组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞的特征

目的:采用组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,并应用光镜、电镜和免疫组织化学方法观察细胞各生长时期的形态变化。方法:实验于2004-02/08在中国医科大学基础医学院药理实验室完成。选择健康清洁级Wistar大鼠30只,体质量150～180g,无菌条件下取全段主动脉中膜组织修剪成1mm×1mm大小的组织块直接贴壁于一次性塑料培养皿中,组织块间距0.5cm,保证细胞从组织块游出后有足够的生长空间并保持局部细胞密度的均匀,发现漂起的组织块及时清理,于37℃孵箱内放置1.5h左右使组织块与壁贴附后,缓慢加入改良Eagle培养液培养3～5d,待有细胞从组织块周围游出后换液。当细胞长满培养皿时即可传代。采用倒置相差显微镜和透射电镜及抗α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学方法观察主动脉平滑肌细胞的形态。绘制主动脉平滑肌细胞生长曲线,观察各生长时期的变化,并评估其培养方法的优点。结果:30只大鼠全部进入结果分析。①技术方法优点:贴块方便,直接一次性贴壁使污染机会少,随组织块生长随时清理漂起的组织块,可减少对其他组织块的毒性作用,并增加已游离出的细胞生长空间。②原代培养血管平滑肌细胞:光镜观察形态多样,大小略有差异,胞体较小,胞质折光性强。③传代血管平滑肌细胞:光镜下观察呈现特征性“峰”、“谷”状生长。电镜下观察:细胞形态不规则,胞浆内有肌丝,纵向平行排列,有密区,具备平滑肌细胞特征。免疫组织化学染色后可见细胞浆中大量平行条状棕黄染色、胞核不着色,所有细胞均染色,呈阳性。④主动脉平滑肌细胞生长曲线:血管平滑肌细胞生长曲线近似“S”形,传代后第1天细胞数有所减少,经过2d潜伏适应期后进入对数生长期,持续两三天进入平台期。结论:组织块贴壁法培养技术具有操作简便,污染机会少,有足够细胞生长空间的优点,经光镜和电镜观察培养出新的主动脉血管平滑肌细胞具有平滑肌细胞特征,免疫组织化学染色也显示所有细胞均呈阳性。传代培养后第2天进入对数生长期,持续两三天进入平台期,可产生纯度高及数量多的平滑肌细胞。

茶细胞培养法生产茶氨酸的技术研究——茶愈伤组织的诱导体系建立

对相同培养条件的福鼎大毫、福云6号两品种的叶根外植体材料进行了茶愈伤组织绣导研究。结果表明,不同品种、不同部位的外植体愈伤组织生长情况有着明显的差异。福鼎大毫嫩茎愈伤组织绣导率较高,其组织生长情况也较好,而两个品种都表明嫩茎的愈伤组织诱导率高。

改良前处理的原代组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞

目的建立改良前处理的原代组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)。方法将SD大鼠经颈椎脱臼处死断头后放入盛有75%酒精的烧杯中浸泡消毒。在无菌条件下剖开胸腹腔,取出大鼠的心肺组织,然后用非体式显微镜分离方法分离出肺动脉血管段,去除肺动脉血管外层纤维结缔组织、破坏血管内膜层内皮细胞后,用组织块贴壁法培养PASMCs,并传代、冻存和复苏,倒置相差显微镜观察细胞形态,普通免疫细胞化学法和免疫荧光法进行细胞鉴定。结果大鼠PASMCs呈典型的"峰-谷"样生长状态,细胞形态呈梭形。α-SM actin蛋白在培养的大鼠PASMCs为阳性表达,传至第4代的PASMCs成活率可达98%,生长形态未见异常改变。PASMCs细胞从-80℃冰箱中取出复苏后,生长状态良好,形态、结构稳定。结论用改良前处理的组织块贴壁法能够成功培养PASMCs,较传统组织块贴壁法更简单,培养效率高。

组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定

目的建立大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织块贴壁法。方法采用组织块贴壁法进行原代培养，胰酶消化法传代，并应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果90％的组织块接种存活，培养5代的平滑肌细胞纯度达98％以上。镜下可见培养细胞呈典型的“峰-谷”状生长，免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论组织块贴壁法培养大鼠平滑肌细胞操作简单、结果稳定、纯度较高、存活率高。

改良酶消化法体外培养、纯化分离人颞下颌关节滑膜A型细胞

目的探讨获取人颞下颌关节滑膜A型细胞的较佳方法,为A型细胞的进一步研究奠定基础。方法分别用组织块法、传统酶消化法与改良的酶消化法培养滑膜细胞,观察培养3 d、7 d、2周、4周时细胞生长情况,记录首次传代时间。通过免疫组化检测衬里层细胞CD68、组织蛋白酶S的表达来检测A型细胞吞噬功能。结果滑膜组织块法接种约7 d后部分组织块周围有细胞游离出来,约4周后滑膜细胞长势接近80%融合密度,可进行首次细胞传代。传统酶消化法细胞贴壁缓慢,4周时才能观察部分细胞团形成,向周围呈放射状生长,约6周后才可首次传代。改良酶消化法接种3 d后,光镜下观察部分单个细胞贴壁,有一些胶原酶未消化完全而又能经过研磨透过滤网的微小组织块或细胞团块,在贴壁后迅速向周围增殖,约2周后可首次传代,3周后再次传代的细胞量与组织块法4周后首次细胞传代时间相同。免疫组化检测CD68有阳性表达,细胞位于靠近关节腔侧,组织蛋白酶S未见阳性表达。结论改良的酶消化法培养对比组织块法、传统酶消化法,在获得相同细胞量的基础上,缩短了原代细胞培养时间。改良酶消化法传代时A型细胞尚在存活期间,给后期A型细胞纯化分离奠定了基础。巨噬细胞标志物Cathepsin S在A型细胞上无表达,提示A型细胞由于体内局部环境的作用,已有别于巨噬细胞。

组织贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞的探讨

目的 :探讨分离、培养大鼠主动脉平滑肌细胞 (VSMC)的方法 ,为研究损伤性血管疾病提供有用的体外研究模型。方法 :用组织贴壁、反转干涸的方法分离、培养大鼠主动脉平滑肌细胞并进行传代培养。采用形态学和抗α-SM -actin免疫组织化学鉴定证实为SVMC。结果 :细胞呈VSMC特征性“峰”“谷”状生长 ,历次原代培养经鉴定均为高纯度的VSMC。经传代培养至 2 0代 ,细胞维持原有生长性状 ,细胞活力未见减低。结论 :组织贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞具有简便、易行、细胞损伤小、活力及纯度高的优点 ,是研究损伤性血管疾病良好的体外研究模型。

组织块贴壁法提取胎盘、脐带和胎膜间充质干细胞效果观察

目的为临床移植组织工程等提供足够数量的种子细胞。方法利用组织块种植贴壁培养法提取胎盘、脐带和胎膜原代间充质干细胞,观察细胞形态、最早爬出时间,计算提取成功率及鹅卵石样细胞集落比例;MTT法检测传代前和传代后细胞生长曲线。结果原代培养细胞形态呈长梭形和卵圆形,传代后为均一长梭形;胎膜来源细胞最早爬出,胎盘次之,脐带最晚,且脐带来源原代提取成功率较低、鹅卵石样细胞集落比例大。生长曲线表明传代初细胞处于缓慢增殖期,胎膜来源细胞生长较为迅速,P5代时三种来源细胞进入对数增长期,增殖均旺盛。结论组织块种植贴壁培养法可成功提取间充质干细胞;提取的干细胞传代培养后细胞形态单一,增殖旺盛,可为临床移植组织工程等提供足够数量的种子细胞。

组织块法培养大鼠颌下腺细胞的实验研究

目的探讨组织块法培养大鼠颌下腺细胞(RSGC)的方法与细胞生长的特点。方法采用组织块法培养RSGC,使用酶消化法和差速贴壁法进行细胞纯化,免疫组织化学SABC方法进行细胞角蛋白-8免疫组化染色,进行细胞来源鉴定。倒置显微镜下进行形态学观察,取第2代RSGC,FDA-PI双色荧光法检测细胞活力,MTT法绘制生长曲线。结果细胞角蛋白-8染色阳性。倒置显微镜下,细胞主要呈3种形态,为圆形亮细胞、多角形暗细胞、梭形暗细胞。细胞活力>95%,生长曲线表示细胞5d开始进入对数生长期。结论此方法简便,易操作,获得了大量的RSGC,为颌下腺细胞作为种子细胞的颌下腺组织工程研究提供了实验基础和理论依据。

组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞

目的培养符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。方法用组织块法行原代培养，胰蛋白酶消化法行传代培养，免 疫组织化学染色进行细胞鉴定。结果６ｄ时，细胞开始由组织块边缘向外生长；１５ｄ时，即可进行传代。角蛋白染色示细 胞纯度达９５％以上。结论组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞简便易行，可获得符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。

组织块法与酶消化法培养大鼠毛囊干细胞的比较

背景:研究证实毛囊干细胞比毛囊间表皮干细胞更有增生能力,近年来受到广泛关注,成为种子细胞的研究热点。目的:比较组织块法和两步酶法培养大鼠毛囊干细胞的生物学特性。方法:体式显微镜下分离大鼠触须部的毛囊,分别用组织块法和两步酶法培养毛囊干细胞,利用反复差速贴壁法纯化细胞,定期观察细胞生长状况及形态,流式细胞仪检测第3代毛囊干细胞CD34、β1整合素的表达。结果与结论:两步酶法获得的细胞生长速度快,获得的细胞量多,而组织块法获得的细胞生长速度较慢,获得的细胞量也少。流式细胞仪分析显示酶消化法培养组PE-CD34、FITC-β1整合素的表达分别为(39.52±19.57)%和(93.46±4.73)%,组织块法培养组相应为(19.20±11.53)%和(363.57±14.42)%,两组间差异有显著性意义(P<0.05)。总的来说,两种方法均能培养出实验所需毛囊干细胞,可根据不同实验需求选择恰当的培养方法。

改良组织块法体外培养人牙周膜细胞和牙髓细胞

目的:探索一种操作简单方便的人牙周膜细胞和牙髓细胞体外培养方法。方法:取12个正常恒牙牙周膜组织和28个正常恒牙牙髓组织,剪碎组织,将细胞培养专用圆形盖玻片覆盖在组织块上,用凡士林将盖玻片固定在培养皿底壁,然后加入培养液培养,待组织块周围细胞生长密集时,进行原位传代。用免疫细胞化学染色的方法鉴定牙周膜细胞的来源,RT-PCR检测牙髓细胞中牙本质涎磷蛋白基因的表达。结果:在改良组织块法中未发现有漂浮的组织块,可获得牙周膜细胞和牙髓细胞,成功率分别是91.7%和76%。获得的牙周膜细胞和牙髓细胞符合各自的形态学特征和生物学特性,生长良好。结论:本实验建立的改良组织块法解决了传统组织块法中组织块难以贴壁的问题,简化了操作步骤并具有较高的成功率,是一种培养牙周膜和牙髓细胞的可行方法。

组织块结合酶消化法培养婴幼儿血管瘤内皮细胞

目的:探讨血管瘤内皮细胞体外培养的方法并观察其生物学特性。方法:收集新鲜手术切除的婴幼儿血管瘤标本,采用组织块结合酶消化法培养内皮细胞,免疫组化EnVision法对培养的细胞进行鉴定;流式细胞仪FITC-CD34检测内皮细胞纯度;相差显微镜下观察血管瘤内皮细胞的生物学特性。结果:共收集血管瘤标本14例,有8例成功培养出内皮细胞,内皮细胞呈现两种形态:多角形和梭形,经免疫组化鉴定为内皮细胞;培养的细胞中CD34+细胞数为76.28%;血管瘤内皮细胞有明显的"管腔形成"。结论:组织块结合酶消化法能成功培养较纯的婴幼儿血管瘤内皮细胞,培养的内皮细胞具有某些生物学特性。

改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞

目的:改进大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCS)的培养方法,了解其生长特性,为研究气道疾病提供体外研究模型。方法:大鼠麻醉后迅速分离支气管树,去除内外膜并用0.2%I型胶原酶消化后,采用改良组织贴块法培养ASMCS,应用形态学和抗SMα-action免疫细胞化学法鉴定平滑肌细胞。结果:采用改良组织贴块法培养2～6 d,细胞开始从组织块周围长出,5～8 d在组织块附近出现"谷-峰"结构,9～12 d可融合。传代细胞经SMα-action免疫组化SP法染色阳性率达95%以上。结论:改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞具有简便、易行、产量高、纯度高的优点,为研究气道疾病提供良好的体外研究模型。

人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养:组织块法的优化

背景:关于人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养方法的研究很多,但是如何简便、快捷获得大量原代培养间充质干细胞的问题尚未解决。目的:探讨优化人胎盘绒毛膜间充质干细胞体外分离培养组织块法的最佳方法。方法:无菌条件下,取正常足月剖宫产胎盘绒毛膜,用匀浆器处理组织块,采用组织块法贴壁分离培养人胎盘绒毛膜间充质干细胞,经初次培养的组织块进行再次接种培养。结果与结论:用电动匀浆器处理人胎盘绒毛膜省时省力,组织分散度和去除红细胞效果好。初次培养和再次培养获得细胞的平均时间分别为(17.73±1.14)d和(10.03±1.30)d。每个Φ100 mm培养皿获得的原代细胞分别为(6.97±0.98)×10~5个和(13.82±1.44)×10~5个。获得的贴壁细胞呈典型的成纤维细胞形态,呈平行或漩涡状生长,高表达CD90、CD73、CD105,而CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR为阴性。细胞可向成骨、成脂方向诱导分化。结果表明优化的方法能够简便、快捷地处理人胎盘绒毛膜组织,获得大量的原代间充质干细胞。

组织块培养法及胶原酶消化法分离培养豚鼠耳蜗微血管内皮细胞

目的 建立稳定的豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的培养方法。方法 采用显微解剖技术分离出豚鼠耳蜗血管纹 ,分别用组织块法及酶消化法进行培养及纯化。结果 耳蜗血管纹组织块培养后 2天 ,部分组织块边缘有散在的细胞生长 ,这些细胞逐渐增殖形成大片细胞集落 ;耳蜗血管纹组织经胶原酶消化后 1～ 3天 ,可观察到培养皿底由一些细胞组成的细胞岛 ;细胞纯化后大多呈多边形 ,致密融合时具有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观 ,经免疫组化检测其内皮细胞标志性抗原Ⅷ因子 ,95 %以上的培养细胞的胞浆中呈棕黄色阳性反应。

改良组织块法培养原代兔耳软骨细胞

通过改良组织块细胞培养法,建立一种简单、经济、可行的兔软骨细胞系体外培养方法。从6只家兔耳缘同一部位取下6块软骨组织样,随机分为2组,改良组使用酶消化法结合组织块体外培养兔耳软骨细胞,对照组使用传统的组织块法,对比两种方法中组织块的贴壁、生长、分裂及增殖状况。与对照组相比,改良的组织块法中组织块贴壁时间从24 h缩短至6 h,贴壁后新生软骨细胞游离出的时间从48 h缩短至24 h,软骨细胞的整齐度从92%提高至98%。(p<0.05)。改良的组织块法较传统的组织块法在软骨细胞培养中具有显著优势,适于建立简易的兔耳软骨细胞系体外培养方法。

小鼠角膜上皮细胞消化培养法和组织块培养法的比较研究(英文)

目的:比较小鼠角膜上皮细胞消化培养法和组织块培养法。方法:分别使用消化培养法和组织块培养法培养小鼠角膜上皮细胞。比较两种方法中小鼠角膜上皮细胞的克隆形成率(CFE)和群体倍增(PD)。通过Western blotting方法检测p63、角蛋白19以及角蛋白12的表达。结果:其中80%组织块培养法的原代培养可成功传代,而仅12%的消化培养法原代培养可成功传代;两者比较有显著性差异(P<0.05)。传代培养中,组织块培养法中55%的第一代(P1)细胞可以传代超过P10并继续稳定传代至少可传至P25。而消化培养法传代至P2即不能融合。在P1,组织块培养法细胞的CFE高于消化培养法(P=0·02);而组织块培养法P20细胞的CFE又显著高于其P1细胞(P=0.001)。免疫荧光染色显示消化培养法的P1细胞和组织块培养法的P1,P20细胞均表达p63和K19。K12仅在消化培养法的P1细胞和组织块培养法的P1中表达,而组织块培养法的P20细胞中,K12阴性表达。结论:小鼠角膜上皮细胞的培养,组织块培养法优于消化培养法。

组织块法培养大鼠肠系膜小动脉的平滑肌细胞

利用贴块法成功地大量培养了大鼠肠系膜小动脉的平滑肌细胞。培养的细胞经光镜和免疫组化鉴定为平滑肌细胞。方法简便 ,经济 ,为阻力血管的细胞水平的研究提供了实验材料。

人心房成纤维细胞体外组织块贴壁培养与鉴定

从建立体外循环将进行心脏手术的风湿性心脏病患者体内无菌下取心脏停跳前右心耳组织,采用组织块贴壁法进行心房成纤维细胞的分离培养,通过光学显微镜观察培养后的细胞形态,并通过免疫细胞化学的方法鉴定所分离培养的细胞。贴壁4—6d后可见长梭形贴壁生长的细胞游离出组织块,细胞生长迅速,2—3d后即呈融合状态,细胞排列紧密,有的交叉重叠生长,胞体较大,细胞浆透明,细胞核较大,呈椭圆形,无自发性搏动。免疫细胞化学检测显示所培养细胞波形蛋白呈阳性反应。通过组织块贴壁法顺利分离人心房成纤维细胞。