生物组织光学透明技术研究进展

生物组织光学透明技术是一种将完整的不透明的生物组织器官经过光学透明处理后实现高透明且完整的新技术,可进一步结合光学成像技术实现完整组织器官的荧光/吸收三维立体成像,具有传统切片技术无法替代的性能,是生物医学光子学领域的研究热点。综述了组织光学透明技术的概念、原理及具体的实现方法和步骤,介绍了其在生物医学尤其是脑科学领域的研究现状和部分成果,比较了各方法不同参数的优劣,并就未来的挑战和发展应用研究进行了讨论。

6种光学透明化方法在大鼠脑组织块的透明效果比较

目的比较6种光学透明化方法对大鼠脑组织块的透明效果。方法选取14只SD大鼠脑分别采用iDISCO、SeeDB、CUBIC、SCALEVIEW-A2、CLARITY-CUBIC、Passive-CLARITY的方法进行透明化处理。结果对照组PBS透明灰度值为13.031±0.586,iDISCO、SeeDB、CUBIC、SCALEVIEW-A2、CLARITY-CUBIC、passiveCLARITY分别为6.447±0.574、11.690±0.909、2.318±0.986、8.118±1.026、8.591±0.384、4.198±0.182,除SeeDB组外(P=0.185),其余各组均较PBS组差异均有显著性(P<0.01),CUBIC分别与各组有显著性差异(P<0.01)。透明化处理后,iDISCO、SeeDB、CUBIC、SCALEVIEW-A2、CLARITY-CUBIC、Passive-CLARITY面积改变分别为(-30.02±2.39)%、(19.74±4.09)%、(14.7±3.92)%、(10.7±5.55)%、(23.01±4.19)%、(66.51±5.68)%,各组面积改变均较iDISCO组、Passive-CLARITY组有显著性差异(P<0.01)。结论除SeeDB外,各组方法均能达到透明效果,CUBIC方法在大鼠脑组织块的透明效果优于其他各组,iDISCO处理后面积缩小,而Passive-CLARITY处理后变得膨胀。

亲水性透明化技术在骨组织的应用

在整体组织上实现细胞及亚细胞水平的三维成像是现代组织病理发展的新趋势。光透明化技术的出现打破了组织表面阻隔光透射的壁垒,结合现代光学成像技术可在组织器官上获取包含细胞及亚细胞层面在内的三维图像信息。亲水性透明化方案具有使用简单、无毒性和对荧光蛋白保护性高等特点,是应用最为广泛的组织透明化工具。但其对硬组织渗透性差,折射率匹配性差,在对包含骨在内的硬组织的应用上受到了极大的限制。本文综述亲水性透明化方案针对硬组织透明的发展历程,以推动透明化技术的革新。

一种用于宽场荧光显微镜下成像的皮肤厚片免疫荧光染色方法

目的通过改良免疫荧光染色方案,使皮肤厚切片能在宽场荧光显微镜下荧光成像。方法选择成年雄性SD大鼠5只,经Zamboni固定液灌注固定后取后肢足底皮肤,冷冻切片,片厚40μm,行神经纤维标志物PGP9.5免疫荧光染色。首先比较染色后用梯度甘油溶液透明与不经甘油透明对皮肤厚片成像深度的影响;继之在染色后甘油透明的基础上,检测染色前二甲基亚砜(DMSO)处理不同时间(10min、15min和30min)对皮肤背景信号的影响。此外,采用体视显微镜检测梯度甘油透明对切片形态的影响。最后,用上述DMSO-甘油改良染色法进一步对神经纤维其他标志物NF 200和外周蛋白分别进行染色。结果经染色后甘油透明的切片其成像深度显著大于常规染色的切片(P<0.01);在甘油透明的基础上,先用DMSO处理能有效降低皮肤背景着色,时间以15min为佳;梯度甘油处理并不会造成皮肤厚片的形态改变;DMSO-甘油改良染色法也能有效显示皮肤NF200和外周蛋白免疫反应阳性的神经纤维。结论经本改良方法染色的皮肤厚片能在宽场荧光显微镜下良好成像。