组成型激活突变体在G蛋白偶联受体研究中的应用

G蛋白偶联受体 (GPCR)组成型活性概念的提出 ,使组成型激活突变体 (CAM)成为研究GPCR的新方法。CAM促进了对GPCR的结构、激活机制、活性调节及病理生理的研究。通过对CAM的研究发现了GPCR激活的关键结构区域 ,提出配体受体相互作用的”扩充的三元复合物模型”和GPCR激活过程中存在多个中间激活态的观点。CAM在一定程度上模拟了野生型受体激活的失敏过程 ,并为疾病的研究提供新的思路。

埃兹蛋白(Ezrin)及其突变体的原核表达与纯化

Thr567位点磷酸化是ezrin活化的必需条件。利用定点突变引物将T567突变为A或D,通过PCR扩增出相应的基因片段,将其通过T4连接酶连接至含His标签的原核表达载体pET-20b(+),构建了原核重组质粒pET-20b(+)-Ez WT,pET-20b(+)-EzT567A和pET-20b(+)-EzT567D。转化表达宿主大肠杆菌Rosseta后,用异丙基-β-硫代半乳糖诱导重组蛋白的表达。重组蛋白经亲和镍柱纯化以后,应用western blot鉴定纯化的融合蛋白。Ezrin野生型及其组成型激活和显性负突变质粒的成功构建及其目的蛋白His-Ez WT,His-EzT576A和His-EzT576D的成功表达纯化,为更深入地研究ezrin生物学功能奠定基础。