人脐带间充质干细胞生物特性比较:胰酶冷消化和组织块法体外培养

背景:以往采用胰酶冷消化法培养脐带间充质干细胞的研究较少。目的:比较两种方法体外培养人脐带间充质干细胞的生物学特性。方法:采用胰酶冷消化法和组织块法从人脐带中分离、纯化和传代培养人脐带间充质干细胞,记录首次出现贴壁细胞时间及原代培养周期,倒置相差显微镜观察脐带间充质干细胞的形态及生长情况,制作第3代脐带间充质干细胞生长曲线,流式细胞仪分析检测第3代脐带间充质干细胞表面标志的表达,第3代脐带间充质干细胞加入成神经诱导培养基诱导分化第3天行荧光免疫化学染色检测Nestin的表达。结果与结论:使用上述两种方法均可获得脐带间充质干细胞,胰酶冷消化法首次出现贴壁细胞时间早于组织块法(P<0.05);原代培养周期差异无显著性意义(P>0.05)。倒置相差显微镜下细胞均为贴壁生长,形态为成纤维细胞样,但胰酶冷消化法培养的少数原代细胞呈多角形,不规则,细胞的体积较组织块法大。组织块法获得第3代细胞的增殖速率显著快于胰酶冷消化法,在进入对数生长期后各个时间点细胞数量差异有显著性意义(P<0.05)。两种细胞具有均一的细胞表型,均表达CD29,CD105,不表达CD34,CD45。两种方法培养出来的第3代脐带间充质干细胞经诱导后,免疫荧光均显示神经干细胞特征性标志物nestin阳性表达。结果表明胰酶冷消化法与组织块法均能培养出脐带间充质干细胞,但组织块法更适合于此类细胞的培养,对细胞的伤害更低。

基于细胞生物学方法比较5种不同组织来源间充质干细胞的特征

背景:间充质干细胞的来源以及分离方法越来越多样,充分认识到这些间充质干细胞的异同,将有助于间充质干细胞在临床中更加合理规范的应用。目的:比较不同组织来源间充质干细胞的生物学特征。方法:采集剖宫产产妇在生育后脱落的脐带、胎盘以及部分脂肪组织,采用胰酶消化法或组织块贴壁法培养出底蜕膜间充质干细胞、绒毛膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带胎盘连接处间充质干细胞、脐带间充质干细胞,所用的干细胞培养基有3 种:含胎牛血清的干细胞培养基、含脐血裂解物的干细胞培养基、含无血清添加物的干细胞培养基。检测不同培养条件下的细胞直径、表面标志物以及多向分化能力,检索GEO数据库分析不同间充质干细胞的基因表达情况。结果与结论:①不同培养条件影响细胞大小和细胞周期,其中无血清培养体系培养的间充质干细胞直径偏小,而脐血裂解物干细胞培养基能够增加胎盘源间充质干细胞的直径;②5 种间充质干细胞有类似的表面标志物,都具有成骨、成软骨和成脂肪分化能力,其中脂肪间充质干细胞成脂肪分化能力更强;③脂肪间充质干细胞相比于与其他4 种干细胞在基因表达上存在较大差异,具有更复杂细胞基质成分。

新生大鼠肝细胞分离及体外培养方法

背景:新生大鼠肝细胞是中度分化细胞,兼具肝祖细胞和成熟肝细胞的特性和功能,是研究肝细胞特性的理想细胞来源。目的:探讨新生大鼠肝细胞分离及体外培养方法。设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/08在解放军总医院普通外科研究所完成。材料:SD新生大鼠,雌雄不限,3月龄。方法:采用组织块-胰酶冷消化法和多步低速离心获取新生大鼠肝细胞,给予含体积分数10%胎牛血清的HepatoZYME-SFM培养基体外二维培养。采用相差显微镜观察、MTT分析、PAS染色和脲酶法对培养的肝细胞生长及功能进行检测和分析。主要观察指标:肝细胞形态、活性,糖原水平,培养上清中的尿素浓度。结果:分离纯化的新生大鼠肝细胞总数1.0×106～2×106/肝,活力在90%以上,光镜下肝细胞呈圆形或卵圆形,核大而圆,胞体较成熟肝细胞小。通过多步低速离心可去除红细胞、其他非实质细胞和死亡的肝细胞,其纯度可达95%以上。肝细胞活性在培养初期即缓慢上升,至第3天时开始快速增殖,第11天时达到高峰,与第1天相比差异有显著性意义(P=0),但随后又缓慢降低,到15天时与第11天相比差异有显著性意义(P=0)培养的肝细胞贴壁生长,并保持肝细胞特异细胞形态。培养至第7天的肝细胞PAS染色呈强阳性,之后阳性细胞逐渐减少,至15d时可见少量阳性细胞。培养上清中尿素在培养初期基本没有变化,培养至第7天时显著下降。结论:组织块-胰酶冷消化法和HepatoZYME-SFM培养基二维培养为种简单有效的新生大鼠肝细胞分离培养方法。

不同培养方法对人脐带间充质干细胞的影响

背景:脐带干细胞培养主要来源于足月儿,常用培养方法包括组织贴块法、胰酶消化法,但是对于不同培养方法对脐带间充质干细胞的分离结果尚存在较大的争议。目的:观察不同培养方法对脐带间充质干细胞的影响。方法:取30例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带,采用组织贴壁法和胶原酶-胰酶消化法进行培养,制备细胞悬液,获得人脐带间充质干细胞进行分离培养,在流式细胞仪上测定细胞生长情况。结果与结论:(1)细胞融合情况:脐带经过组织贴壁法原代培养5 d后,细胞开始从脐带组织分离,呈现梭形,培养10 d后细胞融合达到80%,脐带经胶原酶-胰酶消化法培养5 d后,可见少量形态各异的贴壁细胞分布,纤维样细胞培养2周后培养融合才达到80%;(2)细胞生长情况:两种不同培养方法分离出的脐带间充质干细胞生长情况差异无显著性意义(P>0.05);(3)细胞鉴定结果:两种培养方法培养的细胞CD13,CD29,CD44及CD105标志物表达均为阳性。(4)结果说明:人脐带间充质干细胞采用组织贴壁原代培养法培养成功率高,优于胶原酶-胰酶消化法培养。

两种方法培养人早孕绒毛滋养层细胞的比较

背景:人早孕绒毛滋养层细胞体外培养是研究各种妊娠疾病的基础,如何获得纯度高、数量多的滋养层细胞以及如何简化实验步骤,仍是目前研究的热点。目的:寻求一种培养高纯度人早孕绒毛滋养层细胞方法。方法:取5～10周正常绒毛组织,胰酶消化和差速贴壁联合应用法与组织块培养法分别进行人早孕绒毛滋养层细胞原代培养,免疫组织化学观察细胞角蛋白7和波形蛋白的表达,进行滋养层细胞纯度的鉴定。结果与结论:两种方法均能培养出人早孕绒毛滋养层细胞,呈三角形,多边形。抗-细胞角蛋白7阳性表达,抗-波形蛋白阴性表达。胰酶消化和差速贴壁联合应用法培养细胞纯度高于组织块培养法(P<0.05)。提示胰酶消化和差速贴壁联合应用法是一种培养人早孕绒毛滋养层细胞较好的方法。

原代胃癌相关成纤维细胞的分离培养与鉴定方法比较

目的 通过优化人原代胃癌相关成纤维细胞的分离培养方法来提高分离培养细胞的纯度和效率,以期为胃癌的治疗建立相关模型。方法 采用胰酶消化法和组织块消化法相结合,二次筛网过滤、差速贴壁法分离培养人原代胃癌相关成纤维细胞,观察胃癌相关成纤维细胞的形态和生长特点。HE染色和免疫组化鉴别胃癌相关成纤维细胞的表面标志物。结果 0.25%胰酶消化3~4h后,经过筛网过滤,可以得到较少的胃癌相关成纤维细胞,过滤后的组织块继续在培养瓶中培养可以得到较多的胃癌相关成纤维细胞。胰酶消化法得到的细胞在20d后可以铺满瓶底,组织块培养法得到的细胞可以在14d铺满瓶底。结论 胃癌相关成纤维细胞在第5代后的生长速度开始缓慢,并且随着传代次数的增多,细胞的形态发生相应的改变,细胞触角增多,胞体变短。所获得的细胞ɑ-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白都是呈阳性表达,角蛋白CK-18呈阴性表达。

两种方法培养人胎盘间充质干细胞的生物特性比较

背景:胎盘间充质干细胞能够为细胞治疗提供理想的种子细胞,但其培养未曾使用过胰酶冷消化法,故对此方法进行探索,并与组织块法进行比较,从中筛选出一种方便易行、培养成功率更高的方法。目的:观察胰酶冷消化法与组织块法分离培养的人胎盘间充质干细胞的生物学特性。方法:采用胰酶冷消化法和组织块法从人胎盘中分离、纯化和传代培养人胎盘间充质干细胞(n=6)。记录胎盘间充质干细胞首次出现时间及原代培养周期,绘制第3代细胞生长曲线,流式细胞仪分析第3代细胞表面标志,检测其向成神经及成脂方向诱导分化能力。结果与结论:(1)使用上述2种培养方法均可获得胎盘间充质干细胞,胰酶冷消化法首次出现贴壁细胞时间早于组织块法(P <0.05),原代培养周期短于组织块法(P <0.05);(2)生长曲线提示在进入平台期后的各个时间点胰酶冷消化法培养的细胞数量明显多于组织块法(P<0.05);(3)2种细胞具有均一的细胞表型,均表达CD29,CD105,不表达CD34,CD45;(4)2种方法培养的胎盘间充质干细胞经诱导后均具有成神经及成脂分化潜能;(5)上述结果表明,对于胎盘间充质干细胞的培养而言,胰酶冷消化法具有明显优势。

三种方法培养慢性阻塞性肺疾病大鼠气道平滑肌细胞的比较

背景:原代培养方法被广泛应用于正常和哮喘大鼠气道平滑肌细胞的培养,但少见用于慢性阻塞性肺疾病大鼠气道平滑肌细胞培养的报道。目的:建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型,比较组织块法、酶消化法和改良组织块消化法原代培养模型大鼠气道平滑肌细胞生长情况的差异。方法:将16只清洁级雄性健康SD大鼠随机分成2组,对照组正常饲养,慢性阻塞性肺疾病组用熏烟法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型,显微镜下观察大鼠肺组织病理学特点。分别应用上述3种方法原代培养慢性阻塞性肺疾病大鼠气道平滑肌细胞,相差显微镜下观察细胞形态,用α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色鉴定细胞类型。结果与结论:经病理学证实成功构建慢性阻塞性肺疾病大鼠模型。在倒置相差显微镜下见培养的细胞表现为典型的"谷-峰状"生长。经免疫细胞化学染色后,可见胞质呈棕色阳性反应,所培养的细胞有94%以上为气道平滑肌细胞。3种方法在耗时和细胞质量方面均无明显差别,但组织块法更经济、稳定可靠和简单。

前列腺基质细胞的原代培养方法

目的:建立一种操作简单、成功率高、重复性好的前列腺增生组织原代基质细胞(PSC)培养方法。方法:采用胶原酶消化法、组织块贴壁法和胰酶消化组织块贴壁法,从70岁及以上男性的良性前列腺增生组织中分离培养PSC,通过显微镜观察比较PSC的数量、形态、培养周期,用免疫荧光染色法鉴定PSC的纯度。结果:胶原酶消化法得到的贴壁细胞少,细胞体积较小且形态无法铺展,增殖能力较弱;组织块贴壁法培养72h后细胞会从组织边缘缓慢爬出,生长周期长;胰酶消化组织块贴壁法,细胞培养7d后基本融合,折光性强,细胞多呈长梭形,通过免疫荧光染色鉴定,基质细胞纯度在95%以上。结论:利用胰酶消化组织块贴壁法建立了一种易行、高效且重复性好的前列腺增生组织基质细胞培养方法。

鱼类细胞培养的方法、条件及应用研究概述

鱼类细胞培养主要有组织块法和胰酶消化法,不同的鱼类细胞对培养基、pH以及温度等的要求不同。本文概述鱼类细胞的培养方法、条件以及应用研究进展,为鱼类细胞培养研究提供基本参考资料。

多种酶消化法分离培养气管上皮细胞方法的比较

目的比较4种不同的酶消化法在培养气管上皮细胞中的异同,改进气管上皮细胞的培养技术,为组织工程气管提供理论种子细胞。方法Dispase冷消化法(使用0.1%Dispase4℃消化18h后使用0.25%的胰酶37℃消化10min)、胰酶冷消化法(0.25%胰酶4℃消化18h)、Dispase温消化法(0.25%Dispase37℃消化10min后使用0.25%胰酶37℃消化5min)及胰酶温消化法(0.25%的胰酶37℃消化10min),用4种消化法分离、培养兔气管上皮细胞,测定分离细胞的数量、纯度及成活率。结果4种方法所得细胞数量分别为:(430600.00±628.49、430780.00±580.52、430900.00±200.00、430640.00±931.67),差异无统计学意义(P<0.05)。Dispase冷消化法较其他3种方法得到的气管上皮细胞纯度高,细胞状态好。结论Dispase冷消化法较其他3种方法所得细胞纯度高、细胞成活率高,是一种较好的气管上皮细胞体外分离培养方法。

小鼠主动脉平滑肌细胞的培养

目的建立一种小鼠主动脉平滑肌细胞体外培养方法,为相关疾病的研究提供实验材料。方法采用组织贴块法、胰酶消化法进行细胞原代及传代培养,综合运用自然纯化、机械刮除、差异贴壁法进行细胞纯化,并通过形态学特征及免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定。结果90%的组织块接种存活,第5代的平滑肌细胞纯度达98%以上。相差显微镜下培养细胞呈典型的“谷峰状”生长,免疫细胞化学染色显示特异的α平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论本法简便、可靠,培养的平滑肌细胞纯度高、性能好。

人脐带间充质干细胞分离鉴定及移植后对肺癌小鼠化疗的影响

背景:间充质干细胞具备多向分化潜,能促进细胞植入和免疫调节,研究人脐带间充质干细胞分离鉴定方法及移植后对肺癌小鼠化疗的影响能为肺癌治疗提供新的思路。目的:观察人脐带间充质干细胞分离、鉴定方法及移植后对肺癌小鼠化疗的影响。方法:取新鲜的新生儿脐带,利用组织块培养法和酶消化法分离、鉴定人脐带间充质干细胞。将Balb/C裸小鼠肺癌模型20只,随机分为化疗组和人脐带间充质干细胞移植组,两组均给予化疗治疗,人脐带间充质干细胞移植组化疗期间联合移植人脐带间充质干细胞治疗。结果与结论:(1)瘤质量、肠黏膜组织形态及血常规指标:与单纯化疗的肺癌模型小鼠相比,人脐带间充质干细胞移植组胃肠道红润、有光泽,肠黏膜光滑、完整,瘤质量和血常规指标稳定(P<0.05);(2)结果证实:通过组织块培养法和酶消化法能获得成熟的人脐带间充质干细胞,与化疗联合应用可明显减少胃肠道的损害,稳定外周血象。

鸽胚胎嗉囊成纤维细胞的分离培养及鉴定

为探究鸽嗉囊成纤维细胞的体外分离及培养方法,研究选择17日胚龄的鸽嗉囊组织,采用胰酶消化法和组织块贴壁培养法进行原代细胞分离,通过差速贴壁法纯化成纤维细胞。通过细胞形态观察、生长曲线测定和免疫荧光反应对细胞类型进行鉴定。结果表明,采用胰酶消化法分离培养30 h后细胞开始生长,采用组织块贴壁培养法的细胞培养72 h后开始从组织块边缘贴壁延伸生长;通过显微镜观察贴壁细胞呈梭型,连接紧密。对组织贴壁培养法获得的细胞传代后状态良好呈纺锤形,细胞培养48~84 h后快速生长,84 h后生长变缓;免疫荧光染色结果显示,波性蛋白染色为阳性,细胞核经DAPI染色呈现椭圆形,鉴定为成纤维细胞。成纤维细胞微丝在细胞周边及内部均丰富分布。研究表明,利用组织块贴壁培养法及胰酶消化法均能成功分离成纤维细胞,为后期深入研究嗉囊成纤维细胞功能奠定基础。

大鼠胚胎成纤维细胞的原代培养和分裂抑制

大鼠胚胎成纤维细胞(REF)可以作为培养大鼠胚胎干细胞的滋养层.对REF进行分离、原代培养、冻存和有丝分裂抑制,得出如下结论:分离REF时使用组织块生长法优于胰酶消化法;应用血清含量>40%、DMSO含量为20%的冻存缓冲液能在冻存时最大程度地降低REF所受的伤害;进行REF分裂抑制时使用丝裂霉素C处理的最适终浓度为3 ug/ml.

绒毛细胞培养方法的比较及绒毛细胞核型分析在胚胎停育中的应用

目的探讨两种绒毛细胞培养方法对绒毛细胞培养结果的影响以及其染色体核型分析在胚胎停育中的应用。方法取103例胚胎停育的绒毛细胞分别采用胰酶与胶原酶混合消化法和组织块直接培养法进行细胞培养、染色体核型分析。结果 103例绒毛组织两种方法均培养成功98例,培养成功率为95.1%,胰酶与胶原酶混合消化法比组织块培养法培养时间更短。共分析绒毛标本98例,发现异常核型42例,异常率42.86%,其中数目异常最多(39例)。结论胰酶与胶原酶混合消化法可以缩短绒毛细胞培养时间,绒毛染色体核型异常是胚胎停育的重要因素。