组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞

背景:研究显示兔脂肪干细胞的体外分离方法大多数为Ⅰ型胶原酶消化法,采用组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞尚不多见。目的:采用组织块贴壁法从兔脂肪组织中分离培养兔脂肪干细胞,并进行成脂、成骨的诱导分化。方法:采用组织块贴壁法分离出兔脂肪干细胞,进行体外培养,观察其形态特征。取对数生长期的第3代细胞,用MTT法绘制其生长曲线;流式细胞仪检测其表面抗原CD29、CD44、CD45的表达情况;分别用成脂和成骨诱导培养液诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化,油红O、茜素红染色定性鉴定。结果与结论:体外培养的兔脂肪干细胞呈梭形纤维样细胞形态,生长力旺盛。流式细胞术分析结果显示,第3代兔脂肪间充质干细胞强表达CD29,CD44,阴性表达CD45。兔脂肪干细胞经成脂诱导14 d后,油红O染色阳性;成骨诱导培养14 d后,茜素红染色阳性。提示组织块贴壁法可以分离培养出兔脂肪干细胞。

组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞的特征

目的:采用组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,并应用光镜、电镜和免疫组织化学方法观察细胞各生长时期的形态变化。方法:实验于2004-02/08在中国医科大学基础医学院药理实验室完成。选择健康清洁级Wistar大鼠30只,体质量150～180g,无菌条件下取全段主动脉中膜组织修剪成1mm×1mm大小的组织块直接贴壁于一次性塑料培养皿中,组织块间距0.5cm,保证细胞从组织块游出后有足够的生长空间并保持局部细胞密度的均匀,发现漂起的组织块及时清理,于37℃孵箱内放置1.5h左右使组织块与壁贴附后,缓慢加入改良Eagle培养液培养3～5d,待有细胞从组织块周围游出后换液。当细胞长满培养皿时即可传代。采用倒置相差显微镜和透射电镜及抗α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学方法观察主动脉平滑肌细胞的形态。绘制主动脉平滑肌细胞生长曲线,观察各生长时期的变化,并评估其培养方法的优点。结果:30只大鼠全部进入结果分析。①技术方法优点:贴块方便,直接一次性贴壁使污染机会少,随组织块生长随时清理漂起的组织块,可减少对其他组织块的毒性作用,并增加已游离出的细胞生长空间。②原代培养血管平滑肌细胞:光镜观察形态多样,大小略有差异,胞体较小,胞质折光性强。③传代血管平滑肌细胞:光镜下观察呈现特征性“峰”、“谷”状生长。电镜下观察:细胞形态不规则,胞浆内有肌丝,纵向平行排列,有密区,具备平滑肌细胞特征。免疫组织化学染色后可见细胞浆中大量平行条状棕黄染色、胞核不着色,所有细胞均染色,呈阳性。④主动脉平滑肌细胞生长曲线:血管平滑肌细胞生长曲线近似“S”形,传代后第1天细胞数有所减少,经过2d潜伏适应期后进入对数生长期,持续两三天进入平台期。结论:组织块贴壁法培养技术具有操作简便,污染机会少,有足够细胞生长空间的优点,经光镜和电镜观察培养出新的主动脉血管平滑肌细胞具有平滑肌细胞特征,免疫组织化学染色也显示所有细胞均呈阳性。传代培养后第2天进入对数生长期,持续两三天进入平台期,可产生纯度高及数量多的平滑肌细胞。

人心房成纤维细胞体外组织块贴壁培养与鉴定

从建立体外循环将进行心脏手术的风湿性心脏病患者体内无菌下取心脏停跳前右心耳组织,采用组织块贴壁法进行心房成纤维细胞的分离培养,通过光学显微镜观察培养后的细胞形态,并通过免疫细胞化学的方法鉴定所分离培养的细胞。贴壁4—6d后可见长梭形贴壁生长的细胞游离出组织块,细胞生长迅速,2—3d后即呈融合状态,细胞排列紧密,有的交叉重叠生长,胞体较大,细胞浆透明,细胞核较大,呈椭圆形,无自发性搏动。免疫细胞化学检测显示所培养细胞波形蛋白呈阳性反应。通过组织块贴壁法顺利分离人心房成纤维细胞。

改良前处理的原代组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞

目的建立改良前处理的原代组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)。方法将SD大鼠经颈椎脱臼处死断头后放入盛有75%酒精的烧杯中浸泡消毒。在无菌条件下剖开胸腹腔,取出大鼠的心肺组织,然后用非体式显微镜分离方法分离出肺动脉血管段,去除肺动脉血管外层纤维结缔组织、破坏血管内膜层内皮细胞后,用组织块贴壁法培养PASMCs,并传代、冻存和复苏,倒置相差显微镜观察细胞形态,普通免疫细胞化学法和免疫荧光法进行细胞鉴定。结果大鼠PASMCs呈典型的"峰-谷"样生长状态,细胞形态呈梭形。α-SM actin蛋白在培养的大鼠PASMCs为阳性表达,传至第4代的PASMCs成活率可达98%,生长形态未见异常改变。PASMCs细胞从-80℃冰箱中取出复苏后,生长状态良好,形态、结构稳定。结论用改良前处理的组织块贴壁法能够成功培养PASMCs,较传统组织块贴壁法更简单,培养效率高。

组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定

目的建立大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织块贴壁法。方法采用组织块贴壁法进行原代培养，胰酶消化法传代，并应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果90％的组织块接种存活，培养5代的平滑肌细胞纯度达98％以上。镜下可见培养细胞呈典型的“峰-谷”状生长，免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论组织块贴壁法培养大鼠平滑肌细胞操作简单、结果稳定、纯度较高、存活率高。

正常肝上皮样细胞的体外培养与组织块贴壁率

采用组织块培养法培养的人胚胎肝上皮细胞,于培养后第3～9天即在贴壁组织块周围长出,并可在体外较长期进行培养;传至第8代时仍能分泌甲胎蛋白(AFP),含量为15～40ng/ml。组织块培养法不失为一种较为简单、实用、经济和有效的方法,为探索胚胎细胞体外培养方法提供了可供参考、借鉴的途径、本文还认为肝上皮样新生细胞长出与组织块贴壁率密切相关,并对影响组织块贴壁率的有关因素进行了讨论。

胶原酶消化法、组织块贴壁法培养的大鼠RASMCs生长、增殖及分化对比观察

目的比较胶原酶消化法、组织块贴壁法培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞(RASMCs)生长、增殖及分化的影响。方法选择6~8周龄雄性SD大鼠6只,取胸主动脉及主动脉弓部,保留中膜备用。分别采用胶原酶消化法、组织块贴壁法培养RASMCs。采用α-肌动蛋白免疫荧光染色法鉴定RASMCs,并比较两种方法培养第0、24、36、48、60、72、84、96 h RASMCs生长情况。采用CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期。采用实时定量PCR法检测细胞表型标志基因表达,包括收缩型标志基因α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转胶蛋白(TAGLN)、肌球蛋白重链11(MYH-11)、转录因子1(SP-1)及合成型标志基因骨桥蛋白(OPN)。结果胶原酶消化法、组织块贴壁法均成功分离出RASMCs,细胞纯度均在95%以上。培养36、48、60、72 h时,组织块贴壁法分离、培养的RASMCs计数多于胶原酶消化法(P均<0.05)。培养36、48、60、72 h时,胶原酶消化法分离、培养的RASMCs活力优于组织块贴壁法(P均<0.05)。两种方法分离、培养的RASMCs G_1、G_2、S期细胞所占比例比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。胶原酶消化法分离、培养的RASMCs中α-SMA、TAGLN、MYH-11 mRNA相对表达量均高于组织块贴壁法,OPN mRNA相对表达量低于组织块贴壁法(P均<0.05)。结论胶原酶消化法、组织块贴壁法均成功分离、培养出RASMCs。胶原酶消化法分离、培养的RASMCs生长、增殖较慢,但保持收缩表型;组织块贴壁法分离、培养的RASMCs生长、增殖较快,但有向合成表型转化的趋势。

组织块贴壁法和混合酶消化法分离原代血管平滑肌细胞的表型特征比较

目的:探究组织块贴壁法、混合酶消化法分离培养的原代大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)在形态、生长、表型特征蛋白表达方面的不同,为合理使用VSMCs提供参考。方法:分别使用组织块贴壁法和混合酶消化法分离获得原代VSMCs,进行体外传代培养,观察细胞形态及细胞表型特征蛋白免疫荧光亮度。结果:混合酶消化法获得的原代VSMCs特征蛋白SMα-actin表达明显,表明在收缩表型特征方面优于组织块贴壁法,随着传代次数的增加,混合酶消化法在第7代仍部分保留收缩表型特性,而组织块贴壁法在第7代已丧失收缩表型特性,转变为合成型。结论:混合酶消化法在获得较稳定的收缩表型VSMCs方面比组织块贴壁法更具有优势,各实验室应根据自身的实验条件和实验设计准确选择。

组织块贴壁法提取胎盘、脐带和胎膜间充质干细胞效果观察

目的为临床移植组织工程等提供足够数量的种子细胞。方法利用组织块种植贴壁培养法提取胎盘、脐带和胎膜原代间充质干细胞,观察细胞形态、最早爬出时间,计算提取成功率及鹅卵石样细胞集落比例;MTT法检测传代前和传代后细胞生长曲线。结果原代培养细胞形态呈长梭形和卵圆形,传代后为均一长梭形;胎膜来源细胞最早爬出,胎盘次之,脐带最晚,且脐带来源原代提取成功率较低、鹅卵石样细胞集落比例大。生长曲线表明传代初细胞处于缓慢增殖期,胎膜来源细胞生长较为迅速,P5代时三种来源细胞进入对数增长期,增殖均旺盛。结论组织块种植贴壁培养法可成功提取间充质干细胞;提取的干细胞传代培养后细胞形态单一,增殖旺盛,可为临床移植组织工程等提供足够数量的种子细胞。

改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞

目的采用改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUCMSCs）。方法无菌条件下取足月婴儿脐带，采用改良组织块贴壁法分离间充质干细胞，台盼蓝染色法计数单个核细胞数，倒置相差显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞周期及免疫表型。结果原代hUCMSCs的数量为（1-5）×10 5个。培养至8d，组织块边缘处有单细胞爬出；培养至2周，贴壁生长的细胞散在分布或形成小克隆；培养至20d，细胞呈梭型、三角形或多角形。培养第20天的原代hUCMSCs的G。／G，期细胞占88．12％，S期细胞占1．23％，G2／M期细胞占10．65％，大多数细胞处于细胞增殖的潜伏期，CD105阳性率为97．65％，CD34阳性率为2．54％。结论采用改良组织块贴壁法分离了hUCMSCs，其生物学特性与骨髓间充质干细胞相似，为其临床应用奠定了基础。

组织块重复贴壁使用在原代细胞培养中的实验意义

目的旨在提高采用人脐静脉组织块贴壁法进行平滑肌细胞原代培养组织块的重复利用率,进而缩短采用细胞培养进行实验的培养周期。方法以改良人脐静脉平滑肌细胞贴壁培养法为基础,当原代培养细胞(对照组)进行第1次细胞传代后,将培养组织块再次接种于新培养瓶中继续培养(实验组),分别记录两组细胞爬出时间、第1次传代时间、以及第1次传代后24、48、72、96h的细胞计数,通过倒置显微镜对两组细胞进行形态学观察,采用抗α-actin免疫细胞化学方法,对两组传代细胞的类型和性质进行鉴定。结果与对照组比较,实验组细胞爬出时间及第1次传代时间均明显缩短(P<0.05);两组第1次传代后24、48、72、96h细胞计数差异均无统计学意义(P>0.05);两组细胞形态经α-actin鉴定差异无统计学意义。结论人脐静脉组织块重复贴壁培养后,经传代其细胞数量、细胞形态与原代组织块贴壁培养的细胞差别均无统计学意义。

改良贴壁组织块法与改良Ⅰ型胶原酶消法对成骨细胞增殖效果的比较研究

目的 比较改良贴壁组织块法与改良Ⅰ型胶原酶消法对SD大鼠颞下颌关节髁突软骨下骨成骨细胞的增殖效果.方法 取10只出生1 -3dSD乳鼠颞下颌关节髁突软骨下骨,将骨片平分成2份,分别采用改良贴壁组织块法和改良Ⅰ型胶原酶消法培养颞下颌关节髁突成骨细胞,并标记为Ⅰ组和Ⅱ组,通过细胞形态学观察、HE染色、ALP染色鉴定成骨细胞.取第4代成骨细胞进行细胞计数、MTT生长曲线及流式细胞仪周期分析,比较2种原代培养方法对成骨细胞增殖能力的异同.结果 （1）Ⅰ组和Ⅱ组培养的细胞经鉴定均为成骨细胞; （2） Ⅱ组成骨细胞总量约为Ⅰ组细胞总量的1.5倍; （3） Ⅱ组成骨细胞MTT生长曲线较Ⅰ组细胞提前2d进入对数生长期及达到生长高峰; （4）2组细胞在达到第4代时,细胞周期含量差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 改良贴壁组织块法和改良Ⅰ型胶原酶消化法均适用于颞下颌关节软骨下骨成骨细胞的培养,但改良Ⅰ型胶原酶消化法可以更快速有效地获得大量成骨细胞.

马身猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养与鉴定

为研究马身猪体细胞的生物学特性,试验以3日龄马身猪耳缘组织为材料,采用组织块贴壁法建立马身猪耳缘组织成纤维细胞系,并对体外获得的细胞系进行生物学特性检测。结果表明,获得的马身猪耳缘组织成纤维细胞系符合成纤维细胞的基本特征,细胞贴壁生长,呈典型的梭形、星形和多边形,细胞汇合成单层的时间为10~13d,生长曲线呈S型,中期染色体二倍体(2n=38)占主体,约占细胞总数的84%,符合细胞建系的要求;脂质体(Lipofectamine^(TM)2000)转染绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-C1)的转染效率为25%。马身猪耳缘组织成纤维细胞系的成功建立为地方猪种遗传资源的保护开辟了新的方法。

不同仔猪血清浓度对金华猪耳缘组织成纤维细胞体外培养的影响

目的探讨不同仔猪血清浓度对金华猪耳缘组织成纤维细胞体外培养的影响,初步确定体外培养时仔猪血清浓度。方法采用组织块贴壁培养法在含5%、10%、15%浓度的仔猪血清培养基中培养,观察其细胞的形态,并采用MTT法进行细胞增殖试验。结果含10%、15%仔猪血清培养液相对于含5%仔猪血清培养液的条件下,细胞从组织块迁移出来时间短,传代的成纤维细胞,增殖迅速,细胞活力强,MTT值明显增高(P <0. 05),10%血清与15%血清比较,差异无显著意义(P> 0. 05)。结论说明在10%仔猪血清浓度的条件下,采用组织块贴壁培养法进行体外培养,传代细胞活力强、增殖迅速。

不同血清浓度对金华猪耳缘组织成纤维细胞体外生长的影响研究

试验研究了不同血清浓度对金华猪耳缘组织成纤维细胞体外生长的影响,初步确定体外培养的适宜血清浓度。采用组织块贴壁培养法在不同血清浓度的培养基中进行条件培养(体积分数为5%、10%、15%),观察细胞形态,采用MTT法进行细胞增殖试验。结果表明,含10%、15%血清培养液相对于含5%血清培养液条件下,细胞从组织块迁移出来的时间较短,培养成纤维细胞生长、增殖迅速,细胞活力较强,MTT值明显增高(P<0.05),而10%血清与15%血清比较,则差异不显著(P>0.05)。

两种奶牛真皮成纤维细胞分离培养方法的比较

为了比较两种体外分离和培养奶牛真皮成纤维细胞方法,采集奶牛蹄部真皮组织,通过组织块贴壁法和双酶消化法(胰蛋白酶-Ⅰ型胶原酶)分离原代奶牛真皮成纤维细胞,通过传代培养进一步纯化并扩增。利用显微镜观察细胞形态及生长特性,MTT法用于绘制细胞生长曲线,利用细胞免疫荧光技术检测其表面标志物,鉴定细胞纯度。倒置显微镜下观察,贴壁后第6天有细胞爬出,形态多呈长梭形,排列紧密呈漩涡状或束状;双酶消化组第2天有长梭形细胞生长,混杂少量上皮细胞生长。生长曲线图表示,组织块贴壁组细胞生长速度较快。免疫化学荧光检测第四代奶牛真皮成纤维细胞,波形蛋白呈阳性表达,角蛋白-18呈阴性表达,表示细胞纯度较高。两种方法均能分离出奶牛真皮成纤维细胞,与双酶消化法相比,组织块贴壁法分离的细胞纯度更高,活性更佳,增殖周期更短,提示组织块贴壁法是分离培养奶牛真皮成纤维细胞的首选方法。

猪视网膜上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立猪视网膜上皮细胞(PRECs)的分离纯化及传代培养方法。采用组织块贴壁法和消化法分离猪视网膜细胞(PRCs),经差速消化法纯化细胞,筛选确定最优培养条件并鉴定细胞生物学特性。结果:消化法分离的细胞约1周长成单层,组织块贴壁法约2周长满单层,但活力更高;PRCs主要形态为长梭形和大理石样,呈现为2种形态细胞混合生长;差速消化法纯化细胞后,经间接免疫荧光鉴定细胞角蛋白(CK18和CK19),确定该细胞为上皮细胞;细胞接种猪圆环病毒2型(PCV2)可产生明显病变。综上,本试验成功分离获得PRECs,含胎牛血清浓度为12%的α-MEM为最优培养基,该细胞支持PCV2增殖并产生明显的细胞病变,为进一步建立稳定传代的猪视网膜上皮细胞系及研究PCV2感染及致病机理提供基础。

磁性分离法高效快速培养原代C57BL/6J小鼠眼动脉平滑肌细胞

目的建立一种高效、快速地培养原代C57BL/6J小鼠眼动脉平滑肌细胞(OASMC)的磁性分离法。方法综合组织块贴壁法和酶消化法2种方法,通过优化胶原蛋白酶、琼脂糖氧化铁(Ⅱ,Ⅲ)磁性纳米粉末(以下简称铁粉)配方和铁粉粒径等关键实验环节,培养高纯度OASMC。原代OASMC培养和鉴定步骤:在无菌条件下,向小鼠左心室依次注入4℃PBS、琼脂糖铁粉混悬液,在解剖显微镜下分离出眼动脉。将其划至长为1.0~1.5 mm大小的组织块,用胶原蛋白酶消化45 min后,采用磁力分离器将眼动脉组织块从胶原蛋白酶中分离出来,均匀接种于培养皿中,置于37℃、5%CO_(2)条件下培养,待细胞生长至85%~90%时进行传代。对第3~7代细胞进行形态学及免疫荧光染色鉴定。结果通过改变不同条件确定了最佳实验条件:胶原蛋白酶与M199培养基比例为0.0015 g∶6 mL,胶原蛋白酶消化时间为45 min,铁粉粒径为5μm,琼脂糖与铁粉的比例为0.05 g∶0.05 g;琼脂糖铁粉混悬液的温度为37℃,注射器型号为0.6 mm×25 mm TWLB。原代培养2 d后可见眼动脉组织块周围有长梭形细胞爬出,呈放射状分布。培养7 d后,通过更换新的培养基铁粉逐渐减少,细胞生长速度加快,细胞形态呈现典型长梭形。免疫荧光染色结果显示所培养的OASMC表达α-平滑肌肌动蛋白。结论此方法培养原代C57BL/6J小鼠OASMC具有快速、高效、细胞纯度高等特点,为眼动脉相关疾病的药物活性筛选奠定了基础。

驴皮成纤维细胞的体外培养研究

试验旨在比较不同培养方法对驴皮成纤维细胞培养的效果,以便建立其体外高效快速的培养体系。采集6~7岁健康的新疆驴真皮组织,分别用组织块贴壁法和双酶消化法对驴皮成纤维细胞进行原代培养,并检测分析细胞的生长特点、生长速度、细胞周期与支原体污染等指标。结果显示,双酶消化法(0.25%胰酶处理1h,再用0.5%胶原蛋白酶Ⅰ处理6h)培养驴皮组织3d后,成纤维细胞进入了对数增殖期,而组织块贴壁法则需要15d;细胞周期经流式分析发现,处于G0/G1期与S+G2+M期的细胞均约为50%,其余5.17%细胞处于凋亡期,表明大多细胞处于分裂增殖的活跃期,细胞具有很强的活力;试验中培养的细胞均无支原体污染。综上,应用双酶消化法可快速、高效地建立驴皮成纤维细胞体外培养体系。

大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养与鉴定

目的:建立一种可行的原代血管平滑肌细胞(VSMC)培养方法。方法:严格无菌操作环境下取大鼠胸主动脉及腹主动脉中层组织,通过组织块贴壁法进行原代培养,胰酶消化法进行传代,应用倒置相差显微镜对不同培养时间的细胞进行形态学观察,使用免疫荧光法对培养细胞进行鉴定。结果:原代培养第4~6天时,组织块周围开始有长梭形细胞爬出;第7~9天时,细胞爬出较少的呈网状生长,组织块周围细胞爬出较多的呈漩涡状生长,致密排列呈束状;第10~14天时,细胞呈典型的"峰—谷"样结构,相互融合达80%,此时传代细胞生长速度增快,细胞变大,折光性减弱,免疫荧光染色鉴定可见VSMC特异性的α-平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)表达,表达的阳性细胞在95%以上。结论:成功建立一种可行的原代VSMC培养方法。