昆虫病原线虫共生菌BP品系杀虫毒素基因簇中各基因与杀虫活性的关系

昆虫病原线虫共生菌XenorhabdusnematophilusBP的多个杀虫毒素基因集中在一起形成一个约 40kb的基因簇。为研究这个基因簇中各基因与杀虫活性的关系 ,对该共生菌粘粒文库中 5个粘粒克隆XnBP76、XnBP83、XnBP2 0 3、XnBPp378和XnBP41 4及XnBP83的 3个亚克隆插入DNA片段的基因结构和它们对棉铃虫的杀虫活性进行了比较 ,结果显示 ,xptB1 ,xptC1和xptA2 3个基因或后两者的联合表达产物具有最强的杀虫效果 ,缺失其中的任何 1个或 2个会使杀虫活力大幅度地下降或完全消失 ;而xptD1和xptA1的缺失对毒素基因簇的表达产物的杀虫活力影响很小 ;杀虫毒素的物理混合没有明显的增效作用。

泰山1号线虫共生菌培养特性的研究

菌体培养试验结果表明，供试的一株无色杆菌，其滞留适应期、对数生长期、稳定期和衰亡期分别为０～６ｈ 、７～１７ ｈ、２４～３２ ｈ 左右和３２ ｈ 以后；药效试验结果表明，该菌培养３６ ｈ

昆虫病原线虫共生菌YL001发酵液不同粗提物抑菌活性研究

采用不同溶剂对YL001发酵液进行提取,以抑制菌丝生长速率法、抑制孢子萌发试验法离体测定了不同粗提物对植物病原真菌的抑制活性。结果表明,氯仿粗提物在离体条件下能显著抑制多种供试真菌菌丝的生长,其对辣椒疫霉病菌和水稻稻瘟病菌的EC50值分别为63.58μg/mL和77.21μg/mL;正丁醇粗提物能显著抑制供试真菌孢子的萌发,其对番茄灰霉病菌的EC50值为0.445μg/mL;盆栽实验表明正丁醇粗提物比氯仿粗提物具有较好的防治效果,其对黄瓜霜霉病的保护和治疗作用分别达82.4%和75.1%。

昆虫病原线虫共生菌胞内外蛋白的提取及杀虫活性比较

通过超声波破碎、硫酸铵盐析等方法从10株昆虫病原线虫共生菌的发酵液中分离出各菌株的胞内和胞外蛋白,测定各蛋白样品含量及其对棉铃虫初孵幼虫的生长抑制毒性,并用Native-PAGE和SDS-PAGE对各粗蛋白组分进行初步分析。结果表明有7个菌株的胞内和胞外蛋白对棉铃虫初孵幼虫生长均显示出不同程度的抑制生长活性。其中以嗜线虫致病杆菌3个菌株CB6、All和Bw活性最强,其胞内蛋白的活性分别达97.1%、97.9%、97.2%,胞外蛋白分别达95.8%9、6.3%、88.6%。不同菌株胞内胞外蛋白产量各不相同。电泳图谱表明,不同菌株间及同一菌株胞内胞外蛋白有差异,但近缘菌株相似。

昆虫病原线虫共生菌对小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌的抑菌活性

为探索小麦根腐病和小麦赤霉病可持续控制的有效生防途径,以小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌作为供试真菌,评价了昆虫病原线虫共生菌及其毒素的抑菌活性,并对高毒力菌株抗逆性进行了初探。结果表明,供试的28个昆虫病原线虫共生菌发酵液和毒素均有一定的抑菌活性,其中,高毒力共生菌菌株SY5发酵液和毒素对小麦根腐病菌的抑菌率分别为56.05%和67.41%,对小麦赤霉病菌的抑菌率分别为82.41%和83.32%;菌株SY5发酵液经50℃处理60 min及18 W紫外灯照射120 min后对小麦根腐病菌的抑菌率无明显变化,但对小麦赤霉病菌的抑菌率有所下降;常温保存150 d,抑菌活性略有下降。说明共生菌菌株SY5对小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌抑菌活性显著,且具有一定的抗逆性,极具应用潜力。

昆虫病原线虫共生菌杀虫蛋白的研究进展

昆虫病原线虫共生菌杀虫蛋白对许多农业害虫都有很明显的毒杀作用,作为一种新型的具有开发潜力和应用前景的生物防治资源,已经引起科学家们的关注并成为国内外研究的热点之一。综述了昆虫病原线虫共生菌杀虫蛋白基因的结构和功能及其杀虫机制方面的研究进展。

昆虫病原线虫共生菌对甜菜夜蛾和辣椒炭疽病菌的生物活性测定

利用40株昆虫病原线虫共生菌菌株,以两种辣椒主要病虫害——甜菜夜蛾和辣椒炭疽病菌作为供试昆虫和真菌,对其杀虫抑菌活性进行测定。结果表明,40株共生菌菌株的发酵液对这两种病虫均有一定的抑制活性,其中嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)A24-1菌株的杀虫抑菌活性最为明显,处理后120h对甜菜夜蛾的平均校正死亡率为100.00%;对辣椒炭疽病菌的抑菌圈直径为40.00mm。

昆虫病原线虫共生菌杀虫毒素对亚洲玉米螟幼虫的杀虫活性

自28个昆虫病原线虫品系离体培养得到152株共生细菌菌株,筛选出高毒力菌株并提取杀虫粗提物,生物测定结果表明:线虫品系5的共生菌及其杀虫粗提物对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)幼虫有较高的胃毒活性,对未死虫的生长发育有明显的抑制作用。图2,表2,参9。

影响昆虫病原线虫共生菌发酵液杀虫活性相关因子研究

应用生物测定法,研究了甘肃省3种土著昆虫病原线虫的4个优良品系共生菌的杀虫活性,及日光和紫外照射、温度对杀虫活性的影响。结果表明,不同线虫及品系共生菌对大蜡螟的胃毒活性存在显著差异,异小杆线虫共生菌HMP0627对大蜡螟的胃毒活性最高,校正死亡率和体重抑制率分别为22.20%和36.02%,斯氏线虫共生菌SAX0664对大蜡螟也有较高的致死作用。4个线虫品系共生菌对日光和紫外光照射都有较强的适应性,1.999mmol/(m2·s)日光下照射1h和18W紫外灯照射30min仍具有胃毒毒力。不同共生菌对温度的适应性存在显著差异,随着温度的升高,共生菌的胃毒毒力显著下降。到50℃时,异小杆线虫共生菌HMP0627仍有较高的致死率和体重抑制率,斯氏线虫共生菌SKX0657仍有较高的体重抑制率。

昆虫病原线虫共生菌对玉米弯孢菌的抑菌活性及其抗逆性

利用从国内采集土样中收集到的23个品系昆虫病原线虫和5个本室保存的线虫品系分离共生菌,通过对共生菌菌株发酵液和初提物抑菌活性的测定,得到1株对玉米弯孢菌具有良好抑菌活性的共生菌菌株SY5,抑菌圈平均直径分别为50.00mm和33.34mm,并对抑菌活性强的菌株发酵液的抗逆性进行了初步探索,结果表明,共生菌菌株SY5在50℃下处理60 min和100℃高温下10 min,其抑菌活性依旧很高;18W紫外线照射120 min对共生菌SY5的抑菌活性的影响不明显;常温保存150d,抑菌活性下降。

昆虫病原线虫共生菌YL001菌毛蛋白亚基基因的克隆与序列分析

为了准确克隆昆虫病原线虫共生菌YL001菌毛蛋白亚基基因,根据已报道的菌毛蛋白亚基序列设计引物,以昆虫病原线虫共生菌YL001的总DNA为模板进行PCR扩增,获得1条大约500 bp的特异性片断,将此片断克隆到T-easy载体上,获得了重组子pGEM-PSYL001,序列测定和结构分析结果表明,PSYL001阅读框全长537bp,编码179个氨基酸,预测分子量和等电点分别为18.9 ku和6.94,GenBank登录号为DQ537944。与GenBank(AY140909)上公布的Xenorhabdus nematophilus菌毛蛋白亚基核苷酸序列的同源性为99%,氨基酸序列的同源性为98%。上述分析表明,菌毛蛋白亚基基因得到了成功克隆。

线虫共生菌Xenorhabdus budapestensis SN19次生代谢产物的分离纯化与结构鉴定

采用硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备高效液相色谱技术对线虫共生菌Xenorhabdus budapestensis SN19的次生代谢产物进行分离纯化,得到2个单体化合物。通过波谱综合解析和文献数据对照分别鉴定为xenematides C(1)和xenematides E(2),其中化合物2为新化合物,化合物1对番茄灰霉病菌具有较强的抑制作用(EC50=22.71μg/m L)。

昆虫病原线虫共生菌5-5B液体培养基的优化研究

为降低昆虫病原线虫共生菌5-5B液体培养基的造价,使之适合规模化生产,应用二次正交旋转组合设计方法,对5-5B菌株液体培养基的组分配比进行了重新配比和优化。结果表明,在培养基各组分中,玉米淀粉对产菌量影响最大;优化后的培养基5个组分的最佳水平编码分别为0,1,2,1,-2,即玉米淀粉3.0 g·(100mL)-1,黄豆饼粉2.0 g·(100mL)-1,酵母粉2.5 g·(100mL)-1,鱼粉2.0 g·(100mL)-1,蛋白胨0.1 g·(100mL)-1。此培养基的优化配方可应用于大量生产。

昆虫病原线虫共生菌毒素对水稻恶苗病菌的抑菌活性

利用从全国采集的土样中收集到的28个品系的昆虫病原线虫,分离并筛选出28株高毒力共生菌株,对高毒力菌株的毒素进行初步提取,利用水稻恶苗病菌进行抑菌活性测定,结果表明,共生菌NC34-3B的毒素对水稻恶苗病菌抑菌活性最高,抑菌圈半径为17.50 mm。

9株昆虫病原线虫共生菌菌株的分离、鉴定及其抗菌谱的筛选

[目的]本文旨在探讨9株昆虫病原线虫(entomopathogenic nematode,EPN)共生菌菌株的高效分离鉴定方法以及其对植物真菌病害的拮抗能力。[方法]采用研磨法、血淋巴涂布法和改良涂布法对7种斯氏线虫科(Steinernematidae)和2种异小杆科(Heterorhabditidae)EPN的共生菌进行分离。通过测定其16S rDNA序列进行同源性分析和分子系统发育树分析以鉴定共生菌的种属。采用平板菌丝抑制法测定这9株共生菌的抗病原真菌谱。挑选综合抑菌效果最好的2株共生菌菌株进行稀释和组分分离,测试各组分对真菌的菌丝生长和镰刀菌属分生孢子萌发的抑制效率。[结果]改良涂布法分离到的共生菌平均菌落数为124.0,明显多于传统的研磨法和血淋巴涂布法(分别为8.2和67.7),同时被污染的概率也低。9株共生菌中有7株属于致病杆菌属(Xenorhadus)的5个种,2株属于发光杆菌属(Photorhabdus)的2个种。9株共生菌对稻瘟病菌、尖孢镰刀菌西瓜专化型、尖孢镰刀菌黄瓜专化型、灰葡萄孢菌和辣椒疫霉均有抑制能力。其中,伯氏致病杆菌(Xenorhadus bovienii)NN6和NN8对5种真菌菌丝生长的抑制效率最高,均大于45%。NN6发酵液的5倍稀释液对辣椒疫霉菌丝生长的抑制效率为51.99%,显著高于NN8(45.46%)。NN8发酵液原液对尖孢镰刀菌黄瓜专化型孢子萌发的抑制效率为88.16%,显著高于NN6(81.79%)。[结论]改良的血淋巴涂布法是1种高效分离昆虫病原线虫共生菌的方法,分离到的9株共生菌对5种常见植物病原真菌的生长具有很强的抑制作用,其中伯氏致病杆菌NN6和NN8对菌丝生长的综合抑制能力最强。

昆虫病原线虫共生菌Serratia nematodiphila DR186对果蝇致病机制的研究

[目的]通过昆虫病原线虫共生菌Serratia nematodiphila DR186侵染黑腹果蝇的野生型和免疫突变体,研究该共生菌侵染果蝇成虫的致病机制。[方法]利用饲喂和针刺方式将S.nematodiphila DR186接入野生型黑腹果蝇和其体液免疫途径突变体的肠道和血腔中引起侵染;通过统计2种侵染条件下各个突变体的存活率,血腔中共生菌的菌体数,结合荧光定量PCR检测两类抗菌肽Diptericin和Drosomycin的表达水平来研究S.nematodiphila DR186对果蝇的致病机制。[结果]S.nematodiphila DR186对野生型黑腹果蝇的肠道侵染存活率在7 d降至0,血腔侵染存活率在19 h降至0;S.nematodiphila DR186血腔侵染后,Imd途径的PGRP-LC、Dredd、Relish突变体相对Toll途径的Dif突变体和野生型更加敏感,在12 h内存活率低于50%,并在随后短时间内全部死亡。荧光定量PCR分析显示Diptericin和Drosomycin的相对表达水平在血腔侵染过程中均呈先上升再逐渐降低的趋势。Dredd突变体Drosomycin相对表达量在6 h达到88%,Dif突变体和野生型的Diptericin相对表达量在6 h分别达到75%和62%。S.nematodiphila DR186侵染肠道后对Imd途径和Toll途径突变体及野生型的存活率在7 d降至0。针刺法侵染的致病性高于饲喂法侵染,在19 h存活率降至0。[结论]S.nematodiphila DR186可能采用免疫逃逸机制从果蝇肠道成功侵染果蝇。果蝇抵抗S.nematodiphila DR186侵染的主要免疫途径是Imd体液免疫途径。

昆虫病原线虫4新种所携带共生菌的分子鉴定

以16S rDNA为分子标记对中山大学有害生物控制及资源利用国家重点实验室近年从我国采集到并描述发表的斯氏属昆虫病原线虫4个新种所携带的共生菌进行分类鉴定,结果显示Steinernema akhursti所携带的共生菌很可能是Xenorhabdus属的一个新种,S.aciari和S.leizhouense所携带的共生菌可能是Xenorhabdus属的两个近缘的新种或同一种的两个远缘菌株,而S.beddingi所携带的共生菌可能是Xenorhabdus bovienii的一个新菌株。

伯氏嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus bovienii YL002对4种抗生素抗性突变株的筛选及抑菌活性分析

为了提高伯氏嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus bovienii YL002抑菌活性,采用紫外线照射和吖啶橙复合诱变的方法,对其进行诱变改良,并在抗生素最小抑制浓度选择压力下筛选对4种抗生素具有抗性的突变菌株。以枯草芽孢杆菌为指示菌,得到了17株抑菌活性有显著变化且遗传稳定的突变菌株。其中菌株L0420-3对枯草芽孢杆菌的抑制活性最强,连续转接5次的抑菌圈直径增大率均在80%以上;菌株Q025-1和L0314-4对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制率为75.66%和73.41%,分别是野生菌株的1.35倍和1.31倍;接种灰霉病菌后5 d对番茄果实灰霉病的防效为95.74%和93.62%,分别是野生菌株的1.71倍和1.67倍。

Xenorhabdus poinarii 5-5B杀虫毒素的分离纯化与活性测定

首次从全国采集的土样,分离并筛选出高毒力共生菌菌株Xenorhabdus poinarii 5-5B,首次对Xenorhabdus poinarii的杀虫毒素进行分离纯化,通过硫酸铵沉淀法对其杀虫毒素进行分离后,再利用DEAE-52层析柱进行了纯化,共得到7个峰,各峰的回收产物进行活性测定(干粉以5 μg/L溶于去离子水)结果表明,各峰产物对亚洲玉米螟、黄粉虫、小菜蛾、黏虫和甜菜夜蛾均具有较高的胃毒活性。

基于转录组学分析Xenorhabdus bovienii肽基脯氨酰异构酶ppia-l20基因的表达调控

[目的]前期从广谱抗菌的Xenorhabdus bovienii NN6菌株的胞外蛋白中分离出一种新型杀菌蛋白PPIA-L20,为肽基脯氨酰异构酶A类似物,该蛋白能够抑制尖孢镰刀菌西瓜专化型的孢子的萌发,致使孢子死亡。经过多次试验验证ppia-l20基因的表达水平不稳定,与发酵时间没有明显的相关性。本文旨在探寻调控ppia-l20基因表达的调控因子,进而推测ppia-l20基因表达调控的分子机制,为进一步提高抗菌蛋白的产量提供参考。[方法]对ppia-l20的转录水平进行Real-time PCR分析并与菌株生长曲线进行相关性分析,选择ppia-l20基因表达量差异显著的2个发酵时间点进行转录组学比较,并对表达差异显著的DEG(differential expressed gene)进行GO功能注释、KEGG富集通路和蛋白网络互作分析。[结果]4~84 h发酵菌体中的ppia-l20基因表达趋势不稳定,其转录水平与时间不相关。与ppia-l20低表达量的8 h发酵菌体相比,ppia-l20高表达量的12 h发酵菌体中有466个DEG,包括193个上调基因和273个下调基因。Real-time PCR验证表明基因表达差异趋势与转录组测序结果一致,证明测序结果可信。对差异表达的基因进行GO功能注释、KEGG富集分析,发现DEG的功能与膜形成相关,富集通路与双组分调节系统、磷酸转移酶系统和阳离子抗菌肽抵制通路相关。其中,双组分调节系统中的qseC基因和opmR基因表达量均上调2倍,ppia-l20基因位于阳离子抗菌肽抵制通路,该通路上的nlpE基因(负责编码外膜脂蛋白)显著下调。蛋白互作网络中,PPIA-L20蛋白与位于外膜的AMP结合蛋白TycC、GrsB有互作关系,NlpE蛋白与双组分调节系统中cpxR基因、cpxA基因表达的蛋白有互作关系。[结论]Xenorhabdus bovienii NN6菌株可能通过双组分调节系统通路、阳离子抗菌肽抵制通路上的关键基因nlpE和磷酸转移酶系统共同调控ppia-l20的表达。