改良组织块酶消化法原代培养人牙髓干细胞的研究

目的探索应用改良组织块酶消化法原代培养人牙髓干细胞并对细胞进行鉴定。方法选取18~26岁健康人因正畸或阻生而拔除的健康、完整、无龋坏的牙齿30颗,采用改良组织块酶消化法原代培养人牙髓干细胞并通过对细胞的形态观察、细胞表面标记物检测、多向分化能力检测和生长曲线检测等方法鉴定人牙髓干细胞。结果对人牙髓组织经改良组织块酶消化法原代培养得到的细胞形态类似于成纤维细胞和间充质细胞,生长曲线为S型,细胞表面标记物检测显示间充质干细胞标记物CD29、CD44、CD90表达阳性,造血干细胞表面标记物CD34、CD45、CD106表达阴性,同时细胞具有多向细胞分化的能力。结论应用改良组织块酶消化法可以从人牙髓组织中成功原代培养人牙髓干细胞。

应用改良的组织块酶消化法体外培养人大肠癌原代细胞

目的探讨应用改良的组织块酶消化法体外培养人大肠癌原代细胞的方法.方法应用结合组织块法和Ⅳ胶原酶消化法的改良的组织块酶消化法体外原代培养人大肠癌细胞,通过对培养条件、促进贴壁、控制污染、细胞纯化等方面的探索得到了大肠癌细胞,并最终用形态学方法(瑞姬氏染色)、和免疫学方法(免疫细胞化学)鉴定所得细胞.结果经改良的组织块酶消化法体外培养的人大肠癌原代细胞,瑞姬氏染色进行细胞形态学鉴定,结果显示胞核呈紫红色,核质比明显增大,符合肿瘤细胞特征;细胞胃肠癌相关糖链抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,C A19-9)进行细胞免疫学鉴定,结果显示胞浆呈棕色,细胞CA19-9阳性.结论改良的组织块酶消化法在培养方法改良、促进贴壁、控制污染和去除杂细胞四方面进行了改进,既可快速获得游离细胞,又充分利用了未彻底消化的组织块.采用该改良的组织块酶消化法原代培养细胞成功率高,所培养的细胞进行初步鉴定证明为大肠癌细胞.

组织块结合酶消化法培养婴幼儿血管瘤内皮细胞

目的:探讨血管瘤内皮细胞体外培养的方法并观察其生物学特性。方法:收集新鲜手术切除的婴幼儿血管瘤标本,采用组织块结合酶消化法培养内皮细胞,免疫组化EnVision法对培养的细胞进行鉴定;流式细胞仪FITC-CD34检测内皮细胞纯度;相差显微镜下观察血管瘤内皮细胞的生物学特性。结果:共收集血管瘤标本14例,有8例成功培养出内皮细胞,内皮细胞呈现两种形态:多角形和梭形,经免疫组化鉴定为内皮细胞;培养的细胞中CD34+细胞数为76.28%;血管瘤内皮细胞有明显的"管腔形成"。结论:组织块结合酶消化法能成功培养较纯的婴幼儿血管瘤内皮细胞,培养的内皮细胞具有某些生物学特性。

酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的 提高人牙周膜成纤维细胞 (humanperiodontalligamentfibroblasts,HPLF)原代培养的成功率 ,快速建立体外细胞研究模型。方法 采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块 ,获取细胞 ;用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源 ,通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果 原代培养成功率为 77 8%。获得的细胞呈梭形 ,抗波形丝蛋白染色呈阳性 ,抗角蛋白染色呈阴性 ,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性 ,生长良好。结论 酶消化组织块法可显著提高人牙周膜成纤维细胞原代培养成功率 ,方法可行。

新生大鼠肝细胞分离及体外培养方法

背景:新生大鼠肝细胞是中度分化细胞,兼具肝祖细胞和成熟肝细胞的特性和功能,是研究肝细胞特性的理想细胞来源。目的:探讨新生大鼠肝细胞分离及体外培养方法。设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/08在解放军总医院普通外科研究所完成。材料:SD新生大鼠,雌雄不限,3月龄。方法:采用组织块-胰酶冷消化法和多步低速离心获取新生大鼠肝细胞,给予含体积分数10%胎牛血清的HepatoZYME-SFM培养基体外二维培养。采用相差显微镜观察、MTT分析、PAS染色和脲酶法对培养的肝细胞生长及功能进行检测和分析。主要观察指标:肝细胞形态、活性,糖原水平,培养上清中的尿素浓度。结果:分离纯化的新生大鼠肝细胞总数1.0×106～2×106/肝,活力在90%以上,光镜下肝细胞呈圆形或卵圆形,核大而圆,胞体较成熟肝细胞小。通过多步低速离心可去除红细胞、其他非实质细胞和死亡的肝细胞,其纯度可达95%以上。肝细胞活性在培养初期即缓慢上升,至第3天时开始快速增殖,第11天时达到高峰,与第1天相比差异有显著性意义(P=0),但随后又缓慢降低,到15天时与第11天相比差异有显著性意义(P=0)培养的肝细胞贴壁生长,并保持肝细胞特异细胞形态。培养至第7天的肝细胞PAS染色呈强阳性,之后阳性细胞逐渐减少,至15d时可见少量阳性细胞。培养上清中尿素在培养初期基本没有变化,培养至第7天时显著下降。结论:组织块-胰酶冷消化法和HepatoZYME-SFM培养基二维培养为种简单有效的新生大鼠肝细胞分离培养方法。

三种方法原代培养人牙周膜细胞

背景:牙周膜细胞培养是牙周细胞生物学研究的基础。牙周膜细胞原代培养因其成功率较低,一直是制约牙周细胞生物学研究的瓶颈之一。如何寻找一种简单有效的培养方法,提高原代培养成功率一直是近年来牙周细胞生物学的研究热点之一。目的:比较组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法对人牙周膜细胞的培养效果,探索一种更有效的人牙周膜细胞的体外培养方法。方法:取58例正常恒牙牙周膜组织,随机分为3组,分别采用组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法进行原代培养,再进行传代培养、倒置显微镜下观察细胞生长情况以及细胞形态;免疫组织化学鉴定波形蛋白与角蛋白;取第4代细胞,绘制生长曲线。结果与结论:酶消化结合组织块法培养成功率(35%)明显高于其他两种方法(11%和21%)。3种方法获得的细胞均符合正常人牙周膜细胞形态学特征和生物学特征,生长良好。第4代细胞生长曲线均为近似的"S"形,有明显的滞留期、对数生长期和平台期。提示实验建立的酶消化结合组织块法较为简单并具有较高的成功率,是一种培养牙周膜细胞的可行办法。

血管瘤血管内皮细胞体外分离纯化方法的优化

目的:寻找更高效的婴幼儿血管瘤内皮细胞培养方法,为婴幼儿血管瘤的研究提供基础的科研保证。方法:选取增生期婴幼儿血管瘤手术标本,采用组织块贴壁法与酶消化法结合进行原代培养;二代细胞进行流式分选,取CD31阳性的细胞继续培养。分别进行细胞形态学观察、细胞表面标记物免疫荧光鉴定、细胞表面标记物流式鉴定。结果:培养48～72h清晰可见组织块周围细胞游出,细胞核清晰,细胞呈长梭形及多边形,2周左右部分可形成"血管腔样"结构,20d可铺满平传代;细胞流式测定CD31阳性率达98.4%,VWF与CD31双阳率90.3%,免疫荧光染色CD31、VWF均呈阳性表达。结论:组织块与消化结合法经流式分选后可获得高纯度的内皮细胞,为下一步研究婴幼儿血管瘤增生消退机制奠定了基础。

改良原代大鼠骨源间充质干细胞的体外培养方法及鉴定

目的改良原代大鼠骨源间充质干细胞体外分离培养方法,以获得纯度高、增殖活力强、分化潜能大的理想工程细胞。方法基于“仿原位生态培养”方法及原理,剪取大鼠前后肢股骨、胫骨,剔除附着的肌肉、筋膜组织,完全不用冲洗骨髓腔,直接将其剪碎成约1 mm^(3)骨块后,移入0.1%Ⅱ型胶原酶中消化90 min;经洗涤、离心后,接种于培养皿中进行原代培养。当细胞融合度达80%~90%时,予0.25%胰蛋白酶消化液进行二次消化,按1:3比例进行传代培养。采用流式细胞仪检测第4代细胞表面CD分子标志物,并进行成脂、成骨诱导分化实验。结果接种48 h后,少量长梭形细胞从骨块周围爬出;96 h后,细胞逐渐融合成片;传至第4代时,细胞形态均一,以“成纤维样”细长梭形为主,融合后呈“涡旋式”生长,具有一定方向性;传至第10代,细胞形态仍基本保持不变。流式细胞仪检测结果提示CD44、CD90和CD29表达阳性,CD34、CD11b/c和CD45呈阴性表达;成脂、成骨诱导分化实验均为阳性。结论基于“仿原位生态培养”原理,采用组织块结合酶消化法,能够简单、高效分离培养出大鼠骨源间充质干细胞,值得推广。

探讨年龄因素对人黄韧带细胞原代培养的影响

目的探讨从不同年龄的人获得黄韧带组织与原代培养细胞游出之间的关系,以提高黄韧带细胞原代培养的成功率。方法采用酶消化加组织块培养法,对来自21例不同年龄腰椎管狭窄和腰椎间盘突出症患者的黄韧带组织进行黄韧带细胞原代培养,倒置相差显微镜下观察细胞从组织块迁出时间、形态和生长状态;采用细胞免疫荧光染色法对传第3代细胞进行Ⅰ型胶原和波形蛋白表达鉴定;对组织块内细胞游出率和年龄进行相关性分析。结果倒置显微镜下见黄韧带细胞形态生长良好,培养细胞的波形蛋白和Ⅰ型胶原免疫荧光化学染色均呈阳性。患者年龄与黄韧带组织块原代培养时细胞游出率之间呈负相关关系(r=-0.618,P<0.05),年轻患者黄韧带组织细胞游出率高。结论原代培养人黄韧带细胞时尽量采用年轻人黄韧带组织。