mtDNA4977缺失,在大于23岁的被检个体中检测到mtDNA4977缺失,年龄越大,越容易检测到缺失。结论人mtDNA4977缺失与年龄有一定的相关性。

人骨骼肌线粒体DNA 4977片段缺失与年龄的相关性调查

目的探讨人骨骼肌组织中线粒体DNA 4977bp片段的缺失情况及其与年龄的相关性。方法收集105例不同年龄死者的骨骼肌组织,抽提mtDNA,通过PCR、琼脂糖紫外凝胶成像等技术,测定不同年龄组线粒体DNA 4977bp片段的缺失情况。结果在105例样品中,不同年龄组(0～9、10～19、20～29、30～39、40～49、50～59、60～69、70～79、80～89、90～99岁)mtDNA4977片段缺失的频率分别为:0、0、0.003%、0.011%、0.015%、0.033%、0.038%、0.062%、0.069%、0.091%。结论人骨骼肌线粒体DNA 4977bp片段的缺失频率随着年龄的增长而增高,各年龄组之间具有显著差异(P<0.01)。该缺失片段的检测对于软组织年龄推测具有一定指导意义。

PUVA治疗诱导皮肤线粒体DNA 4977 bp缺失突变累积的研究

为探讨线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)4977bp缺失突变与皮肤光老化之间的关系,采用三条引物PCR的方法检测长波紫外线光化学疗法(PUVA)治疗的银屑病患者背部非皮损区皮肤mtDNA4977bp缺失突变的累积。结果发现,在PUVA治疗期间3～21天、治疗后1～6个月和治疗后6个月以上的各组活检标本中,发生4977bp缺失突变的mtDNA占总mtDNA比例分别为0.06,0.12和0.19,和未经PUVA治疗的对照组比较均有显著性差异(P<0.01)。表明线粒体DNA4977bp缺失突变累积与皮肤光老化密切相关,可能作为衡量皮肤紫外线损伤程度的分子生物学标志。

弱精子症病人精子线粒体DNA4977-bp缺失研究

本文采用聚合酶链反应（ＰＣＲ） 技术对４１ 例标本，其中２０ 例弱精子症病人和２１ 例精子活力正常人进行了精子线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）缺失的研究。结果发现２０ 例弱精子症病人中１８ 例有缺失，而２１ 例精子活力正常人中仅有两例有缺失。说明线粒体ＤＮＡ４９７７ｂｐ 缺失在弱精子症的发病中起重要作用。

X射线致人外周血线粒体DNA 4977bp缺失的时效关系研究

采集2名25岁健康男性外周血进行不同剂量(0～10 Gy)单次X射线照射,于照后取不同时间点(2、12、24、48和72 h)培养的细胞提取基因组DNA,利用实时定量PCR检测不同时间点线粒体DNA(mtDNA)4977bp缺失情况,探讨X射线致人外周血mtDNA 4977bp缺失的时间效应关系。结果表明,受照剂量为5 Gy时,随着照射后培养时间的增加,mtDNA 4977bp缺失拷贝数、mtDNA总拷贝数和mtDNA 4977bp缺失率均有增加趋势。培养时间为24 h和72 h时,在0～10 Gy剂量范围内mtDNA 4977bp缺失拷贝数、mtDNA总拷贝数和mtDNA 4977bp缺失率随着受照剂量的增加而增加。提示X射线诱发的mtDNA 4977bp缺失和mtDNA总拷贝数具有时间和剂量累积性。

精子线粒体DNA 4977bp片段缺失与男性不育相关性研究

目的:探讨精子线粒体DNA(mtDNA)4 977bp片段缺失与男性不育的相关性。方法:采用聚合酶链反应(PCR)技术对200例标本进行了精子mtDNA 4 977bp片段缺失的研究,其中精子活力正常标本(对照组)和弱精子症患者(观察组)各100例。结果:弱精子症患者中精子mtDNA 4 977bp片段缺失率为64%,正常对照组mtDNA 4 977bp片段缺失率为6%,两组差异具有明显统计学意义(P<0.01)。结论:精子mtDNA 4 977bp片段缺失与弱精症以及男性不育方面有一定的相关性。

人卵母细胞和胚胎线粒体DNA缺失的研究

目的:检测人类卵子和胚胎线粒体DNA(mtDNA)4977bp缺失,并探讨这种缺失存在的病理生理学意义。方法:收集不受精的成熟卵母细胞和不适合移植及冷冻保存的胚胎;碱裂解法制备单个细胞DNA;单细胞巢式PCR检测人卵母细胞和胚胎mtDNA4977bp缺失情况。结果:122个卵母细胞中,56个(45.9%)发现有4977bp缺失;90个胚胎中,21个(23.3%)发现有缺失,二者间差异有显著性意义。将卵母细胞和胚胎分别按患者的年龄分为<30岁组、30-34岁组和>34岁组,卵母细胞缺失率分别为:43.6%、44.4%和51.7%,各组间差异无显著性意义;各组胚胎的缺失率分别为21.4%、20.0%和29.6%,差异亦无显著性意义。将卵母细胞和胚胎分别按患者是否妊娠分组,结果发现妊娠组与非妊娠组间mtDNA缺失率的差异也无显著性意义。结论:mtDNA4977bp缺失与受精失败有关,其是否参与卵子老化及其机制有待进一步研究。

维生素E和辅酶Q10对大鼠内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变的预防作用

目的 研究维生素E、辅酶Q10对大鼠线粒体DNA 4 834缺失突变的预防作用。方法Wistar大鼠 4 6只 ,采用抽笼法随机分为 3组 ,实验组 (A组 ,18只 )阿霉素 1mg/kg腹腔注射 ,每周 2次 ,共 3个月 ,同时给予维生素E 5 0mg/kg和辅酶Q10 10mg/kg灌胃 ,每天 1次 ;生理盐水对照组 (B组 ,18只 )在给予阿霉素的同时予以生理盐水灌胃 ;空白对照组 (C组 ,10只 )仅给予生理盐水灌胃。提取内耳组织总DNA ,利用巢氏聚合酶链反应技术检测内耳组织线粒体DNA 4 834bp缺失突变的发生情况 ,并检测血清中谷胱甘肽过氧化物酶活性的变化。结果 A组大鼠线粒体DNA 4 834bp缺失突变发生率为 2 3 0 8% (3/ 13) ,B组为 6 8 75 % (11/ 16 ) ,C组为 0 (0 / 8) ,经Fisher′s精确概率检验 ,单侧检验 ,A组和B组之间差异有显著性 (P =0 0 18) ,A组和C组之间差异无显著性 (P =0 2 15 )。A组血清谷胱甘肽过氧化物酶活性较B组高 ,差异有显著性 (校正t′检验 ,单侧检验 ,t′=6 4 74 ,P <0 0 1) ;A组和C组之间差异无显著性 (校正t′检验 ,双侧检验 ,t′ =1 92 0 ,P >0 0 5 )。结论 维生素E和辅酶Q10具有增加机体对自由基的清除能力 ,保护内耳组织线粒体DNA ,降低 4 834bp缺失突变发生率的作用。

线粒体基因组4977bp异质性缺失与高原肺水肿易感性无关

目的研究线粒体基因组4 977 bp大片段异质性缺失与高原肺水肿(high altitude pulmonary edema,HAPE)易感性的关系。方法选择本室收集的HAPE标本36例及与其匹配的健康对照标本36例,采用定量PCR(SYBR)的方法研究线粒体基因组4 977 bp大片段异质性缺失与高原肺水肿易感性的关系。结果在高原肺水肿的病例组及对照组中均没有发现4 977 bp异质性缺失。结论线粒体基因组4 977 bp异质性缺失与高原肺水肿易感性无关。

线粒体DNA缺失细胞系的建立

目的 线粒体DNA缺失细胞系的建立和鉴定。方法 利用EB可以插入无核蛋白保护的线粒体DNA分子 层状排列的碱基对之间抑制mtDNA复制的特点,将Lewis肺癌细胞在含有低剂量的EB、丙酮酸钠、尿嘧啶的培养液长期培 养。结果 经EB诱导,可培育出具有嘧啶依赖性的mtDNA缺失细胞系。结论 线粒体DNA缺失细胞系的建立,为进一 步研究线粒体DNA分子的基因及功能提供了条件。

线粒体DNA缺失对人淋巴瘤Namalwa细胞生长和侵袭能力的影响

目的探讨线粒体DNA(mtDNA)缺失对人淋巴瘤Namalwa细胞生长和迁移能力的影响。方法采用溴化乙锭处理Namalwa细胞获得mtDNA缺失的ρ0-Namalwa细胞;营养缺陷法、PCR扩增线粒体DNA片段、Western bloting检测COXII蛋白表达等方法鉴定ρ0-Namalwa细胞;MTT方法及细胞周期测定细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力;流式细胞术检测活性氧(ROS)及细胞内钙离子水平。结果ρ0-Namalwa细胞在选择性培养基中正常生长,而在非选择性培养基中逐渐死亡;ρ0-Namalwa细胞未扩增出mtDNA片段以及未表达COXII蛋白;与Namalwa细胞相比,ρ0-Namalwa的细胞增殖率、迁移及侵袭能力、ROS水平及细胞内Ca2+浓度明显降低,细胞阻滞于G0/G1期。结论ρ0-Namalwa细胞与亲本Namalwa细胞相比,生长及迁移能力减弱,可能与细胞内ROS产生减少及细胞内Ca2+浓度降低有关。

老年学习记忆减退大鼠脑线粒体DNA缺失

目的和方法 :测定老年大鼠脑mtDNA缺失型 (以下简称缺失型 ) ,缺失mtDNA比例 ,探讨mtDNA缺失与老年性学习记忆减退的关系 ,为研究其分子机制提供基础资料。用Morris水迷宫将老年大鼠 (2 4个月 )筛选为老年学习记忆正常和学习记忆减退两组。用稀释PCR法测定大鼠大脑皮质、海马和小脑缺失型mtDNA比例。结果 :青老年鼠大脑皮质、海马和小脑均存在mtDNA缺失 ,片段为 4834bp ;青年鼠的缺失比例约为0 0 0 0 18%。老年记忆正常鼠上述 3个脑区缺失型mtDNA缺失比例分别是青年鼠的 6倍、6倍和 2倍 ;老年记忆减退大鼠上述脑区的缺失型mtDNA比例分别是老年记忆正常鼠的 2倍、1 8倍和 3倍。结论 :衰老时脑组织缺失型mtDNA增多 ,而老年学习记忆减退鼠较老年学习记忆正常鼠mtDNA缺失进一步成倍增加 ,表明相关脑区的mtDNA缺失在老年学习记忆减退的细胞分子机制中发挥重要作用。

有氧运动训练对增龄小鼠线粒体DNA缺失的影响

应用PCR技术 ,检测小鼠心肌、骨骼肌、肝脏、肾脏和大脑等组织mtDNA的缺失 ,探讨衰老及有氧运动训练延缓衰老的可能机制。结果发现 ,老年小鼠各组织mtDNA 3 866bp片段缺失发生率高于青年鼠。在所测的五种组织中肝脏mtDNA的缺失比例最低 ,大脑最高 ,说明衰老线粒体的功能下降是多系统的 ,但程度表现不均衡。长期有氧运动训练可显著减少 3 866bp片段缺失在心肌及骨骼肌中的积累 ,但肾脏mtDNA片段缺失有增多趋势 ,提示运动训练可能通过提高机体心肌、骨骼肌抗氧化应激能力 ,降低自由基影响 ,进而保护mtDNA。