人组合抗体库(HuCAL)的构建及其优化

基于抗体结构信息、通过聚类分析建立的全合成人组合抗体库(the fully gene-synthetic human combinational anti-body library,HuCAL)由Peter Pack等于1997年率先提出。与其它抗体库不同,HuCAL由源于人免疫系统胚系基因分类获得的7个VH、7个VL(4个Vκ、3个Vλ)主架序列及CDR3库组成,其49个ScFv主架在大肠杆菌周质腔中,均能以分泌形式正确表达;CDR两侧特有的酶切位点,使CDR的替换非常方便;同时,由于CDR3库在构建时,采用了三联核苷酸突变技术,增加了随机化的准确性和效率,使抗体库的质量得到极大的提高。构建好的HuCAL经多种抗原筛选后,产生了一大批高亲和力结合子,且筛出的抗体表达量、热稳定性较好。由于HuCAL主架基因是人免疫系统胚系基因的通用序列,其免疫原性大大降低,可用于产生体内诊断性或治疗性的人源抗体。本文对HuCAL的构建及其优化进行综述。

抗体库优化策略对特异性抗肝癌单链抗体的人源化

目的:对特异性抗肝癌单链抗体(single chain variable fragment,scFv)DM同步进行人源化和优化,以获得亲和力高和免疫原性低的人源化抗肝癌单链抗体.方法:通过分子结构和序列分析,确定对抗原结合位点的构象有重要影响的骨架区(FR)残基,把难以判断回复突变残基的人、鼠源副本同时编入人源化抗体序列中;通过重叠延伸PCR技术合成人源化抗体全基因,利用噬菌体展示技术构建人源化组合抗体库;通过肝癌细胞筛选阳性克隆,ELISA方法测定各个克隆抗原结合活性;用硫氰酸盐洗脱法测定并比较亲本抗体和人源化scFv的相对亲和力.结果:成功构建人源化组合抗体库,实际库容4.77×105,包含由25不同重链和22不同轻链组成的128种人源化DM;经过筛淘及ELISA鉴定,获得HDM1、HDM2和HDM33个阳性克隆,相对亲和力指数分别为HDM11.6mol/L、HDM21.2mol/L和HDM32.2mol/L.结论:抗体库优化法是一个高效、简便的人源化方法;获得的3株阳性克隆HDM1、HDM2、HDM3与亲本抗体DM同样具有良好的抗原结合特异性和较高的亲和力.

大肠癌相关抗原体外致敏法构建人源抗体库

建立杂交瘤单抗亲和层析纯化抗原、抗原体外致敏淋巴细胞和RT-PCR克隆人抗体基因及噬菌体呈现技术构建人源抗体库的策略.将亲和层析纯化的大肠癌相关抗原CA-Hb3经SDS-PAGE和免疫印迹鉴定后,与IL-2和丝裂原于体外致敏10个大肠癌病人各10ml外周血淋巴细胞(PBL),出现淋巴母细胞化和集落形成现象,提取总RNA并纯化mRNA,经RT-PCR扩增3种VH-CHI(γ)基因和5种VL-CL(κλ)基因,再经PCR克隆3种VH(γ)和8种VL(κλ)基因.通过(Gly_4Ser)_3相应的寡核苷酸连接序列将VH和VL基因不同组合连成24种单链抗体(ScFv)基因,经 SfiI酶切,将之克隆入fUSE 5RF,用电穿孔法将此表达载体转化MC1061,四环素抗性筛选得到10~6库容的初级抗体库,ScFv基因插入百分率为85%.该策略将可能普遍用于鼠源单抗人源化.

治疗性抗体制备的研究进展

随着单克隆抗体技术的问世,研究和生产用于疾病治疗的单抗药物成为现实。本文主要针对目前治疗性抗体制备的新技术,主要包括组合抗体库技术,转基因动物技术和展示技术等进行综述。

从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAg的Fab噬菌体抗体

目的从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗ＨＢｓＡｇ Ｆａｂ噬菌体抗体。方法用固相化ＨＢｓＡｇ对所构建的噬菌体抗体库进行三轮淘筛，从中筛选人抗ＨＢｓＡｇ Ｆａｂ噬菌体抗体。结果 第三轮淘筛后洗脱下来的噬菌体，较第一轮增加８０倍，含有抗体轻链基因和重链基因的克隆，也由淘筛前的１７％增至１００％，经ＥＬＩＳＡ证实，筛选到的抗ＨＢｓＡｇ噬菌体抗体对ＨＢｓＡｇ具有良好的结台活性，而与牛血清白蛋白和ＨＡＶＡｇ等无关抗原均不反应。结论ＨＢｓＡｇ对抗体库的淘筛，富集了表面呈现抗ＨＢｓＡｇ的单克隆抗体的噬菌体。