组织工程心脏瓣膜体外脉动反应器的初步研制

目的:探讨自行研制的体外脉动反应器应用于组织工程心脏瓣膜应力预适应的可行性。方法:根据流体力学原理,采用特殊材料自行设计制作了体外脉动反应器和预适应应力培养系统;将生物瓣置于反应器中运转,观察生物瓣的工作状态和系统的稳定性。以脱细胞猪主动脉瓣作支架,新生牛主动脉内皮细胞作种子细胞构建组织工程心脏瓣叶,静态培养4 d后,置入反应器内进行预适应处理24 h(流量由30 ml/min调至400 ml/min,频率30次/min),观察内皮细胞残留情况,并与静态培养的瓣膜相比较。结果:预适应应力培养系统能产生搏动性液体流,生物瓣正常工作,运转7 d,系统状态稳定。静态培养成功构建组织工程心脏瓣膜,内皮细胞与瓣叶支架黏附紧密,沿瓣叶表面形成单层细胞层,生长状态良好;动态培养的瓣叶内皮细胞部分被冲刷脱落,但仍有少部分细胞(6.26％)残留黏附。结论:自行设计和构建的体外脉动反应器基本能模拟体内心脏瓣膜的血流动力学,用于组织工程心脏瓣膜预适应研究具有可行性。

胶原膜与聚-β-羟基丁酯在组织工程心脏瓣膜中应用的研究

目的 :对胶原膜与聚 β 羟基丁酯在组织工程心脏瓣膜技术中的应用进行比较。方法 :对照研究胶原膜和聚 β 羟基丁酯膜在材料结构、皮下包埋和细胞生长对照实验情况。结果 :胶原膜呈网孔状结构 ,皮下包埋8周仍保持膜状结构 ,皮下包埋 8～ 12周完全降解 ,生物相容性优于聚β羟基丁酯膜。结论 :胶原膜在材料结构特征、降解率和生物组织相容性方面均优于聚β羟基丁酯 。

组织工程心脏瓣膜支架材料的血液相容性

目的:评价去细胞猪主动脉瓣、胶原-透明质酸钠复合膜、胶原膜、胶原-壳聚糖复合膜的血液相容性,展望其在组织工程心脏瓣膜支架材料中的应用前景。方法:进行体外的动态凝血试验、血小板黏附性能试验、溶血试验和体内的犬腹主动脉内移植试验的血液相容性评价。结果:4种材料的溶血率均小于5%;前3者的OD-凝血时间曲线下降缓慢且吸光度高,同时血小板黏附少且没有明显变形和伪足。腹主动脉包埋试验大体解剖只有胶原-壳聚糖复合膜形成血栓。结论:前3种材料在血液相容性方面适合组织工程心脏瓣膜的要求;胶原-壳聚糖复合膜需要改进。

人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架构建的组织工程心脏瓣膜

背景:去细胞处理的猪主动脉瓣膜植入人体后发生了免疫排斥反应,分析引起免疫排斥反应的原因是由于猪瓣膜的细胞外基质与宿主发生接触引起了免疫激活。目的:试图将人自身的细胞外基质履盖去细胞猪瓣膜表面起到隔离猪瓣膜与宿主血液成分接触的作用。同时应用免疫组化的方法验证人细胞外基质覆盖瓣膜的效果。设计、时间及地点:观察性实验,于2008-08/2009-04在解放军第二军医大学长海医院胸心外科实验室完成。材料:新鲜猪心脏瓣膜取自上海五丰上食肉联厂,采用酶消化法将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理。密度梯度离心法从健康志愿者骨髓中获取骨髓基质干细胞。方法:用人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架来构建组织工程瓣膜,再应用前期制备的抗人细胞外基质单克隆抗体,采用免疫组织化学染色鉴定人细胞外基质在体外构建的组织工程瓣膜上的黏附情况。以未构建的去细胞猪瓣叶为对照组。主要观察指标:①组织工程瓣膜上种子细胞的黏附和生长情况。②免疫组织化学法检测人细胞外基质在瓣膜上覆盖的效果。结果:光镜下观察瓣膜表面均形成了细胞层。扫描电镜所见细胞排列欠规则,未完全覆盖去细胞瓣叶表面,可见裸露的瓣膜支架。免疫组织化学方法检测构建的瓣膜表面呈阳性反应证明有人的细胞外基质黏附,而对照组呈阴性证明了检测方法具有特异性。结论:体外构建的组织工程瓣膜上检测到有人的细胞外基质黏附。

应用胶原膜构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的 :探讨应用胶原膜构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法 :扫描电镜观察材料结构特点。材料兔皮下包埋实验 ,分别于 4,6 ,8,12周观察材料的生物相容性和降解率。培养犬主动脉瓣间质细胞、主动脉壁间质细胞和皮肤成纤维细胞 ,对照其生长曲线、平滑肌α肌动蛋白表达和扫描电镜特点。将犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞种植于胶原膜上 ,观察其形态并测定细胞合成前列环素的功能。结果 :胶原膜呈网孔状结构 ,孔径 10 7μm。皮下包埋实验显示材料生物相容性好 ,体内降解时间为 12周。犬主动脉瓣间质细胞和主动脉壁间质细胞平滑肌α肌动蛋白均为部分阳性表达 ,细胞内有大量粗面内质网 ,生长曲线相似。种植实验示细胞在材料表面生长良好 ,并具有合成、分泌前列环素 (84.2 pg/ m L vs0 .4pg/ m L ,P<0 .0 5 )的功能。结论 :以胶原膜为支架体外构建组织工程心脏瓣膜细胞不仅能在材料表面生长 ,还能合成、分泌血管活性物质 ,是具有“生理功能 "的组织工程心脏瓣膜。

组织工程心脏瓣膜构建的研究新进展

在全球范围内每年约280 000个瓣膜置换术需进行[1],并且逐年增长,有研究预测到2050年需瓣膜置换术的人数将达850 000[2].我国每年也有近10万例患者接受瓣膜置换术,机械瓣膜和生物瓣膜在瓣膜置换术中的使用数量相当.然而目前的瓣膜假体存在许多问题：机械瓣有感染和血栓栓塞并发症的发生,为了防止血栓形成,需要终身抗凝治疗（如华法林）,由此而造成的出血发生率大大增加;生物瓣寿命只有10~15年,而且瓣膜开裂、瓣膜变性、瓣膜钙化等一系列问题还没有十分有效的预防措施;并且由于机械瓣和生物瓣再生、成长能力及耐用性的不足,尤其在儿童和年轻人中应用受到限制.为克服目前假体瓣膜在临床上的局限性,组织工程心脏瓣膜（tissue engineered heart valve,TEHV）应运而生.TEHV因其优良的组织相容性、耐久性及可生长性,不良反应小,具有非常大的临床应用潜能.现就TEHV的支架材料改性、种子细胞、支架材料与种子细胞的相互作用、生物反应器、临床研究以及微创TEHV植入等方面作如下综述.

组织工程心脏瓣膜构建中细胞种植的实验研究

目的 观察不同细胞种植在脱细胞猪主动脉瓣叶支架上的生长特点。方法 将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理 ,并在其上分别种植新生牛主动脉内皮细胞 (BAECs)、平滑肌细胞 (SMCs)、SMCs和 BAECs。结果 猪主动脉瓣叶中的细胞成分能完全去除 ,种植的 BAECs在脱细胞瓣叶表面形成一连续的细胞层 ,SMCs形成多层连续的细胞层 ,复合种植细胞则形成多层连续的细胞层 ;BAECs表面形成一连续的细胞层 ,其间为多层分布的SMCs,同时内皮细胞分泌前列环素 (PGI2 )的能力明显增强。结论 不同种类的细胞在脱细胞瓣叶表面均生长良好 ,并呈现不同的生长方式 ,SMCs和 BAECs复合种植有可能为今后组织工程瓣膜构建中有关细胞种植提供参考。

环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶1、3表达的影响

目的探讨环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶-1、3(matrix metalloproteinase-13、,MMP-1、3)表达的影响。方法采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备的脱细胞猪主动脉瓣膜支架作为对照组,用30 g/L环氧氯丙烷处理24 h的去细胞支架材料作为实验组。将培养的人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymalstem cells,hBMSCs)种植于脱细胞支架上的组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV),分别行石蜡包埋切片HE染色和扫描电镜观察TEHV的组织结构,并行RT-PCR测定hBMSCs分泌MMP-1、3的功能。结果hBMSCs在实验组脱细胞瓣膜表面生长良好,MMPs的表达比对照组降低。结论环氧氯丙烷处理的脱细胞猪主动脉瓣膜支架,可以抑制hBMSCs的MMP-1、3的表达。

Galectin-8蛋白对组织工程心脏瓣膜种子细胞的增殖、黏附功能的影响

目的体外研究Galectin-8在不同浓度或状态下对组织工程心脏瓣膜种子细胞增殖及黏附的影响。方法以骨髓间充质干细胞分化而来的内皮细胞作为种子细胞,离体状态下常规培养。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定不同浓度下Galectin-8作用12、24、48 h后对细胞增殖的影响;将细胞分为重组质粒p GFP-Galectin-8转染组、空质粒p GFP转染组、阴性对照组及蛋白预铺组,分别铺于96孔板中,观察相同时间段的细胞黏附数量。结果 Galectin-8 10、20、40μg/ml剂量组的细胞增殖数目均显著高于空白对照组,其中20μg/ml组表现尤为显著(P<0.05);p GFP-Galectin-8转染组的转染效率与空质粒p GFP转染组无显著差异(P>0.05),且Galectin-8的表达量显著高于空质粒p GFP转染组和阴性对照组(P<0.05);细胞种植到培养板上1、2、4 h后,蛋白预铺组相同时间的细胞黏附数量显著高于其他各组(P<0.05),p GFP-Galectin-8转染组的细胞黏附数量显著小于其他各组(P<0.05),空质粒p GFP转染组和阴性对照组的细胞黏附数量无显著差异(P>0.05)。结论 Galectin-8对内皮细胞的增殖具有促进作用,且在细胞种植前预铺蛋白固定后能够显著增加内皮细胞的黏附,而胞内Galectin-8过表达则抑制细胞黏附。

环氧氯丙烷在组织工程心脏瓣膜构建中对基质金属蛋白酶-1表达的影响

目的探讨环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1MMP-1)表达的影响。方法采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备的脱细胞猪主动脉瓣膜支架作为对照组,用加用3%环氧氯丙烷处理24小时的去细胞支架材料作为实验组。将培养的人骨髓基质干细胞(human bone marrow derivedstroma cells BMSCs)种植于脱细胞支架上构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve TEHV),分别行石蜡包埋切片、HE染色和扫描电镜观察TEHV的组织结构,并行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定BMSCs分泌MMP-1的功能。结果BMSCs在实验组脱细胞瓣膜表面生长良好,MMP-1的表达比对照组降低。结论环氧氯丙烷处理的脱细胞猪主动脉瓣膜支架,可以抑制BMSCs的MMP-1表达。

组织工程心脏瓣膜的研究进展

组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)理论上能克服机械瓣及生物瓣的不足,具有广阔的发展前景。目前组织工程心脏瓣膜的研究主要集中在瓣膜支架材料的选取及制备、种子细胞的选择和种子细胞的种植及培养等三方面。本文将分别就这三方面研究进展进行介绍,分析目前存在的问题,并对其应用进行展望。

层层静电自组装多聚电解质共混膜与组织工程心脏瓣膜细胞的黏附

背景:组织工程心脏瓣膜研究中的核心和难点是种子细胞在支架材料上的黏附。层层静电自组装技术能够将多聚阴阳离子组装成多层膜状结构增加材料表面的生物相容性。目的:拟对猪去细胞瓣膜在体外进行层层静电自组装成多聚电解质共混膜,并且检测共混膜对种子细胞黏附的效果。设计时间及地点:细胞学体外观察性实验,于2008-09/2009-02在解放军第二军医大学长海医院胸心外科实验室和复旦大学高分子科学系实验室完成。材料:新鲜猪心脏瓣膜取自上海五丰上食肉联厂,采用酶消化法将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理。密度梯度离心法从骨髓中获取骨髓单个核细胞,体外扩增培养后鉴定。方法:通过层层静电自组装技术构建20,10,5,0层的壳聚糖/透明质酸共混膜履盖在猪去细胞瓣膜支架上。将骨髓基质干细胞在涂膜支架上种植培养并检测支架对种子细胞的黏附效果。主要观察指标:扫描电镜观察、细胞计数、MTT检测组织工程心脏瓣膜上种子细胞的形态和细胞黏附效果。结果:扫描电镜观察20层壳聚糖/透明质酸多层膜样品上细胞生长情况比较好,样品上可以铺满细胞。而在组装层数为5层和10层的样品上,细胞生长的比较少。构建层数为20层的瓣叶,其细胞计数及吸光值高于10层和5层构建的瓣叶(P<0.01)。构建层数为10层和5层的瓣叶与0层比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:通过层层静电自组装技术构建的共混膜能够促进种子细胞的黏附,而且有一定的量效关系。

环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中MMP-9表达的影响

目的探讨环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9;MMP-9)表达的影响。方法采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备脱细胞猪主动脉瓣膜支架,用3%环氧氯丙烷处理48h的去细胞支架材料作为实验组;用0.2%戊二醛处理48h的去细胞支架材料作为对照组。将培养的人骨髓基质干细胞(human bone marrow mesenchy-mal stem cells;hBMSCs)种植于脱细胞支架上构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineered heart valves;TEHV),分别行石蜡包埋切片HE染色和扫描电镜观察TEHV的组织结构,免疫组化检测MMP-9表达的阳性率。结果hBMSCs在实验组脱细胞瓣膜表面生长良好,MMP-9的表达比对照组降低。结论环氧氯丙烷处理的脱细胞猪主动脉瓣膜支架,可以抑制hBMSCs的MMP-9表达,对防止组织工程心脏瓣膜钙化的形成有一定作用。

应用不同种子细胞和种植方法构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

目的:探讨不同种子细胞及种植方法对构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)的影响。方法:体外分离及培养犬主动脉瓣内皮细胞(EC)、主动脉瓣间质细胞(ISC)、骨髓间充质干细胞(BMSC)。将上述3种细胞以单纯接种和分阶段联合接种的方法种植于生物可降解材料聚羟基丁酸/聚羟基戊酸共聚物(Poly-hydroxybutyrate/hydroxyvalerate,PHBV)上,对种植细胞应用免疫组化法检测Ⅷ因子、α-SMA的表达。放免法测定细胞培养液中PG I2的含量,检测种植细胞的功能。结果:种子细胞体外培养生长良好,细胞种植于PHBV后EC组、ISC和EC分阶段联合种植组、BMSC组表面均可见细胞层形成,ISC和EC分阶段联合种植组表面见细胞呈复层生长,细胞开始向基质浸润。种子细胞BMSC组PG I2值明显低于EC组及EC+ISC组(P<0.01),EC+ISC组较EC组明显增高(P<0.01)。结论:BMSC构建TEHV从形态及功能上与EC构建TEHV有一定差距,ISC及EC分阶段联合种植构建TEHV较单纯种植EC更具有可行性。

组织工程心脏瓣膜构建的机遇与挑战

随着组织工程学的发展,构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的研究已取得初步进展,当前TEHV研究的方向主要集中于三个方面:种子细胞、生物材料及组织构建。本文就种子细胞的来源、分离、培养和鉴定,生物材料的种类、要求,TEHV的构建方法和构建环境,和TE-HV的动物实验和临床应用方面的研究进展做一概述。

干细胞用作组织工程心脏瓣膜种子细胞的进展

虽然由于生活环境的改善。风湿性心脏病已经越来越少见，但随着人类整体寿命的逐渐延长，患退行性瓣膜病的人也越来越多，有学者统计称目前每年需行约29万例瓣膜置换术，并预测到2050年，该数字会增加为现在的3倍。

去细胞组织工程心脏瓣膜再细胞化的研究进展

心脏瓣膜疾病已经成为严重威胁人类健康的疾病之一。瓣膜置换手术作为治疗心脏瓣膜疾病的重要手段已在临床上广泛应用多年,据估计每年有超过20万患者接受主动脉瓣置换手术[1-2]。目前临床上所用人工瓣膜均存在明显缺陷,机械瓣置换者需要终身抗凝治疗,具有出血栓塞等风险[3];而生物瓣耐久性差,因远期存在钙化、衰败等变化,平均使用周期仅约10~15年[4-5]。近些年研究较多的组织工程瓣膜,有望解决目前瓣膜替代物存在的问题,使植入瓣膜具有自我修复、生长的能力,这对于一些儿童患者更显得尤为重要。

组织工程心脏瓣膜支架材料的应用进展

随着组织工程学的发展,组织工程心脏瓣膜的构建研制已取得了初步的进展。在组织工程心脏瓣膜的构建研制中,支架材料是成功与否的关键因素之一,本文综述近年来作为组织工程心脏瓣膜支架的各种材料的特点,各类型材料的优缺点,以及支架材料的发展方向。