同源重组法构建副干酪乳杆菌组氨酸蛋白激酶基因缺失突变株

构建副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)组氨酸蛋白激酶prcK基因缺失突变株,为prcK基因功能研究提供实验工具。采用同源重组技术构建质粒p KLKRT(含prcK::Tet^r基因),将其电转化进入L.paracaseiHD1.7中,使prcK::Tet^r基因同源重组到L.paracasei HD1.7的染色体上,通过四环素耐药、氨苄青霉素敏感等特性筛选出含有prcK::Tet^r基因的新L.paracasei HD1.7。结果表明,经聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)验证及酶切验证后确定质粒p KLKRT构建成功,并成功转化入L.paracasei HD1.7中,经PCR确认L.paracasei HD1.7 prcK基因缺失突变株构建成功。该突变株产生的细菌素效价比出发菌株低23.61%。采用同源重组方法成功构建L.paracasei HD1.7 prcK基因缺失突变株,为研究L.paracasei HD1.7群体效应相关基因的分子机理奠定基础。

百脉根组氨酸蛋白激酶LHK1的表达及活性鉴定

为研究LHK1蛋白的功能,构建了pPub-LHK1∶AG-GFP和pFastBac-LHK1表达载体,分别在烟草叶肉细胞和昆虫细胞表达百脉根组氨酸蛋白激酶LHK1跨膜蛋白。结果表明:在烟草和昆虫细胞中LHK1蛋白都能表达,且表达的蛋白在体外都能磷酸化底物(组氨酸转移酶HP1蛋白),具有组氨酸蛋白激酶活性。

组氨酸蛋白激酶EnvZ抑制剂对福氏志贺菌毒力影响的初步研究

目的初步研究福氏志贺菌组氨酸蛋白激酶EnvZ抑制剂对福氏志贺菌毒力的影响。方法通过构建志贺菌:EnvZ胞内段(SF-EnvZc)蛋白的原核表达质粒,表达并纯化SF-EnvZc蛋白,在SPECS公司的小分子化合物库中模拟筛选出的10个候选EnvZ抑制剂的基础上,通过体外磷酸化的方法筛选出能够有效地抑制SF- EnvZc蛋白磷酸化的小分子化合物(EnvZ抑制剂),然后采用表面等离子共振(SPR)技术检测EnvZ抑制剂与SF-EnvZc蛋白的结合力,并采用小鼠角结膜志贺菌感染模型检测EnvZ抑制剂对福氏志贺菌株Sf9380毒力的影响。结果在10个候选EnvZ抑制剂中,化合物1、2、3能够有效地抑制SF-EnvZc蛋白的磷酸化,其IC50值分别为(70．17±5．83)、(10．18±0．86)和(37．66±9．64)μmol／L,且上述3个化合物表现出对SF-EnvZc蛋白的高亲和力,其平衡解离常数(Kd)分别为4．08、3．57和2．94μmol／L,其中化合物1和2能够明显抑制福氏志贺菌株Sf9380导致的小鼠角结膜炎症反应(由■变为-),化合物3能够明显降低其炎症反应(由■降为+),化合物1、2、3的最小有效浓度分别为12．5、12．5和100μmol／L结论筛选出3个EnvZ抑制剂,化合物1、2、3能够不同程度地抑制或降低福氏志贺菌导致的小鼠角结膜炎症反应,提示EnvZ抑制剂能够降低福氏志贺菌的毒力。

乳酸菌双组分信号转导系统

乳酸菌广泛应用于食品发酵工业中,其中有些菌种是重要的益生菌。乳酸菌中存在着双组分信号转导系统,参与乳酸菌的多种生理生化过程,是其代谢活动的重要调控机制。本文就双组分信号转导系统的组成、作用机制、类型、特点以及乳酸菌中双组分信号转导系统作一综述。

阿维链霉菌双组分信号系统的生物信息学分析

应用多种生物信息学方法,如序列比对、多序列比对、系统进化树分析、二级结构预测等,对阿维链霉菌中双组分信号系统蛋白进行鉴定分析。结果表明:阿维链霉菌中存在61个组氨酸蛋白激酶,其中30个组氨酸蛋白激酶包含了全部的保守传递器结构域。阿维链霉菌中也存在69个应答调控蛋白,主要分布在3种主要的应答调控蛋白家族中。与天蓝色链霉菌和其他微生物中双组分信号系统进行比较和对功能结构域进行分析,表明:在这些蛋白所组成48个双组分信号系统中,多个双信号调控系统与阿维链霉菌中环境刺激反应和调控相关。

隐藏嗜酸菌Acidiphilium cryptum JF-5双组分信号转导系统

为了探索隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)对多变极端矿山环境条件的感知和反应分子机制,预测和分析了隐藏嗜酸菌JF-5菌株的双组分信号转导系统(Two-component signal transduction system,TCS)的分布、结构及功能.鉴定了9对成对TCSs、2个杂合结构TCSs、3个孤儿组氨酸蛋白激酶(HK)和5个孤儿反应调节蛋白(RR);发现5个TCSs参与隐藏嗜酸菌对重金属响应转录调控;大多数HKs的N-末端具有接受信号的跨膜区、HAMP或PAS等结构域,RRs主要是OmpR亚家族,占总RRs的40%以上;从进化关系上来看,一些处在进化树同一分支上的共同聚簇TCS基因可能具有相同的进化途径.本研究结果可为研究隐藏嗜酸菌在极端环境中适应性分子机制提供新的方向.

嗜酸乳杆菌群双组分信号转导系统

为明确Lactobacillus acidophilus菌群中的双组分信号转导系统的分布及功能，采用HMMER、SMART、TMHMM、ClustalW等生物信息学手段对L.acidophilus菌群中全基因组进行扫描，对其中的双组分信号转导系统进行预测，并进行结构分析及功能预测.结果表明，L.acidophilus菌群中具有5-9个双组分信号转导系统，其中部分TCS系统调控细菌的耐酸、耐胆汁能力及细菌素分泌等益生功能密切相关的性能.

拟南芥植物中的双组分信号系统

双组分信号系统是普遍存在于原核和真核细胞中,在进化上较保守的信号转导系统,主要由组氨酸蛋白激酶和应答调控器组成。双组分信号系统在植物的生长和发育中起非常重要的作用。随着拟南芥基因组测序的完成和功能基因组的深入研究发现,在拟南芥基因组中有55种参与双组分信号系统磷酸传递的蛋白。本文应用生物信息学的基本手段,如序列比较、多个序列比对、系统进化树分析、跨膜区分析、二级结构预测等,对这些蛋白进行系统分类,结构分析,并对在信号转导中已知功能的蛋白进行归类总结,便于人们了解双组分信号系统的作用机制及其在植物中的功能。

光合菌Rhodobacter sphaeroides 601 hupT基因的克隆与功能分析

从紫色非硫光合细菌Rhodobactersphaeroides60 1的吸氢酶 (hup)基因簇中 ,克隆了hupT基因 ,并对该基因进行了测序 ,分析了由其推测的氨基酸序列的同源性。hupT基因全长 13 3 2bp ,编码一分子量约为 4 8.2 3kD的蛋白。将hupT基因引入大肠杆菌进行了体外表达。纯化基因产物HupT ,并进行HupT的自身磷酸化分析。结果表明 ,HupT属于双组份调节系统中的组氨酸蛋白激酶。将hupT基因导入光合菌Rhodobactercapsulatus吸氢酶负调节基因突变株BSE8后 ,野生型吸氢酶的表型得以恢复 ,说明所克隆的R .sphaeroides 60

Gβγ亚基介导的MAPK信号转导通路在吗啡依赖中的作用

阿片μ-受体是G-蛋白偶联受体超家族的成员，介导吗啡镇痛和成瘾作用。μ-受体被激活后与G-蛋白结合，引起Gβγ亚基与Gβγ亚基分离。Gβγ亚基是多种信号转导通路的独立活化因子。在u-受体信号转导通路中，Gβγ亚基介导的MAPK信号级联可能发挥重要作用。P13K是Gβγ亚基介导的NAPK信号级联的早期媒介物，P13K可通过酪氨酸激酶和PIP3／SH2的相互作用等激活MAPK信号通路。PkB／Akt作为联系P13K和细胞生存与增殖的中介因子，参与细胞生存的调控过程。另外，NAPK信号级联可能通过调制神经元间突触联系，参与海马长时程增强的诱导过程。因此，MAPK信号通路通过多条途径参与GPCRs介导的细胞调节过程，并可能在吗啡依赖的发生、发展过程中发挥一定的作用。

表皮葡萄球菌双组分调控系统的生物信息学分析

应用序列同源性比较及功能域分析等生物信息学手段,从表皮葡萄球菌全基因组序列中发现16对双组分调控系统以及2个相对保守的功能域(HATPase_c和REC).通过与金黄色葡萄球菌和枯草杆菌中的双组分调控系统基因比较,预测表皮葡萄球菌中同源双组分调控系统基因可能具有参与调控细菌生长、生物膜形成、毒力因子表达等重要生物学功能.对16对双组分调控系统基因的2个保守性功能域进行空间结构模建,获得4个相似的组氨酸蛋白激酶HATPase_c功能域模拟结构以及13个相似的反应调节蛋白REC功能域模拟结构,其中HATPase_c结构在AMP-PNP的结合部位形成袋状结构,而REC结构中均包含3个天冬氨酸活性位点.初步实验结果表明表皮葡萄球菌双组分调控系统保守性功能域的生物信息学分析可以为进一步开发相关治疗药物提供潜在的靶标。

革兰氏阴性菌的Cpx双组分调控系统

细菌主要通过单组分、双组分、三组分调控系统来适应外界环境变化以保证自身的正常生长和繁殖。Cpx系统是革兰氏阴性菌中普遍存在的双组分调控系统之一,作为双组分调控系统的重要一元,它由细胞膜组氨酸蛋白激酶CpxA、细胞质响应调节蛋白CpxR以及细胞周质空间辅助调节蛋白CpxP构成。本文着重介绍了Cpx系统各组分的结构特征,并结合前人的文献和我们近期的研究成果,综述了Cpx系统信号整合的最新研究进展,提出了尚待解决的问题及进一步的研究方向,为科研人员对Cpx双组分调控系统的研究提供一定的帮助。

解淀粉芽孢杆菌Q426双组分信号转导系统的生物信息学分析

[目的]分析解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)双组分信号转导系统(Two-Component Signal Transduction System,TCS)的结构、功能和分布,为挖掘解淀粉芽孢杆菌的生物功能、开发其商业价值提供理论依据。[方法]采用生物信息学方法,系统分析了由笔者实验室分离得到并完成全基因组测序的解淀粉芽孢杆菌Q426的TCS。[结果]Q426菌株所携带的HKs和RRs分别为42和40,其中成对的TCS(HK-RR)数为19,杂合的TCS(Hybrid)为1,而HKs和RRs分别为22和20,并对19对TCS中15对的生物学功能做出预测。[结论]Q426菌株的TCS涉及杆菌肽、羊毛硫抗生素和多种抗菌肽的合成,为深入研究解淀粉芽孢杆菌抗菌活性物质的合成与调控提供思路。