内皮祖细胞作为组织工程瓣膜内皮种子细胞的可行性研究

目的探讨利用外周血内皮祖细胞(EPCs)制备组织工程瓣膜的可行性。方法分离人外周血EPCs,采用酶-去垢剂法去除新鲜猪主动脉瓣细胞制备去细胞瓣膜支架,将培养的人外周血EPCs接种到去细胞瓣膜上。结果经酶-去垢剂法去除新鲜猪主动脉瓣细胞后,细胞成分全部去除,纤维支架保存完好。去细胞处理后瓣膜无明显细胞毒性。人外周血EPCs与去细胞瓣膜共孵育2周后,细胞紧贴瓣膜表面生长形成一层连续的单细胞层,初步生物力学测定示去细胞前与再内皮化后,瓣膜力学特性无明显改变。结论外周血分离培养扩增得到的EPCs能够再内皮化去细胞猪主动脉瓣构建组织工程瓣膜,外周血EPCs是组织工程瓣膜内皮种子细胞的新的来源。

脱细胞猪主动脉瓣膜与可降解聚合材料共同构建复合组织工程瓣膜

目的对新型复合组织工程瓣膜进行体外生物力学和动物体内移植试验,为临床应用过渡提供依据。方法以脱细胞猪主动脉瓣作为支架,用可降解聚合材料3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate,PHBHHx)涂层,构建新型复合组织工程瓣膜。(1)复合组织工程瓣膜、新鲜猪主动脉瓣和脱细胞猪主动脉瓣各12枚,用单轴生物拉伸机进行体外生物力学测试;(2)小尾寒羊10只,其中5只在全身麻醉非体外循环下接受复合组织工程瓣膜,移植到羊的肺动脉瓣位;其余接受脱细胞猪主动脉瓣作为对照。术后18周处死动物,取出移植瓣膜,进行组织学、免疫荧光染色、扫描电子显微镜检查和钙含量测定。结果复合组织工程瓣膜保持了自然瓣形态,抗拉强度显著提高(P<0.05);瓣膜柔软,表面光滑无血栓;免疫荧光染色检测,瓣膜新生内膜中内皮细胞呈CD31阳性反应,沿瓣表面连续排列,间质细胞呈现单克隆鼠抗人平滑肌actin(SMA)阳性反应;复合组织工程瓣膜钙含量明显低于脱细胞猪主动脉瓣(P<0.05)。结论复合组织工程瓣膜具有自然瓣膜的三维形态结构,良好的生物力学特性、生物相容性和细胞引导性,初步具备组织工程瓣膜雏形。

间充质干细胞构建组织工程瓣膜的生物力学性能研究

目的采用碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)联合间充质干细胞(mesenchy-mal stemcells,MSCs)构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineered heart valve,TEHV),并对其生物力学性能进行研究。方法分离培养大鼠MSCs,进行细胞鉴定后种植于去细胞瓣叶支架上。将瓣叶置于含5 ng/ml bFGF的培养液中,分别培养7 d和14 d作为实验组A和实验组B。实验组C除培养液中不添加bFGF外,其余同实验组B。对照组为大鼠肌成纤维细胞构建的TEHV。对各组TEHV进行形态学观察,生化检测和生物力学测试。结果MSCs表达CD29(94.82%)和CD44(93.59%)。各组TEHV具有相似的形态结构,DNA和羟脯氨酸含量、最大负荷、最大应力、最大应变和弹性模量的差异无统计学意义(P>0.05)。结论采用MSCs和肌成纤维细胞构建的TEHV具有相同的生物力学性能,而采用bFGF联合MSCs体外构建TEHV能在更短的时间内获得相同的生物力学性能。

外周血分离制备组织工程瓣膜内皮种子细胞的研究

目的:探讨从外周血分离制备组织工程瓣膜内皮种子细胞的方法。方法:采集正常人外周血,用密度梯度离心法分离单个核细胞(MNCs)进行体外定向培养,应用免疫组织化学和细胞流式术进行内皮细胞表面标记物检测,应用细胞荧光化学检测培养细胞的内皮细胞功能,用硝酸还原酶法测培养液中的NO, 最后进行细胞计数。结果:人外周血MNCs经体外培养,表达内皮细胞的特异性抗原,包括Ⅷ因子(VWF)、 VE-Cadherin、KDR和CD34,早期(7 d内)还表达CD133并显示出能内吞乙酰低密度脂蛋白(acLDL)以及释放NO的内皮细胞特性,培养10 d后细胞融合生长,20 d左右成典型的鹅卵石样内皮细胞形态,28 d 时细胞数量级达到107。结论:用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞进行体外定向培养可以获得作为组织工程瓣膜种子细胞的血管内皮细胞。

聚乙二醇在猪组织工程瓣膜制备中的应用

目的:观察聚乙二醇法在组织工程瓣膜准备中的应用价值,比较聚乙二醇去细胞前后组织工程瓣膜的物理特性。方法:实验于2005-10/2006-03在华中科技大学同济医学院基础医学院生物化学系实验室完成。①实验分组:取猪10只,由于猪主动脉瓣为三叶瓣结构,共取得瓣叶组织30个,麻醉后宰杀取其心脏动脉瓣膜,分为去细胞组和对照组,每组各15个。②实验方法:去细胞组用聚乙二醇和DNase I处理;瓣叶组织放入1kg/L聚乙二醇,室温下浸泡30～45min,振荡器加以振荡;含抗生素磷酸盐缓冲液浸泡24h,反复3次洗脱;以5×104U/L DNase I液浸泡处理1h;对照组仅以含抗生素磷酸盐缓冲液浸泡24h,反复3次洗脱。③实验评估:苏木精-伊红染色、扫描电镜观察去细胞情况,吸光度(A)值,计算去细胞率(%)=(对照组A值-去细胞组A值)/对照组A值×100%。猪去细胞瓣膜条置于力学测试仪测定最大负荷、最大应力、最大应变和弹性模量。结果:纳入猪10只,均进入结果分析。①去细胞组织形态学观察:去细胞组猪瓣膜组织中看不到细胞成分,且细胞外基质结构保存完整,胶原纤维排列整齐,无明显断裂,仍呈波浪状平行排列,结构紧凑,弹性纤维结构清晰,组织无明显水肿。②DNA含量分析:聚乙二醇处理后去细胞百分率为95.32%。③生物力学检测:与对照组比较,去细胞组瓣膜组织最大负荷[(12.586±1.693),(10.242±1.435)N,P>0.05]、最大应力[(2.346±0.342),(1.877±0.572)N/mm,P>0.05]、弹性模量(15.152±1.579,14.549±0.678,P>0.05)、最大应变[(31.685±7.533),(28.118±6.045)mm/N,>0.05]等均无显著差异。P结论:聚乙二醇法去除细胞完全,细胞外基质保存完整,对组织机械性能无明显影响,适于构建组织工程瓣膜。

组织工程瓣膜种子细胞的筛选

构建组织工程瓣膜 (TEHV)的先决条件是种植类似天然瓣膜的种子细胞 ,种子细胞的获取是构建组织工程瓣膜的核心问题。由于异体细胞表达一定的抗原性 ,特别是内皮细胞具有强烈的免疫原性 ,因此 ,组织工程一般主张取受体自身的细胞作为种子细胞的来源。近年来 ,随着干细胞研究的不断深入 ,以自体骨髓间质干细胞和内皮祖细胞作为种子细胞受到广泛关注。本文综述了TEHV种子细胞的研究进展。

聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶构建新型组织工程瓣膜支架

目的利用聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶交联去细胞瓣膜构建组织工程瓣膜支架,并研究其生物学和生物力学性能。方法由聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶交联去细胞瓣膜制备复合支架瓣膜,由戊二醛与瓣膜交联制备戊二醛交联瓣膜,通过组织学染色,扫描电镜,细胞增殖实验,生物力学测试研究复合支架瓣膜的生物学以及生物力学性能,并与戊二醛交联瓣膜进行比较。结果组织学染色显示去细胞瓣膜表面能够紧密结合聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶。大体观察结果显示聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶不会对去细胞瓣膜的外观产生明显变化。扫描电镜结果显示复合支架瓣膜比戊二醛交联瓣膜表面具有更多粗糙的微结构。细胞增殖实验表明复合支架比戊二醛更有利于细胞的生长和增殖。力学性能试验表明复合支架瓣膜的最大应变较戊二醛交联瓣膜显著增大。结论聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶交联去细胞瓣膜构建的复合组织工程瓣膜具有良好的生物学和生物力学性能,比目前临床上使用的戊二醛交联瓣膜生物学性能更好,具有成为下一代瓣膜替代物的潜力。

转化生长因子-β_1对体外构建组织工程瓣膜的实验研究

目的研究转化生长因子-β1(TGF-β1)在组织工程心脏瓣膜(TEHV)体外构建中的作用。方法经胰酶/EDTA、去污剂Triton X-100和核酸酶处理,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分,然后在其表面种植大鼠肌成纤维细胞,构建TEHV。实验组培养基中添加TGF-β1(10ng/ml),对照组采用普通培养基。体外培养2周后取瓣叶,行HE染色和扫描电镜观察,并检测羟脯氨酸、DNA含量及瓣叶最大负荷力,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测瓣膜细胞MMP-13和TIMP-1mRNA的表达。结果HE染色和扫描电镜显示实验组较对照组的细胞联合紧密且细胞外基质更丰富,羟脯氨酸含量和DNA含量增高,最大负荷力提高,MMP-13mRNA和TIMP-1mRNA的表达增强。结论TGF-β1在TEHV体外构建过程中具有积极作用,能为种子细胞生长提供有利因素,促进细胞增殖和细胞外基质分泌,提高瓣膜的最大负荷力。

Amplex Red荧光法检测组织工程瓣膜赖氨酰氧化酶活性

目的采用Amplex red荧光法检测组织工程心脏瓣膜(tissue engineered heart valve,TEHV)中赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)的活性。方法经胰蛋白酶+乙二胺四乙酸、聚乙二醇辛基苯基醚和核酸酶处理,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分,然后在其表面种植大鼠肌成纤维细胞,构建TEHV。用高糖培养基在体外培养瓣膜27 d,再用不含酚酞和血清的培养基培养24h,收集此时的培养基作为样本,用Amplex red荧光法检测样本中LOX的浓度,同时应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TEHV中LOXmRNA的表达。结果样本中LOX的荧光值为45.60±1.66,根据标准曲线获得相应的LOX浓度为0.123±0.003μg/ml,同时各个TEHV均有LOXmRNA的表达,与Amplex red荧光法检测的结果相一致。结论应用Amplex red荧光法检测TEHV中LOX的活性具有可行性,并为反映LOX对TEHV细胞外基质中胶原交联的重要作用提供了方法依据。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽固定去细胞瓣构建组织工程瓣膜的实验研究

目的:研究促黏附分子精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽对去细胞瓣组织工程心脏瓣膜(TEHV)构建的影响。方法:酶+去污剂法制备去细胞瓣天然支架,应用化学交联剂Sulfo-LC-SPDP,使GRGDSPC肽与之稳定结合,然后表面种植大鼠肌成纤维细胞以构建TEHV。实验组采用GRGDSPC肽固定去细胞瓣,对照组则为未处理去细胞瓣。体外培养1周后取瓣叶,作苏木精-伊红(H-E)染色和扫描电镜观察,检测羟脯氨酸和DNA含量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测瓣膜Ⅰ型胶原、赖氨酰氧化酶(LOX)mRNA表达。结果:与对照组比较,实验组形态学显示细胞紧密联合且胞外基质丰富,羟脯氨酸和DNA含量值增高,Ⅰ型胶原、LOX mRNA表达增强。结论:RGD肽表面修饰去细胞瓣,提高天然支架细胞黏附性,促进种子细胞生长、繁殖与细胞外基质分泌,有利TEHV构建。

RGD肽联合转化生长因子-β_1对组织工程瓣膜构建的影响

细胞对支架的黏附和生长是构建组织工程心脏瓣膜（tissue engineering heart valve，TEHV）的关键环节。去细胞瓣被认为是一种较理想的TEHV支架，本实验率先采用RGD肽（精-甘-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp）表面修饰以促进细胞黏附，联合种植转化生长因子-β1（TGF-β1）基因转染细胞以促进细胞及细胞外基质（ECM）增生，观察两种生物活性分子对去细胞瓣体外构建TEHV的影响。

碱性成纤维细胞生长因子联合骨髓间充质干细胞构建组织工程瓣膜的研究

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合骨髓间充质干细胞(MSCs)构建组织工程瓣膜(TEHV),能否在保证生物学性能不变的前提下,缩短MSCs体外构建TEHV的时间。方法:分离培养大鼠MSCs,进行细胞鉴定后种植于去细胞猪主动脉瓣膜支架上,再进行分组于体外构建TEHV。在培养基中加入5μg/L的bFGF分别培养7 d、14 d做为实验组A和实验组B,实验组C除培养液中不添加bFGF外,其余同实验组B。对照组为大鼠肌成纤维细胞构建的TEHV。各组TEHV进行形态学观察,DNA和羟脯氨酸含量检测。结果:MSCs表达CD29(94.82%)和CD44(93.59%),a-SMA和Vi mentin染色阳性,各组TEHV具有相似的形态学结构,DNA和羟脯氨酸含量的差异无统计学意义。结论:采用bFGF联合MSCs能在更短的时间内构建具有相同生物学性能的TEHV,从而缩短TEHV体外构建时间。

碱性成纤维细胞生长因子联合间充质干细胞构建组织工程瓣膜的研究

目的:探讨采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合间充质干细胞(MSCs)体外构建组织工程瓣膜(TEHV)过程中,MSCs表型特性和基质金属蛋白酶及其抑制物的表达情况。方法:分离培养大鼠MSCs,进行细胞鉴定后种植于去细胞瓣叶支架上。将瓣叶置于含5ng/mlbFGF的培养液中,培养14d构建的TEHV作为A组;B组除培养液中不添加bFGF外,其余同A组;C组为大鼠肌成纤维细胞构建TEHV的对照组。RT-PCR检测各组TEHV中α-SMA、MMP-13和TIMP-1mRNA的表达。结果:MSCs表达CD29(94.82%)和CD44(93.59%)。A组与C组α-SMA、MMP-13和TIMP-1mRNA表达比较均差异无统计学意义(P>0.05),但均高于B组(P<0.05)。结论:采用bFGF联合MSCs体外构建TEHV过程中,通过bFGF的调控作用,可以使MSCs的表型特性和基质金属蛋白酶及其抑制物表达与肌成纤维细胞相当。

组织工程心脏瓣膜体外脉动反应器的初步研制

目的:探讨自行研制的体外脉动反应器应用于组织工程心脏瓣膜应力预适应的可行性。方法:根据流体力学原理,采用特殊材料自行设计制作了体外脉动反应器和预适应应力培养系统;将生物瓣置于反应器中运转,观察生物瓣的工作状态和系统的稳定性。以脱细胞猪主动脉瓣作支架,新生牛主动脉内皮细胞作种子细胞构建组织工程心脏瓣叶,静态培养4 d后,置入反应器内进行预适应处理24 h(流量由30 ml/min调至400 ml/min,频率30次/min),观察内皮细胞残留情况,并与静态培养的瓣膜相比较。结果:预适应应力培养系统能产生搏动性液体流,生物瓣正常工作,运转7 d,系统状态稳定。静态培养成功构建组织工程心脏瓣膜,内皮细胞与瓣叶支架黏附紧密,沿瓣叶表面形成单层细胞层,生长状态良好;动态培养的瓣叶内皮细胞部分被冲刷脱落,但仍有少部分细胞(6.26％)残留黏附。结论:自行设计和构建的体外脉动反应器基本能模拟体内心脏瓣膜的血流动力学,用于组织工程心脏瓣膜预适应研究具有可行性。

胶原膜与聚-β-羟基丁酯在组织工程心脏瓣膜中应用的研究

目的 :对胶原膜与聚 β 羟基丁酯在组织工程心脏瓣膜技术中的应用进行比较。方法 :对照研究胶原膜和聚 β 羟基丁酯膜在材料结构、皮下包埋和细胞生长对照实验情况。结果 :胶原膜呈网孔状结构 ,皮下包埋8周仍保持膜状结构 ,皮下包埋 8～ 12周完全降解 ,生物相容性优于聚β羟基丁酯膜。结论 :胶原膜在材料结构特征、降解率和生物组织相容性方面均优于聚β羟基丁酯 。

人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架构建的组织工程心脏瓣膜

背景:去细胞处理的猪主动脉瓣膜植入人体后发生了免疫排斥反应,分析引起免疫排斥反应的原因是由于猪瓣膜的细胞外基质与宿主发生接触引起了免疫激活。目的:试图将人自身的细胞外基质履盖去细胞猪瓣膜表面起到隔离猪瓣膜与宿主血液成分接触的作用。同时应用免疫组化的方法验证人细胞外基质覆盖瓣膜的效果。设计、时间及地点:观察性实验,于2008-08/2009-04在解放军第二军医大学长海医院胸心外科实验室完成。材料:新鲜猪心脏瓣膜取自上海五丰上食肉联厂,采用酶消化法将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理。密度梯度离心法从健康志愿者骨髓中获取骨髓基质干细胞。方法:用人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架来构建组织工程瓣膜,再应用前期制备的抗人细胞外基质单克隆抗体,采用免疫组织化学染色鉴定人细胞外基质在体外构建的组织工程瓣膜上的黏附情况。以未构建的去细胞猪瓣叶为对照组。主要观察指标:①组织工程瓣膜上种子细胞的黏附和生长情况。②免疫组织化学法检测人细胞外基质在瓣膜上覆盖的效果。结果:光镜下观察瓣膜表面均形成了细胞层。扫描电镜所见细胞排列欠规则,未完全覆盖去细胞瓣叶表面,可见裸露的瓣膜支架。免疫组织化学方法检测构建的瓣膜表面呈阳性反应证明有人的细胞外基质黏附,而对照组呈阴性证明了检测方法具有特异性。结论:体外构建的组织工程瓣膜上检测到有人的细胞外基质黏附。

组织工程心脏瓣膜支架材料的血液相容性

目的:评价去细胞猪主动脉瓣、胶原-透明质酸钠复合膜、胶原膜、胶原-壳聚糖复合膜的血液相容性,展望其在组织工程心脏瓣膜支架材料中的应用前景。方法:进行体外的动态凝血试验、血小板黏附性能试验、溶血试验和体内的犬腹主动脉内移植试验的血液相容性评价。结果:4种材料的溶血率均小于5%;前3者的OD-凝血时间曲线下降缓慢且吸光度高,同时血小板黏附少且没有明显变形和伪足。腹主动脉包埋试验大体解剖只有胶原-壳聚糖复合膜形成血栓。结论:前3种材料在血液相容性方面适合组织工程心脏瓣膜的要求;胶原-壳聚糖复合膜需要改进。

应用骨髓干细胞和自制胶原-壳聚糖构建组织工程心瓣膜

目的探讨应用骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化的内皮细胞为种子细胞,以胶原-壳聚糖复合物为支架材料,运用组织工程学的原理和方法体外构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)的可行性。方法兔主动脉壁体外分离、培养、传代平滑肌细胞、成纤维细胞,将培养的成纤维细胞、平滑肌细胞与兔骨髓基质干细胞诱导分化的内皮细胞按顺序种植在预湿处理的胶原-壳聚糖复合支架上,通过组织学及倒置显微镜、扫描电镜观察内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞在支架上生长、增殖和基质分泌情况。结果 HE染色示内皮细胞能够在胶原-壳聚糖复合支架黏附、伸展、增殖,在TEHV表面长成连续的细胞层;扫描电子显微镜示TEHV表面光滑,细胞生长良好,细胞层完整,且瓣膜表面的内皮细胞具有合成和分泌前列环素(PGI2)的功能。结论以兔主动脉壁体外分离、培养、传代的平滑肌细胞、成纤维细胞和BMSCs诱导分化的内皮细胞为种子细胞,依次种植在胶原-壳聚糖复合支架上可以构建TEHV,且内皮细胞能够分泌PGI2。