组织块法重复培养牙周膜干细胞的生物学功能研究

目的对同一块牙周膜组织重复培养获得的原代牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell,PDLSC)的生物学特性和功能进行比较,评价重复培养得到的PDLSC能否用于实验研究和临床治疗。方法收集正畸治疗拔除的前磨牙,组织块法进行PDLSC原代培养。首次传代后收集剩余的牙周膜组织重复进行组织块法细胞培养,多次培养获得原代PDLSC。每次培养的原代PDLSC进行扩增培养,选取第1、3、5次培养获得的PDLSC分为A、B、C组。分别绘制细胞增殖曲线,STRO-1表面标记物表达的检测鉴定,细胞周期分布检测和观察成骨诱导,测定各组PDLSC端粒长度和端粒酶表达水平。结果三组细胞的STRO-1表达均呈阳性;生长趋势和扩增数量相似;A、B两组细胞周期分布无显著差异(P>0.05),C组与A、B组比较细胞周期分布差异显著(P<0.05);地塞米松诱导三组PDLSC成骨,21d时均有茜素红染色阳性的钙化结节;A、B两组PDLSC端粒长度、端粒酶表达水平均无显著差异(P>0.05),C组PDLSC端粒长度显著长于A、B组(P<0.05),端粒酶表达水平显著高于A、B组(P<0.05)。结论通过同一块牙周膜组织培养得到的PDLSC生物学功能相同,但在细胞安全性上是否能够用于实验研究和临床治疗有待进一步的探讨。

胰蛋白酶消化法和组织块法原代培养人包皮成纤维细胞的比较

小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)是目前国际上公认的人胚胎干细胞(hESCs)体外培养的饲养层细胞,但MEFs存在寿命短、动物源性污染等问题,需要探索适于hESCs体外培养且寿命长的人源性饲养层.采用胰蛋白酶消化法和组织块法分别原代培养人包皮成纤维细胞(hFFs),探索hFFs原代培养的最佳方法,为hFFs作为饲养层在hESCs研究中的应用提供可靠的科学依据;通过倒置显微镜下观察其生长状态和免疫细胞化学染色鉴定,结果显示两种原代培养方法获得的hFFs的形态及生物学特性均符合成纤维细胞;通过测定细胞生长曲线及MTT法检测,结果显示两种原代培养方法获得的不同代数的hFFs均具有较高的增殖活性,传代10余代仍能保持较好的细胞形态,可以制备成饲养层用于hESCs的研究.

组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞

目的培养符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。方法用组织块法行原代培养，胰蛋白酶消化法行传代培养，免 疫组织化学染色进行细胞鉴定。结果６ｄ时，细胞开始由组织块边缘向外生长；１５ｄ时，即可进行传代。角蛋白染色示细 胞纯度达９５％以上。结论组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞简便易行，可获得符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。

骨组织块法和酶消化法联合培养人成骨细胞

背景:成骨细胞培养难度大,不同培养方法得到的成骨细胞数量、纯度、增殖及分化活性各有区别。目的:探讨理想的人成骨细胞体外培养的方法。方法:取人髂骨松质骨,同时结合骨组织块法和酶消化法分离培养人成骨细胞。结果与结论:分离培养的人成骨细胞生长状态良好,纯度较高。细胞贴壁生长,形态多样化,多呈多边形、纺锤型、梭形、三角形,胞浆丰富向外伸展出生长突,具有典型的成骨细胞形态特征;细胞增殖良好,碱性磷酸酶染色及矿化结节茜素红染色阳性。说明联合骨组织块法和酶消化法可成功分离培养人成骨细胞,是进行人成骨细胞体外培养较为理想的方法。

酶解组织块法原代培养人牙周膜干细胞和牙髓干细胞

背景:酶解组织法是一种高效的原代细胞培养方法,利用该法可提高牙周膜干细胞和牙髓干细胞的培养成功率。目的:比较牙周膜干细胞和牙髓干细胞的原代培养成功率、细胞形态、生长特征,并对其进行多种细胞标志的鉴定。方法:取因正畸需要拔除健康牙20颗,其中16颗用于牙周膜干细胞原代培养,4颗用于牙髓干细胞培养。酶解组织块法培养两种细胞,MTT法检测两种细胞的生长曲线,利用RT-PCR法、细胞免疫组化法、细胞免疫荧光法鉴定两种细胞的标志。结果与结论:牙髓干细胞的原代培养成功率明显高于牙周膜干细胞,显示更快的生长能力。通过酶解组织法分离纯化的两种干细胞均显示正常的细胞形态和生长特征,表达相应的细胞标志CD105,CD73,波形丝蛋白vimitin,Stro-1,不表达角蛋白CK-17和CD45。提示酶解组织块法是一种高效的原代培养牙周膜干细胞和牙髓干细胞的方法。

悬浮组织块法分离培养SD大鼠脂肪干细胞的实验研究

目的:建立SD大鼠脂肪干细胞悬浮组织块分离培养法。方法:取正常SD大鼠股沟处脂肪组织,用悬浮组织块法和组织块贴壁法分离培养SD大鼠脂肪干细胞,观察细胞的生长状况及形态特征。取第3代对数期细胞,CCK-8法绘制其生长曲线;免疫荧光法检测其表面抗原CD29、CD44、CD45的表达情况;分别用成脂、成骨诱导培养液进行诱导分化,油红O、茜素红染色定性鉴定。结果:两种方法体外培养得到的SD大鼠脂肪干细胞形态为梭形纤维样,生长力旺盛,生长曲线为典型的"S"型;免疫荧光法检测显示第3代细胞强表达CD29、CD44,CD45表达阴性;细胞成脂诱导培养14 d后,油红O染色为阳性;成骨诱导培养14 d后,茜素红染色为阳性。结论:悬浮组织块法可以分离培养出SD大鼠脂肪干细胞,方法简便,为体外分离培养SD大鼠脂肪干细胞提供了一种新的方法。

改良组织块法体外培养人牙周膜细胞和牙髓细胞

目的:探索一种操作简单方便的人牙周膜细胞和牙髓细胞体外培养方法。方法:取12个正常恒牙牙周膜组织和28个正常恒牙牙髓组织,剪碎组织,将细胞培养专用圆形盖玻片覆盖在组织块上,用凡士林将盖玻片固定在培养皿底壁,然后加入培养液培养,待组织块周围细胞生长密集时,进行原位传代。用免疫细胞化学染色的方法鉴定牙周膜细胞的来源,RT-PCR检测牙髓细胞中牙本质涎磷蛋白基因的表达。结果:在改良组织块法中未发现有漂浮的组织块,可获得牙周膜细胞和牙髓细胞,成功率分别是91.7%和76%。获得的牙周膜细胞和牙髓细胞符合各自的形态学特征和生物学特性,生长良好。结论:本实验建立的改良组织块法解决了传统组织块法中组织块难以贴壁的问题,简化了操作步骤并具有较高的成功率,是一种培养牙周膜和牙髓细胞的可行方法。

悬浮组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞

目的:建立兔成纤维样滑膜细胞悬浮组织块分离培养法。方法:取正常兔膝关节滑膜组织,用悬浮组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞,观察细胞生长状况及形态特征,取第3代对数期细胞,CCK-8法绘制其生长曲线,免疫荧光法检测波形蛋白的表达情况,并与组织块贴壁法进行比较。结果:两种方法体外培养得到的兔成纤维样滑膜细胞形态为长梭形纤维样,细胞生长力较旺盛,生长曲线为典型的"S"形,免疫荧光检测显示第3代细胞强表达波形蛋白。结论:悬浮组织块法可以分离培养出兔成纤样维滑膜细胞,方法简便,效率高,为体外分离培养兔成纤维样滑膜细胞提供了一种新的方法。

组织块法与酶消化法培养大鼠毛囊干细胞的比较

背景:研究证实毛囊干细胞比毛囊间表皮干细胞更有增生能力,近年来受到广泛关注,成为种子细胞的研究热点。目的:比较组织块法和两步酶法培养大鼠毛囊干细胞的生物学特性。方法:体式显微镜下分离大鼠触须部的毛囊,分别用组织块法和两步酶法培养毛囊干细胞,利用反复差速贴壁法纯化细胞,定期观察细胞生长状况及形态,流式细胞仪检测第3代毛囊干细胞CD34、β1整合素的表达。结果与结论:两步酶法获得的细胞生长速度快,获得的细胞量多,而组织块法获得的细胞生长速度较慢,获得的细胞量也少。流式细胞仪分析显示酶消化法培养组PE-CD34、FITC-β1整合素的表达分别为(39.52±19.57)%和(93.46±4.73)%,组织块法培养组相应为(19.20±11.53)%和(363.57±14.42)%,两组间差异有显著性意义(P<0.05)。总的来说,两种方法均能培养出实验所需毛囊干细胞,可根据不同实验需求选择恰当的培养方法。

改良组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞

目的通过改良组织块细胞培养法,建立一种简单,可行的兔成纤维样滑膜细胞体外培养方法。方法无菌条件下取正常兔膝关节滑膜组织,剔净后剪成碎块,用灭菌滤纸吸掉组织上附着的水分,碎片接种于培养皿,观察细胞生长状况及形态特征。取第3代对数期细胞,用CCK-8法绘制其生长曲线,并用免疫荧光法检测波形蛋白的表达情况。结果体外培养的兔成纤维样滑膜细胞形态为长梭形纤维样,细胞生长力较旺盛,生长曲线为典型的"S"型,免疫荧光检测显示第3代细胞强表达波形蛋白。结论改良组织块法可以分离培养出兔成纤样维滑膜细胞,方法简便,成功率高,满足实验要求。

组织块法体外培养人胚胎神经干细胞

目的 探索体外分离、培养人胚胎脑组织神经干细胞的实用方法。方法 从人胚胎脑额叶皮层分离组织块 ,采用DMEM/F12 +N2无血清培养基 ,进行体外培养、传代。采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化后的其他细胞表型。结果 从人胚胎脑额叶皮层分离的细胞具有增殖和多向分化潜能 ,可进行传代培养 ,获得的细胞中大部分为Nestin表达阳性的细胞。诱导分化后可以出现NSE、GFAP表达阳性的细胞。结论 用上述方法分离培养的细胞具有神经干细胞的特性 ,并表达Nestin蛋白 ,认为是神经干细胞。

人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养:组织块法的优化

背景:关于人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养方法的研究很多,但是如何简便、快捷获得大量原代培养间充质干细胞的问题尚未解决。目的:探讨优化人胎盘绒毛膜间充质干细胞体外分离培养组织块法的最佳方法。方法:无菌条件下,取正常足月剖宫产胎盘绒毛膜,用匀浆器处理组织块,采用组织块法贴壁分离培养人胎盘绒毛膜间充质干细胞,经初次培养的组织块进行再次接种培养。结果与结论:用电动匀浆器处理人胎盘绒毛膜省时省力,组织分散度和去除红细胞效果好。初次培养和再次培养获得细胞的平均时间分别为(17.73±1.14)d和(10.03±1.30)d。每个Φ100 mm培养皿获得的原代细胞分别为(6.97±0.98)×10~5个和(13.82±1.44)×10~5个。获得的贴壁细胞呈典型的成纤维细胞形态,呈平行或漩涡状生长,高表达CD90、CD73、CD105,而CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR为阴性。细胞可向成骨、成脂方向诱导分化。结果表明优化的方法能够简便、快捷地处理人胎盘绒毛膜组织,获得大量的原代间充质干细胞。

改良组织块法培养原代兔耳软骨细胞

通过改良组织块细胞培养法,建立一种简单、经济、可行的兔软骨细胞系体外培养方法。从6只家兔耳缘同一部位取下6块软骨组织样,随机分为2组,改良组使用酶消化法结合组织块体外培养兔耳软骨细胞,对照组使用传统的组织块法,对比两种方法中组织块的贴壁、生长、分裂及增殖状况。与对照组相比,改良的组织块法中组织块贴壁时间从24 h缩短至6 h,贴壁后新生软骨细胞游离出的时间从48 h缩短至24 h,软骨细胞的整齐度从92%提高至98%。(p<0.05)。改良的组织块法较传统的组织块法在软骨细胞培养中具有显著优势,适于建立简易的兔耳软骨细胞系体外培养方法。

组织块法培养大鼠肠系膜小动脉的平滑肌细胞

利用贴块法成功地大量培养了大鼠肠系膜小动脉的平滑肌细胞。培养的细胞经光镜和免疫组化鉴定为平滑肌细胞。方法简便 ,经济 ,为阻力血管的细胞水平的研究提供了实验材料。

改良组织块法分离培养佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞

目的 通过改良组织块细胞培养法,建立一种简单、可行的佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞（FLS）体外培养方法并观察细胞生物学特性.方法 通过注射弗氏完全佐剂建立关节炎模型,无菌条件下取佐剂性关节炎兔膝关节滑膜组织,剔净后剪成碎块,用灭菌滤纸吸掉组织上附着的水分,碎片接种于培养皿,观察细胞生长状况及形态特征.取第3代对数期细胞,用噻唑蓝（MTT）法绘制其生长曲线,并用免疫荧光法检测波形蛋白的表达情况.结果 体外培养的佐剂性关节炎兔FLS形态为长梭形纤维样,符合FLS的生长特征,免疫荧光检测显强表达波形蛋白.结论 改良组织块法可以分离培养出兔佐剂性关节炎成纤样维滑膜细胞,方法简便,成功率高,满足实验要求.

组织块法和酶消化法培养人牙周膜细胞

目的:作者分别采用酶消化法和组织块法培养人牙周膜细胞,并对这两种方法进行比较。方法:倒置相差显微镜连续观察体外培养的人牙周膜细胞原代和传代生长情况,从形态学、免疫组化及细胞增殖方面对比两种方法培养细胞的异同。结果:两种方法培养的细胞形态大致相同,来源一致,增殖和生长曲线大体一致。组织块法培养的细胞同源性好,但初代培养时间长;酶消化法培养的细胞一次可获得的细胞量大,但容易污染,且初代培养的细胞混有较多的上皮细胞,需多次传代才能去除。结论:组织块法培养HPLFs适用于细胞纯度要求较高的实验,而酶消化法培养HPLFs 适用于短期内获得大量细胞的实验。

组织块法培养成年兔肌腱细胞

背景:体外分离培养肌腱细胞,熟悉其生物学特性是研究肌腱愈合机制、改善肌腱愈合内环境的前提和基础。目的:采用组织块法体外培养成年兔肌腱细胞,观察其细胞形态、生长增殖情况以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达。方法:无菌条件下取成年新西兰白兔双侧后肢趾屈肌腱,手术显微镜下剥离、去除肌腱外膜组织,剪成组织小块,0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶Ⅰ消化10～15min,离心去上清,将组织小块转移到培养瓶中,贴壁后加入1mL培养液,待细胞游出贴壁生长时,再加培养液继续培养,每3d换液1次,当细胞长到80%～90%融合时按1:3传代。结果与结论:一般10d左右细胞会从组织块游出贴壁生长,此时细胞多呈星形或不规则形,随着时间延长细胞逐渐增多,呈梭形的成纤维细胞样。传代细胞刚接种时圆形,4～6h开始贴壁并伸展为梭形,排列逐渐规则成群。从传代细胞的生长曲线可看出,前4d细胞生长较慢,为潜伏期,第5天后进入快速增殖期,7d以后进入平台期。免疫荧光法证实Ⅰ型胶原染色阳性,而Ⅲ型胶原染色呈阴性。结果表明采用组织块法可在体外成功培养成年兔肌腱细胞。

酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的 :提高人牙周膜成纤维细胞 (humanperiodontalligamentfibroblasts,HPLF)原代培养的成功率 ,快速建立体外细胞研究模型 .方法 :采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块 ,获取细胞 ;用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源 ,通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性 .结果 :原代培养成功率为 77.8% .获得的细胞呈梭形 ,抗波形丝蛋白染色呈阳性 ,抗角蛋白染色呈阴性 ,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性 ,生长良好 .结论 :酶消化组织块法可显著提高人牙周膜成纤维细胞原代培养成功率 ,方法可行 .

人脐带间充质干细胞生物特性比较:胰酶冷消化和组织块法体外培养

背景:以往采用胰酶冷消化法培养脐带间充质干细胞的研究较少。目的:比较两种方法体外培养人脐带间充质干细胞的生物学特性。方法:采用胰酶冷消化法和组织块法从人脐带中分离、纯化和传代培养人脐带间充质干细胞,记录首次出现贴壁细胞时间及原代培养周期,倒置相差显微镜观察脐带间充质干细胞的形态及生长情况,制作第3代脐带间充质干细胞生长曲线,流式细胞仪分析检测第3代脐带间充质干细胞表面标志的表达,第3代脐带间充质干细胞加入成神经诱导培养基诱导分化第3天行荧光免疫化学染色检测Nestin的表达。结果与结论:使用上述两种方法均可获得脐带间充质干细胞,胰酶冷消化法首次出现贴壁细胞时间早于组织块法(P<0.05);原代培养周期差异无显著性意义(P>0.05)。倒置相差显微镜下细胞均为贴壁生长,形态为成纤维细胞样,但胰酶冷消化法培养的少数原代细胞呈多角形,不规则,细胞的体积较组织块法大。组织块法获得第3代细胞的增殖速率显著快于胰酶冷消化法,在进入对数生长期后各个时间点细胞数量差异有显著性意义(P<0.05)。两种细胞具有均一的细胞表型,均表达CD29,CD105,不表达CD34,CD45。两种方法培养出来的第3代脐带间充质干细胞经诱导后,免疫荧光均显示神经干细胞特征性标志物nestin阳性表达。结果表明胰酶冷消化法与组织块法均能培养出脐带间充质干细胞,但组织块法更适合于此类细胞的培养,对细胞的伤害更低。