微囊化基因修饰细胞复合组织工程真皮构建及其对创面愈合的影响

目的探讨微囊化神经生长因子(nerve grow th factor,NGF)基因修饰的N IH 3T 3细胞复合组织工程真皮的可行性及其对急性创面愈合的影响。方法构建分泌型NGF真核表达质粒pcDNA 3.1+/NGF并导入N IH 3T 3细胞,筛选出稳定表达的细胞株,将此细胞包入海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊中培养。以Ⅰ、Ⅲ型胶原为基质、人成纤维细胞和制备好的微囊为种子细胞,用组织工程皮肤培养系统构建复合微囊的组织工程真皮,体外培养1周后行羟脯氨酸(hydroxypro line,Hyp)测定,EL ISA法测定其分泌功能,组织形态学观察。以猪背部急性全层创面为模型,按移植物不同分为5组:NGF-N IH 3T 3微囊真皮组(A组)、N IH 3T 3微囊真皮组(B组)、空囊真皮组(C组)、NGF(5 ng/m l)+胶原膜组(D组)和空白对照组(E组),观察创面再上皮化及愈合速度和愈合时间。结果转NGF基因微囊复合组织工程真皮后体外培养6周,仍稳定分泌NGF(124.32 pg/m l),体外培养1周后,组织工程真皮中NGF-N IH 3T 3微囊组Hyp含量为69.68±6.20 m g/g,较空白对照组增加约2倍以上。移植治疗急性创面,A组平均愈合时间为25±2 d,B组为34±3 d,C组为34±2 d,D组为33±2 d,E组为40±3 d,A组创面愈合时间平均至少缩短约10 d,提高了创面愈合的速度。结论将分泌NGF微囊复合组织工程真皮后可提高组织工程真皮的质量,并促进急性创面的愈合。

组织工程真皮抗张强度的初步研究

目的采用高敏度小张力膜状生物材料力学性能测定仪检测组织工程真皮的抗张强度。方法分别培养含有不同数量成纤维细胞的胶原凝胶和复方壳多糖真皮替代物,15 d后检测抗张强度。结果组织工程真皮抗张强度随成纤维细胞数量增多而增强(P<0.01),复方壳多糖人工真皮的抗张强度高于胶原凝胶真皮(P<0.01)。结论复方壳多糖真皮替代物具有良好的抗张强度,为临床应用提供稳定机械性能。

孔径对胶原基组织工程真皮支架性能的影响

作为多孔支架结构的重要参数,孔径的选择对材料整体物理、生物学性能具有重要影响,是组织工程支架研发的起点和难点.本文通过查阅国内外相关文献,就孔径对胶原基组织工程真皮支架性能的影响、实际操作中的困难与现存争议进行综述,为相关材料的研发及临床转化提供参考.

组织工程真皮联合烧伤疤瘢痕表皮移植在瘢痕整形中的应用

目的研究组织工程真皮联合烧伤疤瘢痕表皮移植在瘢痕整形中的应用价值。方法以2017年7月-2021年7月九江市第一人民医院烧伤科收治的65例烧伤瘢痕病例为研究对象,采用随机数字表法分为观察组(32例)与对照组(33例)。观察组应用脱细胞异体真皮联合瘢痕表皮移植治疗,对照组采用自体中厚皮片移植治疗,比较两组治疗效果(创面愈合率、创面收缩率、植皮成活率、二次手术率)、创面愈合时间、患者和观察者瘢痕评估量表(POSAS)评分、并发症、瘢痕增生程度。结果两组创面愈合率、创面收缩率、植皮成活率、二次手术率比较,差异无统计学意义(P>0.05);两组植皮区创面愈合时间比较,差异无统计学意义(P>0.05),但观察组供皮区创面愈合时间短于对照组(P<0.05);两组治疗后POSAS评分均有下降(P<0.05),但组间比较,差异无统计学意义(P>0.05);两组并发症发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05);观察组轻度增生率高于对照组,重度增生率低于对照组(P<0.05)。结论组织工程真皮联合烧伤瘢痕表皮移植在瘢痕整形中具有确切的效果,其植皮效果、瘢痕修复作用与自体中厚皮移植效果相当,同时可避免供皮区瘢痕增生,缩短其愈合时间,且不增加并发症风险。

明胶-白芨胶/丹参多孔材料复合大鼠真皮成纤维细胞构建组织工程真皮的实验研究

目的:探讨明胶-白芨胶/丹参多孔材料复合大鼠真皮成纤维细胞制成组织工程真皮。方法:制备明胶-白芨胶/丹参多孔材料及其浸提液,与L-929细胞共同培养,观察浸提液与L-929细胞相容性。提取大鼠真皮层中成纤维细胞,与材料复合构建组织工程真皮。复合组织采用苏木精-伊红染色及电镜下观察结合效果。结果:L-929细胞在浸提液中生长情况良好。大鼠真皮成纤维细胞与材料共同培养2周,苏木精-伊红染色及电镜观察,细胞能在材料上正常粘附与生长。结论:明胶-白芨胶/丹参多孔材料无细胞毒性。能与大鼠真皮成纤维细胞成功复合为组织工程真皮。

培养9天的组织工程化真皮低温保存的研究

组织工程化真皮的低温保存是皮肤组织工程的重要组成部分 ,对皮肤组织库的建立有重要意义。以培养一定时间的组织工程化真皮为试材 ,以四唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率 ,辅以光学显微镜和扫描电镜观察分析 ,试验研究了低温保护剂预处理方式、降温程序及降温速率等条件对组织工程化真皮低温保存效果的影响。实验表明 :将组织工程化真皮置于 2 1mol/L的DMSO溶液中 ,在 4°C下处理 1 5min ,再只将组织工程化真皮转入低温保存袋中 ,迅速热封口 ,以 1°C/min速率降温且无恒温处理可获得较高的细胞存活率 ( 72 8%～ 78% ) 。

组织工程微粒真皮的构建及其动物实验研究

目的:将人成纤维细胞和York猪脱细胞真皮基质(ADM)微粒复合构建的?组织工程微粒真皮应用于SD大鼠损伤模型,观察其修复组织创伤能力。方法:用PKH26标记的人成纤维细胞,与猪ADM微粒复合构建微粒真皮,将其注射到SD大鼠皮下,用荧光显微镜和HE观察ADM微粒真皮对皮下组织的修复;将54只SD大鼠随机分成3组,分别移植自体全厚皮肤、ADM微粒和ADM微粒皮真皮。大体、荧光显微镜和HE观察伤口愈合情况、计算创面愈合时间和收缩率。结果:皮下注射ADM微粒真皮2周时可见单核细胞、成纤维细胞和血管长入,以后单核细胞减少,荧光观察可见红色荧光,8周时注射的微粒真皮基本被自身组织改建利用、体积稳定,胶原粗大整齐;ADM微粒真皮移植能够使创面愈合时间、创面收缩率与自体全厚皮肤移植相比无统计学意义(P>0.05),与ADM微粒移植相比差异显著(P<0.01)。结论:皮下注射ADM微粒真皮可参与皮下组织改建,修补皮下组织缺损;ADM微粒真皮可促进SD大鼠损伤模型的愈合和瘢痕挛缩。

组织工程人工真皮、软骨在鼻尖整形中的应用

目的探讨应用人工真皮、软骨在鼻尖整形中的手术技巧及应用价值。方法选择隆鼻术后因张力过大导致鼻尖皮肤发红、变薄或鼻尖部可见假体轮廓的57例患者及粗短鼻、朝天鼻患者16例。取出原有假体，手术根据患者的基础进行雕刻假体和人工真皮后置入鼻尖。其中42例取自体耳软骨或鼻中隔软骨作盾牌移植或延长为辅助，人工真皮作帽状移植帮助鼻尖塑形，改善鼻尖效果。结果本组73例，5例是隆鼻术后单纯行人工真皮作帽状移植患者。4例术后1以个月人工真皮几乎被吸收，鼻尖改善不明显，再次行自体软骨移植加真皮片后，效果良好；其余均取得满意的手术效果。结论组织工程人工真皮为现阶段较理想的鼻尖整形材料，适用于鼻尖皮下组织的加厚，可预防隆鼻术后鼻尖皮肤因张力过大而导致的皮肤变薄、发红等情况。真皮片亦适合多次隆鼻术后鼻尖皮肤菲薄的患者。

构建生长因子缓释功能的复合型组织工程皮肤替代物

目的设计制备具有缓释表皮生长因子(EGF)功能的复合型组织工程皮肤替代物并进行相关性能检测。方法在组织工程脱细胞真皮的研究基础上,利用天然材料制备凝胶状类似表皮结构的生物膜作为覆盖,并加载表皮生长因子缓释系统,构建具有促表皮愈合功能的复合型组织工程皮肤替代物。并对此皮肤替代物的形态学、体外释放性能以及实际疗效做以考察。结果缓释EGF的复合型组织工程皮肤替代物具有良好的形态学性能,生物相容性好,EGF在体外的释放可达14d以上。动物实验表明实验组创面愈合率在术后各时间点均高于对照组(P<0.05);组织学观察显示愈合创面的表皮愈合程度明显优于对照组。结论具有EGF缓释功能的复合型组织工程皮肤替代物能有效促进猪全层皮肤缺损的创面愈合,可作为具有应用前景的覆盖材料进一步研究。

新型海藻酸盐水凝胶真皮支架材料的制备及其表征

背景:海藻酸钠水凝胶具有与真皮基质成分蛋白多糖类似的结构,是较为理想的成纤维细胞培养材料,但以往制备海藻酸钠水凝胶大部分都是以CaCl2为交联剂,这一体系存在严重不足。目的:利用碳化二亚胺作为催化剂、乙二胺作为交联剂制备新型海藻酸盐水凝胶支架材料,并对其性能进行表征,探讨其作为组织工程支架材料的可行性。设计、时间及地点:形态学描述及自身对照实验,于2005-10/2006-10在中山大学附属第一医院骨科实验室完成。材料:自制乙二胺溶液,碳化二亚胺和海藻酸钠购自Sigma公司。方法:利用碳化二亚胺作为催化剂、乙二胺作为交联剂,采用共价交联及冻干法制备新型海藻酸盐水凝胶支架,对照为用传统交联剂CaCl2制备的样品。主要观察指标:观察海藻酸钠的理想反应浓度;用扫描电镜观察藻酸盐组织工程支架的微观结构,排液法测定其孔隙率及含水量;并观察其体外降解规律。结果:成功制备了海藻酸盐水凝胶真皮支架,该支架材料的海藻酸钠理想反应浓度为2%,其含水量为(95.32±1.24)%,孔隙率为(85.55±0.98)%,均高于对照材料;2周后海藻酸盐水凝胶的体外降解率为(12.26±2.25)%。结论:新型海藻酸盐组织工程真皮支架克服了传统以钙离子作为交联剂的诸多缺点,其吸水性、孔隙率、降解性能满足真皮支架材料的物理性能所需,能够做为成纤维细胞的三维培养系统。

降温过程中组织工程用真皮成纤维细胞膜水分渗透特性的实验研究

在优化组织工程化真皮的低温保存程序时, 有必要了解体外培养的真皮成纤维细胞的低温保存特性, 如细胞膜的水分渗透系数和相应的表观活化能等. 以组织工程用真皮成纤维细胞为实验材料, 通过添加少量冰核细菌诱导形成胞外冰, 应用DSC对在降温速率为5℃·min-1的条件下细胞悬液样品在相变过程中释放的热流量进行了测量. 对所测得的热流曲线计算得出了降温过程中成纤维细胞体积随温度的变化趋势, 并以Karlsson提出的细胞水分渗透模型为理论基础, 对获得的细胞体积变化数据进行了非线性回归的最小二乘优化, 得出了细胞膜的水分渗透率: 参照温度下(0℃)细胞膜对水分的渗透系数Lpg = 5.87×104μm·min-1·Pa-1, 表观活化能ELP = 308.8 kJ·mol-1. 将上述参数代入水分渗透模型, 对在不同的降温速率下(0.01～50℃·min-1), 冻存过程中成纤维细胞的水分渗透情况进行了模拟, 预测水分渗透过程结束后细胞内未渗透水的数量及保存成纤维细胞时应采取的最佳降温速率.

基于细胞膜片技术构建三维真皮样组织的体外研究

目的探讨应用细胞膜片技术构建三维真皮样组织的新策略。方法取2~3周龄新西兰大白兔骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs(rabbit BMSCs,rBMSCs)并传代,取人皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDFs)传代培养。取第2代rBMSCs、第3代HDFs分别于培养皿采用膜片条件培养基连续培养2周,获得单层细胞膜片。取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)接种于rBMSCs膜片上,构建预血管化膜片。培养期间于倒置相差显微镜下观察膜片上细胞形态变化;共培养1、3、7、14 d后取材行HE染色、CD31免疫荧光染色,观察细胞分布及微血管网络生成情况,以rBMSCs膜片作为对照。分别将培养7 d的预血管化膜片(实验组)及rBMSCs膜片(对照组)放于2层HDFs膜片中间,制备三维真皮样组织,培养24 h后行CD31免疫荧光染色及Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学染色,评估细胞分布及胶原表达情况。结果细胞连续培养2周后成功制备HDFs膜片及rBMSCs膜片。HUVECs接种于rBMSCs膜片3 d后重新排列,7 d后形成网状结构,14 d后网状结构更明显;HE染色见膜片间有空泡形成,且随时间延长空泡日趋明显、膜片厚度显著增加;CD31免疫荧光染色可见微血管管腔形成。而rBMSCs膜片仅见细胞膜片增厚,未见细胞形态改变、空泡结构形成。三维真皮样组织观测显示,实验组内皮细胞CD31免疫荧光染色呈阳性,rBMSCs、HDFs及HUVECs细胞排列整齐;而对照组染色呈阴性,细胞随机排列。实验组和对照组Ⅰ、Ⅲ型胶原均呈阳性表达,与对照组比较,实验组细胞排列紧密,细胞基质分布规律,呈"蜂巢状"结构;两组Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论应用细胞膜片技术可以构建三维真皮样组织,其中采用HUVECs联合rBMSCs膜片构建预血管化膜片后细胞基质分布较规律,具有形成组织工程真皮的潜力。

成纤维细胞玻璃化保存的初步实验研究

成纤维细胞是构建组织工程化真皮的种子细胞 ,实现成纤维细胞的低温保存对成功保存组织工程化真皮有着重要的意义。采用不同组成及浓度的玻璃化溶液对成纤维细胞进行玻璃化低温保存实验 ,并考虑了离心次数对细胞存活率的影响。实验结果表明 :玻璃化溶液的组成、浓度及复温后的离心次数等因素对细胞的存活率均有明显的影响。在实验条件下 ,采用组分配比为 5 4mol/LEG+1 4mol/LDMSO的玻璃化溶液对成纤维细胞进行玻璃化保存 ,复温后以 10 0 0r/min的转速离心 1次(5min)后 ,再以 80 0r/min的转速离心 4次 (每次 4min) ,可获得较高的细胞存活率 ,其值为87 1%。

成纤维细胞预处理过程及三种低温保存方法比较的实验研究

成纤维细胞是构建组织工程化真皮的种子细胞,实现成纤维细胞的低温保存对成功保存组织工程化真皮有着重要的意义。采用三种不同的低温保存方法对成纤维细胞进行低温保存实验;详细介绍这三种方法的操作过程;并从细胞存活率、降温过程中的温度变化情况、操作时所需仪器设备及所耗时间等方面对这三种方法进行了比较。同时研究了DMSO的浓度、预处理时间及预处理温度等因素对成纤维细胞存活率的影响。

基质金属蛋白酶对猪脱细胞真皮基质免疫原性的影响

目的探讨应用基质金属蛋白酶一7（MMP一7）降低“双断层”异种（猪）脱细胞真皮基质（Xeno—ADM）免疫原性的可行性及对真皮支架组织结构的影响。方法取健康白色家猪边腹部皮肤，机械法制备O．5～0．6i／lnl厚网状层即“双断层”真皮33块，随机分为正常对照组（A组）、脱细胞处理组（B组）和脱细胞＋MMP-7处理组（c组），每组11块。行HE染色，波形蛋白（Vimentin）、层黏连蛋白（LN）、IV型胶原蛋白（ColIV）免疫组化染色和扫描电镜检查，观察“双断层”真皮组织的细胞、细胞碎片、毛发残留情况，LN、Col1V脱除及半定量情况，和真皮胶原支架组织结构变化。结果HE染色、Vimentin免疫组化染色和扫描电镜观察显示，B组毛囊内仍残留毛发及含完整细胞的上皮根鞘，原微血管区域可见细胞核、细胞碎片样结构；C组毛囊内未见残留毛发及上皮根鞘，全部视野均未见完整细胞，偶见细胞核、细胞碎片样结构。LN和Col1V免疫组化染色观察及半定量分析显示，B组LN和Col1V含量明显少于A组（P〈0．01）但多于C组（P〈0．01），C组LN和ColIV基本被完全脱除。扫描电镜及HE染色观察显示，B、C组胶原纤维排列规则近似A组，B组胶原纤维束及胶原纤维之间间隙较A组增大而C组又较B组增大；胶原纤维及胶原原纤维结构完整，未见断裂、融合等破坏性改变。结论MMP一7处理“双断层”Xeno—ADM，能够有效降低其高免疫原性成分，同时保持真皮胶原支架的正常组织结构并相对扩大其三维网络空间，初步显示良好的研究与应用前景。

普鲁兰/明胶多孔皮肤替代品促进皮肤再生

与目前临床早期切除和自体植皮术修复巨大创面的方法相比,组织工程真皮替代物的应用能明显促进伤口愈合和提供更加充分再生治疗途径。然而,再生能力不足、再生/降解能力受损以及目前商品化组织工程真皮的高成本阻碍了其应用,因此开发一种高效、经济的组织工程真皮替代物仍然是一个很大挑战。