转化生长因子β1对长波紫外线照射皮肤成纤维细胞线粒体DNA 4977 bp缺失的影响

背景:长波紫外线与人体皮肤光老化关系密切,线粒体的损伤是细胞衰老和死亡的分子基础。目的:观察长波紫外线照射对体外培养的皮肤成纤维细胞的线粒体脱氧核糖核酸缺失损伤的影响,以及转化生长因子β1对长波紫外线引起的线粒体DNA缺失有无保护作用。为皮肤光老化研究提供实验依据。设计、时间及地点:实验于2007-03/2008-04于解放军第四军医大学西京医院全军整形外科研究所完成。材料:转化生长因子β1为PerProtech公司产品;线粒体DNA 4977 bp引物由上海生工合成;长波紫外线光源为北京光学仪器厂生产;紫外线辐照计为北京师范大学光电仪器厂生产。方法:收集20～23岁成年男性包皮环切术后的皮肤组织12例,体外培养成纤维细胞。将细胞分组为对照组、长波紫外线累计照射达到30,60,90J/cm2组,半定量PCR检测DNA 4977 bp缺失情况。不同质量浓度转化生长因子β1(0.1,1,10μg/L)干预长波紫外线累积照射达90J/cm2的皮肤成纤维细胞。主要观察指标:观察不同累积照射剂量产生的DNA 4977 bp缺失;观察累积照射剂量90J/cm2后不同浓度转化生长因子干预对DNA 4977 bp缺失的影响。结果:体外培养的皮肤成纤维细胞经长波紫外线照射,长波紫外线累积剂量为长波紫外线60J/cm2后发生线粒体DNA 4977 bp缺失,长波紫外线90J/cm2时缺失加重。吸光度值和PCR产物电泳及条带密度扫描结果显示,在照射前2h加入不同剂量转化生长因子处理后,大剂量组(10μg/L)线粒体DNA表达降低,中、小剂量组与长波紫外线照射组比较,差异无显著性意义。结论:一定剂量(10μg/L)转化生长因子对体外培养的成纤维细胞线粒体DNA缺失起到保护作用。

健康人周围全血线粒体DNA4977bp缺失的实时定量聚合酶链反应检测

目的了解健康人周围全血线粒体DNA(mtDNA)4977bp缺失(ΔmtDNA4977)情况。方法采集60名年龄20～80岁的健康人周围血,用实时定量聚合酶链反应(PCR)方法检测ΔmtDNA4977和总mtDNA(mtDNAtotal)的量并进行分析。结果在60名健康人周围血样品中,ΔmtDNA4977的检出率为45%(27/60),ΔmtDNA4977率在0%～3.076×10-5%,年龄和性别不影响ΔmtDNA4977水平(P>0.05)。结论在健康人周围血中,ΔmtDNA4977水平较低,且未显示出年龄依赖性累积现象。

实时定量PCR分析健康人外周血线粒体DNA 4977 bp缺失

目的:用实时定量PCR方法分析健康人外周血线粒体DNA4 977 bp的缺失情况。方法:收集27例年龄在17～44岁的健康人外周血,用荧光实时定量PCR方法对每个样品同时检测线粒体DNA 4 977 bp缺失的量和无4 977 bp缺失的量,进行定量分析。结果:在27例健康人外周血样品中,线粒体DNA4 977 bp缺失的阳性率为70.37%(19/27);19例有线粒体DNA4 977 bp缺失的样品,其扩增产物的CT值在第35个循环到第39个循环之间;无线粒体DNA 4 977 bp缺失的扩增产物的CT值在第15个循环到第21个循环之间;不同年龄组间线粒体DNA 4 977 bp缺失和无线粒体DNA4 977 bp缺失的量均无统计学差异。结论:本文中超过2/3的健康人外周血含有线粒体DNA 4 977 bp的缺失;在有该缺失的样品中大约每106～107拷贝中携带有一个线粒体DNA4 977 bp缺失;随年龄的增长外周血中线粒体DNA 4 977 bp的缺失未显示出累积现象。

碳离子辐射引起Hela细胞线粒体DNA 4977 bp的缺失

背景:线粒体DNA4977bp缺失的累积对衰老的多细胞动物来说是一个显著的特征,同时也与各种肿瘤细胞的转移和凋亡有关。目前的研究已证明辐射可特异性地诱导此缺失的产生,有望将其作为新的DNA水平的辐射损伤生物剂量标记。目的:用聚合酶链反应方法检测碳离子辐射引起的Hela细胞线粒体DNA4977bp突变缺失,并观察碳离子辐射剂量及辐射时间与线粒体DNA4977bp缺失的相关性。设计、时间及地点:细胞DNA水平的对照实验,于2008-10/11在甘肃省兰州市近代物理研究所完成。材料:人宫颈癌细胞Hela细胞株。方法:Hela细胞经2～8Gy的碳离子辐射后,于2～24h各个时间点分别提取包含线粒体DNA的全基因组DNA,并用聚合酶链反应法扩增线粒体DNA4977bp缺失的特异片段,通过限制反应模板浓度和聚合酶链反应循环数的方法进行定性分析。主要观察指标:碳离子辐射剂量及辐射时间对线粒体DNA4977bp缺失的影响。结果:经2Gy辐照处理的Hela细胞在2,4,8,24h4个时间点的检测中均无聚合酶链反应阳性产物,8Gy辐照处理的Hela细胞在12,16,24h3个时间点可检测到线粒体DNA4977bp缺失,且随时间延长而累积。辐照后12hHela细胞在8Gy辐照处理后可检测到线粒体DNA4977bp缺失,辐照后16和24hHela细胞在6,8Gy辐照处理后可检测到线粒体DNA4977bp缺失。结论:碳离子辐射引起的Hela细胞线粒体DNA4977bp缺失存在剂量相关性,且其累计程度可能与辐射时间有关。

PUVA治疗诱导皮肤线粒体DNA 4977 bp缺失突变累积的研究

为探讨线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)4977bp缺失突变与皮肤光老化之间的关系,采用三条引物PCR的方法检测长波紫外线光化学疗法(PUVA)治疗的银屑病患者背部非皮损区皮肤mtDNA4977bp缺失突变的累积。结果发现,在PUVA治疗期间3～21天、治疗后1～6个月和治疗后6个月以上的各组活检标本中,发生4977bp缺失突变的mtDNA占总mtDNA比例分别为0.06,0.12和0.19,和未经PUVA治疗的对照组比较均有显著性差异(P<0.01)。表明线粒体DNA4977bp缺失突变累积与皮肤光老化密切相关,可能作为衡量皮肤紫外线损伤程度的分子生物学标志。

弱精子症病人精子线粒体DNA4977-bp缺失研究

本文采用聚合酶链反应（ＰＣＲ） 技术对４１ 例标本，其中２０ 例弱精子症病人和２１ 例精子活力正常人进行了精子线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）缺失的研究。结果发现２０ 例弱精子症病人中１８ 例有缺失，而２１ 例精子活力正常人中仅有两例有缺失。说明线粒体ＤＮＡ４９７７ｂｐ 缺失在弱精子症的发病中起重要作用。

X射线致人外周血线粒体DNA 4977bp缺失的时效关系研究

采集2名25岁健康男性外周血进行不同剂量(0～10 Gy)单次X射线照射,于照后取不同时间点(2、12、24、48和72 h)培养的细胞提取基因组DNA,利用实时定量PCR检测不同时间点线粒体DNA(mtDNA)4977bp缺失情况,探讨X射线致人外周血mtDNA 4977bp缺失的时间效应关系。结果表明,受照剂量为5 Gy时,随着照射后培养时间的增加,mtDNA 4977bp缺失拷贝数、mtDNA总拷贝数和mtDNA 4977bp缺失率均有增加趋势。培养时间为24 h和72 h时,在0～10 Gy剂量范围内mtDNA 4977bp缺失拷贝数、mtDNA总拷贝数和mtDNA 4977bp缺失率随着受照剂量的增加而增加。提示X射线诱发的mtDNA 4977bp缺失和mtDNA总拷贝数具有时间和剂量累积性。

维生素E和辅酶Q10对大鼠内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变的预防作用

目的 研究维生素E、辅酶Q10对大鼠线粒体DNA 4 834缺失突变的预防作用。方法Wistar大鼠 4 6只 ,采用抽笼法随机分为 3组 ,实验组 (A组 ,18只 )阿霉素 1mg/kg腹腔注射 ,每周 2次 ,共 3个月 ,同时给予维生素E 5 0mg/kg和辅酶Q10 10mg/kg灌胃 ,每天 1次 ;生理盐水对照组 (B组 ,18只 )在给予阿霉素的同时予以生理盐水灌胃 ;空白对照组 (C组 ,10只 )仅给予生理盐水灌胃。提取内耳组织总DNA ,利用巢氏聚合酶链反应技术检测内耳组织线粒体DNA 4 834bp缺失突变的发生情况 ,并检测血清中谷胱甘肽过氧化物酶活性的变化。结果 A组大鼠线粒体DNA 4 834bp缺失突变发生率为 2 3 0 8% (3/ 13) ,B组为 6 8 75 % (11/ 16 ) ,C组为 0 (0 / 8) ,经Fisher′s精确概率检验 ,单侧检验 ,A组和B组之间差异有显著性 (P =0 0 18) ,A组和C组之间差异无显著性 (P =0 2 15 )。A组血清谷胱甘肽过氧化物酶活性较B组高 ,差异有显著性 (校正t′检验 ,单侧检验 ,t′=6 4 74 ,P <0 0 1) ;A组和C组之间差异无显著性 (校正t′检验 ,双侧检验 ,t′ =1 92 0 ,P >0 0 5 )。结论 维生素E和辅酶Q10具有增加机体对自由基的清除能力 ,保护内耳组织线粒体DNA ,降低 4 834bp缺失突变发生率的作用。

线粒体基因组4977bp异质性缺失与高原肺水肿易感性无关

目的研究线粒体基因组4 977 bp大片段异质性缺失与高原肺水肿(high altitude pulmonary edema,HAPE)易感性的关系。方法选择本室收集的HAPE标本36例及与其匹配的健康对照标本36例,采用定量PCR(SYBR)的方法研究线粒体基因组4 977 bp大片段异质性缺失与高原肺水肿易感性的关系。结果在高原肺水肿的病例组及对照组中均没有发现4 977 bp异质性缺失。结论线粒体基因组4 977 bp异质性缺失与高原肺水肿易感性无关。

人外周血线粒体DNA4934bp自发缺失及^(60)Coγ射线诱发缺失的剂量效应关系初探

为探索正常人群外周血样品中线粒体DNA(mtDNA)4934bp缺失的发生比例及电离辐射是否可以诱发该缺失,对109例正常人外周血样品进行分析,确定正常人外周血样品中发生该缺失的比例,将3例缺失阳性正常人外周血样品,使其受到0、2和6Gy60Coγ射线照射,对4934bp缺失发生情况进行研究;经分析发现,41%的正常人外周血样品具有该缺失,聚合酶链反应PCR产物经克隆、测序和核苷酸同源性分析证实该缺失发生在线粒体DNA重链nt8435-nt13368之间。自发缺失发生比例与供者年龄增长相关(p<0.01),与性别无关。使用半定量聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR),缺失阳性正常人外周血样品在接受0、2和6Gyγ射线照射后,检测其mtDNA4934bp的缺失情况,发现在照射前后外周血线粒体DNA均有该缺失;以正常人外周血所做的半定量分析发现在照射0、2和6Gy后该缺失水平分别为23、25和27。说明电离辐射诱发人外周血样品缺失水平随剂量增加而增高。

广东地区汉族群体线粒体DNA 9bp序列缺失频率研究

旨在研究中国广东省部分地区汉族人群线粒体DNA Region Ⅴ 9bp序列缺失情况。采用PCR-PAGE和直接测序法对3个群体144份样本mtDNA Region Ⅴ进行序列分析。结果只检测到标准型和短型(即9bp缺失)两种多态。广东汉族人群的平均缺失频率为21.5%,广州、东莞和湛江汉族人群的缺失频率依次为20.8%、19.2%和25.0%。由此得出,广东汉族人群mtDNA9bp缺失频率较高,与其它地区汉族群体存在一定的差异。

广西壮、苗族和越南京族人线粒体DNA 9 bp缺失频率的分析

目的探讨广西壮、苗族和越南京族人的mtDNA V区的遗传多态性。方法PCR—PAGE扩增和检测COⅡ与tRNA^Lys基因之间的片段，随机选择部分PCR扩增产物进行测序予以确认。结果在广西壮、苗族和越南京族人样本中只发现标准型和短型两种类型的扩增产物。广西壮、苗族和越南京族人的9bp缺失频率分别为20．83％、33．01％和33．31％。结论来自不同地区种族和人群的9bp缺失频率有所不同。研究结果支持中国南方人群与越南人在遗传上有较为密切的关系。

血细胞线粒体DNA 4977缺失与年龄的相关性

目的检测不同年龄组人活体血细胞线粒体DNA4977碱基缺失情况及其与年龄的相关性。方法根据Anderson标准序列设计mtDNA恒定区和mtDNA4977特异缺失区引物,采用实时荧光定量PCR技术,对110份不同年龄组人活体血细胞mtDNA4977缺失水平进行检测。结果在23岁以下个体中未检出mtDNA4977缺失,在大于23岁的被检个体中检测到mtDNA4977缺失,年龄越大,越容易检测到缺失。结论人mtDNA4977缺失与年龄有一定的相关性。

盆腔器官脱垂患者子宫骶韧带线粒体DNA^(4977)缺失及其生物学意义

目的通过研究线粒体DNA^4977缺失在盆腔器官脱垂(pelvic organ prolapse,POP)患者子宫骶韧带中的变化,初步探讨POP可能的发生机制。方法取2016年9月～2017年4月我科因POPⅡ～Ⅳ期切除子宫26例为研究组,同期因良性疾病切除子宫的非POP患者21例为对照组,取子宫骶韧带组织,提取其中的线粒体DNA,应用荧光定量PCR方法检测线粒体DNA和DNA^4977缺失的相对含量,应用琼脂糖凝胶电泳方法对PCR产物进行比对分析。结果①研究组子宫骶韧带组织中线粒体DNA^4977缺失明显高于对照组,差异有统计学意义(Z=-2. 086,P=0. 037);而2组总线粒体DNA含量无明显差异(P=0. 447)。②研究组线粒体DNA^4977缺失与年龄、孕次、产次、BMI、初产年龄、绝经年龄均无明显相关性(P>0.05);对照组患者线粒体DNA^4977缺失与年龄有明显相关性,随着年龄的增加,线粒体DNA4977缺失增多(r=0. 465,P=0. 034),而与孕次、产次、BMI、初产年龄、绝经年龄无明显相关性(P>0.05)。结论子宫骶韧带线粒体DNA^4977缺失在POP患者中显著增加,可能是导致POP的原因之一。

云南大理白族和汉族弱精子症患者精子mtDNA 4977 bp缺失相关性研究

探讨云南大理白族和汉族弱精子症患者精子线粒体DNA(mtDNA) 4977 bp缺失的相关性。收集云南大理白族弱精子症患者137例,汉族弱精子症患者121例,正常对照组大理白族和白族精子活力正常人各120例,提取精液基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)技术进行精子mtDNA4977bp缺失的研究。结果显示,120例正常对照的大理白族精子活力正常人中有10例(8.33%)存在mtDNA4977 bp缺失;而137例大理白族弱精子症患者中有89例(64.96%)存在mtDNA 4977 bp缺失。两组4977 bp缺失频率比较有极显著性差异(P <0.01)。120例正常对照的汉族精子活力正常人中有7例(5.83%)存在mtDNA 4977 bp缺失;121例大理白族弱精子症患者中有85例(70.25%)存在mtDNA 4977 bp缺失。两组4977 bp缺失频率比较差异有极显著性(P <0.01)。同时发现大理白族弱精子症患者与汉族弱精子症患者mtDNA 4977 bp缺失频率无显著性差异(P> 0.05)。大理白族和汉族人群mt DNA 4977 bp缺失与弱精子症的发病有明显的关联,提示mtDNA 4977 bp缺失在弱精子症的发生中可能起重要作用。

老龄大岳㈣能下降与线粒体DNA4834bp缺失突变的关系

目的探讨大鼠老年性耳聋与听觉器官线粒体DNA4834bp缺失突变的关系。方法取sD大鼠按年龄随机分为对照组（3个月龄）与观察组（24个月龄）．各10只。分别对2组大鼠进行听性脑干反应（ABR）测试听阈，采用PCR技术检测大鼠内耳耳蜗及蜗神经核组织线粒体DNA4834bp缺失突变情况，应用凝胶酶切电泳技术证实线粒体DNA缺失突变的存在。结果对照组大鼠ABR平均听阈为（19．50±3．69）dBpeSPL，观察组大鼠ABR平均听阀（46．00±3．94）dBpeSPL，两组差异有统计学意义（P〈005）。线粒体DNA大片段缺失检出情况：对照组大鼠内耳组织及蜗神经核未发现线粒体DNA4834bp缺失，观察组大鼠内耳组织线粒体DNA4834bp缺失突变检出率为90．O％，脑蜗神经核线粒体DNA4834bp缺失检出率为100％。结论老龄大鼠听觉器官（内耳组织和蜗神经核）线粒体DNA4834bp缺失突变检出率高，这种大片段缺失与老龄大鼠听功能下降密切相关。

人卵母细胞和胚胎线粒体DNA缺失的研究

目的:检测人类卵子和胚胎线粒体DNA(mtDNA)4977bp缺失,并探讨这种缺失存在的病理生理学意义。方法:收集不受精的成熟卵母细胞和不适合移植及冷冻保存的胚胎;碱裂解法制备单个细胞DNA;单细胞巢式PCR检测人卵母细胞和胚胎mtDNA4977bp缺失情况。结果:122个卵母细胞中,56个(45.9%)发现有4977bp缺失;90个胚胎中,21个(23.3%)发现有缺失,二者间差异有显著性意义。将卵母细胞和胚胎分别按患者的年龄分为<30岁组、30-34岁组和>34岁组,卵母细胞缺失率分别为:43.6%、44.4%和51.7%,各组间差异无显著性意义;各组胚胎的缺失率分别为21.4%、20.0%和29.6%,差异亦无显著性意义。将卵母细胞和胚胎分别按患者是否妊娠分组,结果发现妊娠组与非妊娠组间mtDNA缺失率的差异也无显著性意义。结论:mtDNA4977bp缺失与受精失败有关,其是否参与卵子老化及其机制有待进一步研究。

不孕症患者子宫内膜细胞线粒体DNA缺失研究

目的女性受孕期间子宫内膜能量代谢正常与否,直接决定受精卵的种植成功率及胚胎正常发育。本研究拟探讨子宫内膜细胞线粒体DNA(mtDNA)缺失及能量变化与不孕症发生的关系。方法收集原发性不孕症(n=30)、继发性不孕症(n=27)及对照组(n=26)的子宫内膜组织,采用巢式多聚酶链反应(PCR)检测各组子宫内膜细胞中mtDNA缺失差异;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测各组mtDNA拷贝数变化;最后,比较各组子宫内膜组织的ATP含量差异。结果巢式PCR检测显示,原发和继发性不孕症患者子宫内膜细胞mtDNA 4 977bp缺失率分别为86.67%和78.78%,均显著高于对照组(38.46%)(P<0.05);原发和继发性不孕症子宫内膜细胞mtDNA拷贝数明显增加,分别比对照组高48.49%和51.01%(P<0.01),而ATP含量显著下降,分别比对照组低57.00%和61.29%(P<0.01)。结论子宫内膜mtDNA缺失率增加,mtDNA拷贝数增加,引起子宫内膜能量代谢失调进而参与不孕症的发生。

河南汉族群体线粒体DNA Region V的遗传多态性

目的研究中国河南地区汉族人群线粒体DNA Region V区的遗传多态性。方法采用聚合酶链反应-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PCR-PAGE)法对277份河南汉族样本的线粒体DNA RegionⅤ进行多态性分析,并随机选取部分DNA扩增产物进行测序予以确认。结果在河南汉族群体中发现标准型和缺失型2种多态类型,缺失型多态(即9 bp缺失)出现频率为15.88%。结论河南省汉族群体DNA RegionⅤ缺失型多态基因频率较低,与其他民族或人种有一定差异。

线粒体DNA 4977 bp缺失和彗星分析评价肿瘤细胞的辐射敏感性

目的 探讨mtDNA4977bp缺失和彗星分析用于肿瘤细胞辐射敏感性检测的可行性.方法 选取3种不同肿瘤细胞株:肝癌细胞(HepG2)、食管癌细胞(EC-9706)和乳腺癌细胞(MCF-7).采用MTT法检测肿瘤细胞经γ射线照射后的存活分数(SF);巢式PCR法测肿瘤细胞的mtDNA 4977bp缺失率;单细胞凝胶电泳(SCGE)检测肿瘤细胞的DNA断裂水平.结果 用MTT法发现HepG2和EC-9706细胞的辐射敏感性高于MCF-7细胞.8 Gy照射后HepG2和EC-9706 mtDNA 4977 bp缺失率明显高于MCF-7细胞(P＜0.05),证实HepG2和EC-9706细胞的辐射敏感性高于MCF-7细胞.多种方法分析结果说明3种肿瘤细胞在8 Gy照后表现出的辐射敏感性差异有统计学意义.结论 多种生物学指标的综合应用,可能更加客观准确地评价肿瘤细胞的辐射敏感性.