人组氨酰-tRNA合成酶基因的克隆与表达

用RT_PCR方法从人胎盘总RNA中获得编码人组氨酰_tRNA合成酶(Jo_1)基因的全序列,选用IMPACT_CN系统中的pTYB11,构建克隆与表达载体,转化大肠杆菌ER2566.经筛选与鉴定,得到3个阳性重组子,对其进行诱导表达获得Jo_1融合蛋白,western_blotting检验结果显示,该融合蛋白具有Jo_1免疫原性和免疫特异性.

人类组氨酰TRNA合成酶类似物的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:在原核系统中表达并纯化人类组氨酰TRNA合成酶类似物蛋白,制备多克隆抗体。方法:设计引物扩增其开放阅读框,重组入原核表达载体PQE30,并在大肠杆菌M15中诱导表达;应用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔。结果:①成功构建人类组氨酰TRNA合成酶类似物的原核表达载体;②经NI亲和层析获得纯度较高的重组蛋白;③制备了高滴度的兔抗人类组氨酰TRNA合成酶类似物蛋白的多克隆抗体。结论:原核表达载体的构建、重组蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备为今后研究该蛋白的功能提供了良好的基础。

抗组氨酰-tRNA合成酶单克隆抗体的制备及初步鉴定

【目的】制备均一性和特异性高的抗组氨酰-tRNA合成酶抗体,为研究皮肌炎和多肌炎的检测提供方法,为制备检测试剂盒提供原料。【方法】采用常规融合和间接ELISA检测法,获取杂交瘤细胞株;Protein G Sepharose 4FF和Sephadex G50结合对含有单克隆抗体的腹水进行纯化;SDS-PAGA电泳技术进行单克隆抗体的鉴定。【结果】筛选获得了2株稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为W001和W002;杂交瘤细胞克隆后,100%的检测孔保持了分泌抗组氨酰-tRNA合成酶抗体的能力;腹水纯化达到了较理想的效果;该2株单克隆抗体能特异性针对组氨酰-tRNA合成酶,并能跟天然的蛋白结合。【结论】所制备的均一性和特异性高的抗组氨酰-tRNA合成酶抗体,可直接用于在ELISA、免疫印迹、免疫组化学等研究方面,达到了试验的目的。

植物半胱氨酸合成酶复合体(SAT/OAS-TL)研究进展

综述了植物半胱氨酸的合成调节和半胱氨酸合成酶复合体的结构、调节机理及其植物转基因的研究进展。

稀土离子对大肠杆菌tRNA^(Leu)氨酰化反应的影响

金属离子不但对ｔＲＮＡ分子结构起稳定性作用，且为氨酰化反应所必需。稀土离子可以取代ｔＲＮＡ分子中与结构功能有关的固有的镁离子，较低浓度的稀土离子和镁离子一样参与氨酰化反应，金属离子浓度提高时稀土对氨酰化反应的激活作用不如镁，对于脱镁ｔＲＮＡ分子稀土离子的这种作用更为明显。稀土离子对氨酰化反应的影响可归因于其与ＡＴＰ及ｔＲＮＡ的强配位作用引起ＡＴＰ稳定性及ｔＲＮＡ分子构象发生某种改变所致。

原核细胞精氨酸生物合成途径的研究进展

原核生物的精氨酸生物合成包含8个酶系,起始于乙酰谷氨酸激酶催化的谷氨酸的乙酰化。到第五步乙酰基团脱离,乙酰谷氨酸通过3个酶的作用,进一步合成乙酰化中间产物。鸟氨酸被氨甲酰基化生成瓜氨酸,天冬氨酸介入后形成精氨琥珀酸,最后形成终产物精氨酸。主要就精氨酸生物合成途径、合成过程中主要酶系及反馈抑制蛋白的作用机制进行了概述。此外,提出了目前精氨酸代谢研究中存在的问题及未来的研究方向。

一条新的人类组氨酰tRNA合成酶类似物全长cDNA的克隆及表达谱分析

从人胎脑文库中克隆到一条长为 12 19bp的cDNA ,它编码 2 3.4ku的肽链 .该肽链与葡萄球菌组氨酰tRNA合成酶N端同源 5 8% .利用humangenomicblast可将其定位于 2 0p11.Northern杂交显示胎脑中有一约1.5kb的单一条带 .基因芯片杂交分析表明 ,其在肺癌和前列腺癌组织中表达较高 .

系统性红斑狼疮外周血单个核细胞蛋白组学的初步研究

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)外周血单个核细胞(PBMC)蛋白质组的变化。方法分别提取14例SLE患者及9例健康献血者的PBMC,采用双向电泳技术分离全蛋白质组,对部分差异的蛋白质点进行离子阱高效液相色谱/质谱分析,测定其肽质量指纹图谱,与互联网蛋白质数据库的数据进行比对。结果获得了较好的双向电泳图像,图像分析显示:1例SLE患者、4例健康献血者PBMC蛋白匹配点为1084个,其中SLE患者高表达及特异表达蛋白点为71个及17个,健康献血者高表达及特异表达蛋白点为45个及20个,与所有实验2-DE图谱逐个比对后,对表达差异重复性高的30个蛋白质点进行肽质量指纹图谱分析,经数据库检索后,鉴定出2个胞浆蛋白质酪氨酸转运核糖核酸合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase)和斑联蛋白(zyxin)在SLE患者的PBMC中低表达。结论SLE患者PBMC蛋白组学研究可能为深入研究其发病机制、建立新的诊断指标提供一个良好的平台。

VARS高表达致缬氨酸代谢失衡促进多发性骨髓瘤细胞生长

目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是好发于中老年的浆细胞恶性肿瘤,发病机制尚不清楚。由于其多发、复发、耐药的特点,MM仍是一种无法治愈的疾病。氨基酸代谢异常是MM的重要特征之一。氨基酸重要的代谢途径是作为基本原料参与蛋白质合成。氨酰转移核糖核酸合成酶(aminoacyl transfer ribonucleic acid synthetase,ARS)基因是蛋白质合成过程中的关键调节基因。本研究旨在探究在MM中异常表达的氨基酸代谢关键因子ARS通过调控氨基酸代谢影响MM生长的分子机制。方法:对应基因编号合并基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中基因表达谱GSE5900数据集及GSE2658数据集数据,对ARS家族基因表达数据进行标准化处理。采用GSEA_4.2.0软件分析健康供者(healthy donor,HD)与MM患者基因富集的差异。采用GraphPad Prism 7绘制基因热图并进行数据分析。采用Kaplan-Meier及Cox回归模型分别对ARS家族基因表达与MM患者预后情况进行单因素及多因素回归分析。收集7例MM初诊患者的骨髓样本,使用CD138抗体磁珠分选获得CD138+、CD138−细胞,采用real-time RT-PCR分析ARS在MM临床样本中的表达情况。以人B淋巴细胞GM12878细胞,人MM细胞系ARP1、NCI-H929、OCI-MY5、U266、RPMI 8266、OPM-2、JJN-3、KMS11、MM1.s细胞为研究对象,采用real-time RT-PCR及蛋白质印迹法分析ARS在MM细胞系中的表达情况。利用短发夹核糖核酸(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒构建基因敲减质粒(VARS-sh组),将其与空载质粒(scramble组)分别转染HEK 293T细胞后进行病毒包装,分别感染ARP1、OCI-MY5细胞并建立稳定表达的细胞系,分别采用细胞计数法和流式细胞术检测敲减缬氨酰tRNA合成酶(valyltRNA synthetase,VARS)基因对MM细胞增殖和凋亡的影响。根据VARS表达将GEO数据分为高表达组和低表达组,通过生物信息学分析探索VARS影响的下游通路,采用飞行时间质谱(gas chromatography time-of-flight/mass spectrometry,GC-TOF/MS)及高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分别检测临床患者骨髓样本CD138+细胞及敲减VARS基因的ARP1、OCI-MY5细胞及上清液中缬氨酸含量。结果:基因富集分析结果表明:与HD相比,tRNA加工相关的基因在MM中显著富集(P<0.0001)。进一步筛选tRNA加工通路相关子集发现胞质氨酰tRNA合成酶家族基因在MM中显著富集(P<0.0001)。基因表达热图结果表明GEO数据中ARS家族基因除丙氨酰tRNA合成酶(alanyl-tRNA synthetase,AARS)、精氨酰tRNA合成酶(arginyl-tRNA synthetase,RARS)、丝氨酰tRNA合成酶(seryl-tRNA synthetase,SARS)外,其余ARS家族基因均在MM中高表达(均P<0.01),且随着意义未明单克隆丙种球蛋白血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance,MGUS)到MM的发展进程,基因表达水平逐渐增加。Kaplan-Meier生存情况单因素分析结果表明甲硫氨酰tRNA合成酶(methionyl-tRNA synthetase,MARS)、天冬酰胺基tRNA合成酶(asparaginyl-tRNA synthetase,NARS)、VARS高表达组与低表达组MM患者预后情况差异均具有统计学意义(均P<0.05)。Cox回归模型多因素分析结果表明:VARS的高表达与MM的总生存时间异常有关(HR=1.83,95%CI 1.10~3.06,P=0.021);NARS(HR=0.90,95%CI 0.34~2.38)及MARS(HR=1.59,95%CI 0.73~3.50)的高表达均对MM患者的总生存时间无影响(均P>0.05)。Real-time RT-PCR及蛋白质印迹法结果表明VARS、MARS和NARS在临床患者CD138+MM细胞及MM细胞系中均高表达(均P<0.05)。细胞计数法及流式细胞术结果表明,敲减VARS的MM细胞增殖能力被显著抑制(P<0.01),细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。生物信息学分析结果表明除包括细胞周期在内的通路受VARS调控外,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸分解代谢通路被上调。非靶向代谢组学数据表明:与HD相比,MM患者的CD138+MM细胞中缬氨酸含量降低(P<0.05)。HPLC结果表明:与scramble组相比,VARS-shRNA组的ARP1细胞与培养基上清液及OCI-MY5培养基上清液中缬氨酸含量均增加(均P<0.05)。结论:VARS在MM中异常高表达,且与MM患者的不良预后相关。VARS可通过影响缬氨酸代谢调控促进MM细胞的生长。

半胱氨酸合成酶复合体形成机制的研究进展

在细菌和植物中,O-乙酰丝氨酸硫解酶(OASTL)和丝氨酸乙酰转移酶(SAT)的结合形成了半胱氨酸合成酶复合物(CSC),这个酶复合体在硫同化和半胱氨酸生物合成中起调节作用。综述植物和微生物中CSC的结构、组装形成过程及其调控机制的研究进展。

间接酶联免疫法测定抗Jo-1抗体及其临床应用

目的利用基因工程表达的组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1蛋白,建立ELISA法,初步用于检测多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)中的抗Jo-1抗体。方法用表达蛋白建立间接ELISA,摸索反应时间、抗原包被浓度、样本稀释浓度及抗抗体工作浓度等工作条件,进一步检测方法的重复性及稳定性。用建立的方法,检测40例健康体检者、30例系统性红斑狼疮(SLE)、30例类风湿关节炎(RA)、20例干燥综合征(SS)、90例多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)患者血清中抗Jo-1抗体。结果成功建立间接ELISA法,并确立了一系列反应条件。临床检测结果显示,PM/DM患者抗Jo-1抗体的阳性率为25.6%,而非PM/DM患者均为阴性。PM/DM组Jo-1抗体阳性率与疾病对照组及健康对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论本研究成功应用基因工程表达的Jo-1蛋白建立了间接ELISA法,检测抗Jo-1抗体,与国外报道的结果基本相当,与常用免疫印迹法对比检测的结果一致。

植物半胱氨酸合成及调控研究进展

硫是植物重要的营养元素。植物将氧化态硫吸收并还原后,首先合成半胱氨酸使其进入各种代谢途径。合成半胱氨酸的两种酶——丝氨酸乙酰转移酶和O-乙酰丝氨酸硫醇裂合酶均由多基因家族编码,并能可逆的结合形成二酶复合物进行有效的合成调节。本文对近年来半胱氨酸合成相关酶表达、定位、活性调控及转基因效果研究进展作了简要介绍,并对将来需要重点研究的方面作了展望。

RNA催化肽键生成的实验证据

ＲＮＡ催化肽键生成的实验证据祁国荣（中国科学院上海生物化学研究所，上海２０００３１）关键词ＲＮＡ肽键生成氨酰－ｔＲＮＡ合成酶肽基转移酶当今生物界，从氨基酸到蛋白质的总步骤已基本阐明，示意图如下：图中ＩＦ、ＥＦ和ＲＦ分别为参与蛋白质合成的起始因子、延伸...

Jo-1蛋白在大肠杆菌中的克隆与表达

构建在E.coli中表达人组氨酰-tRNA合成酶(Jo-1)的质粒。用RT-PCR从人胎盘组织总RNA中获得编码人组氨酰-tRNA合成酶(Jo-1)基因的全序列,将此片段定向克隆到麦芽糖融合蛋白表达载体pMAL-c中,诱导表达获得Jo-1的可溶性融合蛋白,并通过亲和层析予以纯化。结果免疫印迹实验表明,表达的融合蛋白能与含有抗Jo-1抗体的病人血清发生特异反应,重组融合蛋白具有Jo-1蛋白的免疫原性和免疫特异性。

RNA的催化作用

RNA分子在蛋白质生物合成中仅发挥遗传信息和结构上作用而无酶活性的观念正受到挑战。催化作用RNA在RNA剪接中具有酶活性,RNase P的RNA部分在tRNA成熟过程具有催化性能。有证据表明rRNA在蛋白质生物合成肽键形成中有肽基转移酶活性和氨酰酯酶作用。因此,对RNA的功能需要重新评价。

抗Jo-1抗体在特发性炎性肌病临床分层及疾病谱中的意义

目的:探究抗组氨酰tRNA合成酶(histidyl tRNA synthetase,Jo-1)抗体在特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathies,IIM)及其他疾病谱的意义。方法:入组北京大学人民医院2016—2022年利用免疫印迹法检测抗Jo-1抗体阳性的患者,同时入组抗Jo-1抗体阴性的抗合成酶综合征(anti-synthetase syndrome,ASS)患者作为对照,分析患者的基本信息、临床特征以及炎症和免疫学指标。结果:共入组165例抗Jo-1抗体阳性患者,结缔组织病(connective tissue disease,CTD)占80.6%(133/165),其中IIM占总数的57.6%(95/165),包括ASS(84/165,50.9%)、免疫介导坏死性肌病(7/165,4.2%)以及皮肌炎(4/165,2.4%),其他CTD占23.0%(38/165),包括类风湿关节炎(11/165,6.7%)、未分化结缔组织病(5/165,3.0%)、具有自身免疫特征的间质性肺炎(5/165,3.0%)、未分化关节炎(4/165,2.4%)、干燥综合征(3/165,1.8%)、系统性红斑狼疮(3/165,1.8%)和系统性血管炎(3/165,1.8%)等;其他疾病包括恶性肿瘤(3/165,1.8%)和感染(4/165,2.4%)等;未明确诊断患者占9.1%(15/165)。在ASS亚组分析中,抗Jo-1抗体阳性的ASS患者相比于抗体阴性者起病年龄更低(49.9岁vs.55.0岁,P=0.026),更多表现为关节炎(60.7%vs.33.3%,P=0.002)和肌痛(47.1%vs.22.2%,P=0.004)。ASS患者随着抗Jo-1抗体滴度的升高,关节炎、技工手、Gottron征、雷诺现象(Raynaud phenomenon)以及肌酸激酶、α-羟丁酸脱氢酶指标异常的发生率升高。抗Jo-1抗体阳性ASS患者在合并一种以上其他肌炎抗体阳性时,肌痛、肌无力的发生率升高(P<0.05)。结论:抗Jo-1抗体阳性患者疾病谱广,以ASS为主,但也可见于其他CTD、肿瘤、感染等疾病,应注意鉴别。

13例抗Jo-1抗体综合征患者临床特征分析

目的分析抗组氨酰tRNA合成酶(Jo-1)抗体综合征患者的临床资料及治疗效果,提高对抗Jo-1抗体综合征的认识。方法回顾分析2013年5月至2017年12月在郑州大学第一附属医院被诊断为抗Jo-1抗体综合征的13例住院患者的一般资料、胸部高分辨断层扫描(HRCT)、肺功能、血清学指标及治疗效果。结果 13例抗Jo-1抗体综合征患者,男3例(23%),女10例(77%),发病年龄为23～69岁,出现间质性肺疾病(ILD)13例、多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)4例、关节炎5例,雷诺现象2例、技工手1例,其中同时呈现该病典型临床三联征(ILD、PM/DM、关节炎)2例。胸部HRCT表现为非特异性间质性肺炎(NSIP)11例、寻常型间质性肺炎(UIP)1例、淋巴细胞型间质性肺炎(LIP)1例。5例患者行肺功能检查均提示限制性通气功能障碍合并弥散功能障碍。自身抗体检测结果抗SSA抗体7例、抗SSA/Ro52抗体2例、抗SSA及/RF-IgM抗体1例、抗SSA/Ro52/RF-IgM抗体2例、抗SSA/CCP/AKA抗体1例。11例使用糖皮质激素联合环磷酰胺治疗,2例使用糖皮质激素联合雷公藤多苷治疗,治疗后,10例患者病情好转,3例患者病情稳定。结论抗Jo-1抗体综合征与间质性肺病关系密切,而肌炎少见,发作时很少观察到疾病的临床三联征,该病的早期诊断及糖皮质激素(glucocorticoid,GC)和免疫抑制剂的联合治疗对改善预后至关重要。

扩充遗传密码 进化的重演还是未来的预演?

文章介绍了一种直接在活体细胞内掺入非天然氨基酸到蛋白质中的新方法。遗传编码非天然氨基酸有效地扩充了现存生物体通用的遗传密码。这对遗传密码的进化、蛋白质的结构、功能与应用、以及与蛋白质相关的生命过程等方面的研究提供了新的思路与方法。

核苷(酸)类似物停药后对慢性乙型肝炎患者预后的影响

目的:探讨核苷(酸)类似物(NAs)停药后对慢性乙型肝炎(CHB)患者乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)转阳、丙氨酰氨基转移酶(ALT)复发的影响。方法:选取2015年6月-2019年6月中国人民解放军东部战区海军医院感染科门诊及住院的初次接受NAs治疗达到停药标准的CHB患者98例,接受治疗药物不同,分为拉米夫定(LAM)组(13例)、阿德福韦酯(ADV)组(21例)、恩替卡韦(ETV)组(64例)。观察停药48周时患者病毒学和生化学指标反弹情况。结果:98例CHB患者停药48周时,血清HBVDNA转阳率54.08%,血清ALT复发率44.90%;停药48周时,LAM组、ADV组、ETV组患者血清HBVDNA转阳发生率、血清ALT复发率比较,差异无统计学意义(P>0.05);停药48周时,乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阳性患者与阴性患者的血清HBVDNA转阳发生率、血清ALT复发率比较,差异无统计学意义(P>0.05);停药48周时,HBVpgRNA阳性患者与HBVpgRNA阴性患者转阳发生率、血清ALT复发率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:接受NAs治疗达到停药标准的CHB患者,不管应用现有的何种药物,在停药后HBVDNA转阳、ALT复发率均较高。