舒肝宁注射液对非酒精性脂肪性肝病组织工程肝保护作用的机制研究

目的:探讨舒肝宁注射液对非酒精性脂肪性肝病新型组织工程肝脏模型抗氧化应激的作用机制。方法:将SD大鼠肝脏去细胞化制为肝脏胶原支架,用人HepG2细胞再细胞化,分别用正常培养基及高脂培养基灌注肝脏,从而获取组织工程肝(TE)和组织工程脂肪肝(TEF)模型,并对TEF肝脏给予舒肝宁注射液处理。本研究设定正常组、FFA组及舒肝宁注射液组,用CCK8检测药物的细胞毒性,分别从细胞凋亡、病理、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)和线粒体功能等方面评估舒肝宁对氧化应激的调节作用。结果:灌注8 d后进行指标检测,CCK-8提示舒肝宁注射液不同稀释浓度(10^(-3)~10^(-8))均无明显的细胞毒性,安全性良好。HE结果显示舒肝宁可明显减少游离脂肪酸(FFA)引起的细胞死亡;TUNEL染色也显示舒肝宁可减少FFA组中凋亡细胞的数量。进一步检测发现舒肝宁可明显降低FFA组中肝细胞MDA、ROS水平。免疫荧光染色显示FFA组肝细胞中ATP5A表达较弱,而舒肝宁处理后其表达明显增加,提示细胞的线粒体功能有所恢复。结论:舒肝宁通过减少TEF肝脏MDA、ROS水平来抑制氧化应激减轻FFA诱导的脂肪肝中肝细胞的凋亡以及线粒体的损伤。

可注射组织工程肝改善大鼠肝纤维化的作用及其机制

目的探讨可注射工程化肝组织抗肝纤维化作用及其机制。方法制作大鼠肝纤维化模型,采用新生大鼠肝细胞、液态鼠尾胶原复合物行肝纤维化大鼠肝包膜下多点注射,20 d后计算大鼠生存率、行腹部超声检查、取肝脏观察大体及镜下变化并检测肝组织TGF-β的表达,观察肝脏原位多点注射工程化肝组织对大鼠肝纤维化的影响。结果实验组大鼠镜下及超声检查提示肝纤维化缓解,TGF-β表达明显下降。结论原位多点注射基于新生大鼠肝细胞构建的工程化肝组织能缓解肝纤维化,机制可能与其显著抑制TGF-β的表达有关。

CRTER杂志“软组织工程”栏目关于“组织工程肝脏”研究的组稿内容

半乳糖化透明质酸／壳聚糖复合肝组织工程 支架的研究 一种新型肝组织工程支架的生物相容性

共培养的大块组织工程肝构建及体内植入研究

目的选择大鼠成纤维细胞和原代肝细胞共培养于胶原水凝胶支架中,进行多细胞的大块组织工程肝构建及体内植入研究,以期构建长期存活的功能性肝组织。方法采用3-D打印技术制备硅胶模具,经成胶脱模制备胶原水凝胶支架。将大鼠肺成纤维细胞与原代肝细胞以0.4∶1比例种植于该支架中(B组),以种植同密度单纯原代肝细胞为对照(A组)。体外培养1、3、7、14、21 d,观察细胞形态并检测肝功能(白蛋白和尿素分泌量)。取24只SD大鼠,采用皮下注射四氯化碳方法制备肝硬化模型,将A、B组组织工程肝分别植入大鼠腹腔大网膜内(n=12),植入后3、7、14、21、28 d行HE、细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)及ALB染色观察。结果体外实验中,与A组相比,B组肝细胞呈多边形,细胞核大且圆,肝功能表达旺盛,并且在7 d时聚团生长最多,7 d后白蛋白及尿素分泌量显著增高(P<0.05)。体内实验中,B组肝细胞能存活至28 d,白蛋白和尿素分泌也显著增多,细胞团聚成条索形,形成了类正常肝脏组织。结论多细胞大块组织工程肝体内植入时形成了类正常肝脏组织,并长期存活,为构建结构和功能更完整的组织工程肝奠定了基础。

肝脏组织工程纳米纤维支架材料的比较研究

探讨海藻酸钠、壳聚糖和PLGA纳米纤维支架的机械稳定性、生物相容性及细胞在其表面的生长规律,寻找合适的肝脏组织工程支架材料。用静电纺丝的方法分别制备海藻酸钠、壳聚糖和PLGA纳米纤维支架,观察材料的机械稳定性及肝细胞在材料表面的活性和生长情况。接种后0.5 h内,肝细胞在壳聚糖和海藻酸钠材料表面贴壁,生长良好。第二天起,肝细胞在壳聚糖表面逐渐聚集生长,形成聚集体,而在海藻酸钠材料表面无聚集。第三天后,海藻酸钠材料发生溶胀,纳米结构破坏,而壳聚糖纳米支架保持完好。在观察期间,PLGA材料表面一直没有肝细胞黏附。肝脏细胞不能在PLGA纳米材料表面黏附生长;壳聚糖具有良好的生物相容性,且肝细胞在壳聚糖纳米材料表面能形成球形聚集体;海藻酸钠生物相容性好,但机械稳定性差,容易降解,不能单独作为肝脏组织工程的纳米支架材料。

肝组织工程支架的微制造工艺

通过模拟自然肝脏的内部微结构，对肝组织工程支架进行仿生设计，构建了有利于人工肝向自然肝转化的肝支架孔洞与管道系统．结合光固化和微压印工艺制造了肝支架的硅橡胶模具，通过微复型工艺成型出生物可降解的壳聚糖／明胶复合肝支架．实验表明，普通光固化和掩膜光固化工艺可以实现最小尺度为200μm的微结构制造，精密光固化工艺不仅可以在同一模具上制造出具有良好复型精度和边缘特征的肝细胞孔洞（200-300μm）和血管管道（100-200μm），而且还可以制造出具有半通透功能的微管道（13．1～30μm）．因此，提出的微制造方法能成型出复杂的肝组织工程支架系统，可保证多种肝脏细胞的有序分布，并且为组织工程肝脏支架材料微观结构的模拟提供了参考．

一种新型肝组织工程支架的制备及生物相容性评价

目的:构建一种新型肝组织工程支架,并对其生物相容性进行评价,探讨其作为肝组织工程支架的可行性.方法:选用壳聚糖及明胶材料,通过微制造技术制备一种新型壳聚糖/明胶肝组织工程支架,并与大鼠原代肝细胞共培养,采用HE染色、扫描电镜、MTT法及肝细胞功能学指标等多种检测方法,对支架的细胞毒性及生物相容性进行评价.结果:成功制备了一种新型壳聚糖/明胶复合肝组织工程支架,其孔隙率高、表面积大,有利于肝细胞的黏附与生长,种植在新型壳聚糖/明胶肝组织工程支架上的肝细胞呈现良好的生长增殖趋势,保持良好的生理功能,新制备的支架呈缓慢匀速降解,保持良好的空间结构.结论:制备的壳聚糖/明胶肝组织工程支架具有良好的生物相容性及低细胞毒性,满足肝组织工程的要求.

不同肝细胞配体修饰的壳聚糖作为肝组织再生支架材料的比较研究:制备、表征和评价

为了获得理想的肝脏再生支架,使用乳酸(lactobionic acid,LA)或/和甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)对壳聚糖(chitosan,CS)进行改性,得到LA改性的CS(LC)、GA改性的CS(GC)和GA/LA双改性的CS(GLC),并采用绿色静电纺丝法制备了由丝素蛋白(silk fibroin,SF)和上述改性CS组成的复合纳米纤维支架。这些支架是亲水的,其亲水性和热稳定性随着改性CS的增加而降低,而结晶度则相反。这些支架在促进HepG2细胞增殖及分泌白蛋白和尿素方面表现出良好的性能。此外,与SF/GC或SF/GLC支架相比,SF/LC支架具有更好的肝细胞相容性。

肝组织工程研究中生物反应器的研究进展

文章就生物反应器的特点、生物反应器在肝组织工程中的应用(肝组织重建、生物人工肝脏、药物筛选、生物反应器在肝组织工程其他相关方面的应用)进行综述,论述目前生物反应器亟待解决的问题是供氧问题、细胞密度和分布及微型化,指出生物反应器作为一个重要的媒介促进肝组织工程及生物人工肝的研究发展;同时肝细胞反应器可有效提高培养肝细胞的生物功能,其也将为肝再生医学的理论研究、肝脏的药物代谢及功能评价等提供有效的技术手段,肝细胞生物反应器的研发具有重要的理论意义和巨大的经济价值。

肝脏原位注射新生大鼠肝细胞构建的工程化肝组织对大鼠肝纤维化的影响

目的观察原位注射新生大鼠肝细胞构建的工程化肝组织对实验性肝纤维化大鼠血清和肝组织学的影响,探讨其抗肝纤维化的作用。方法用四氯化碳制成实验性肝纤维化造模大鼠,肝脏原位多点注射工程化肝组织,3周后测定血清肝功能并行肝组织学检查。结果原位注射组大鼠肝功能较单纯假手术组大鼠有改善,且具有显著差异(P<0.05),HE染色提示纤维化明显改善。结论肝脏原位多点注射新生大鼠肝细胞的工程化肝组织能改善大鼠肝纤维化进程,有一定抗肝纤维化作用。

肝组织工程的研究概况

综述了肝组织工程的研究概况及发展前景。

移植肝细胞与胶原水凝胶单元皮下创建工程化肝组织

背景:胶原水凝胶可为肝细胞生长和组织重建提供良好的基质支持,并且以胶原为基质构建的工程化组织易于合并生长,形成融合组织。目的:尝试将肝细胞/胶原水凝胶复合物打散成小块肝单元,堆积在皮下腔中,提高工程化肝组织厚度。方法:将新鲜分离的大鼠肝细胞与胶原水凝胶复合,构建肝细胞/胶原水凝胶复合物,待固化后将其打散成小块肝单元,以未打散的肝细胞/胶原水凝胶复合物作为对照。取6只SD大鼠,其中3只切除2/3肝脏,诱导肝再生,于双侧腹股沟皮下腔中分别植入打散与未打散的肝细胞/胶原水凝胶复合物;另3只于双侧腹股沟皮下腔中分别植入打散与未打散的肝细胞/胶原水凝胶复合物。植入后7 d取材,采用苏木精-伊红染色、免疫组化染色、印度墨水灌注等方法对工程化肝组织形成情况进行评价。结果与结论:两组移植物均在皮下腔中形成了血管工程化肝组织,但小块肝单元相互融合,形成了大块血管工程化肝组织,肝组织厚度可达4 mm;整块植入的肝移植物只形成小块肝组织,其厚度只有几层细胞。免疫组织化学染色证实,血管工程化肝组织中的肝细胞具有天然肝细胞的特征及功能。肝部分切除实验表明,工程化肝组织具有对肝部分切除再生刺激产生反应的能力。结果表明将肝细胞/胶原水凝胶移植物打散成小块单元,堆积在皮下腔中,可提高工程化肝组织的厚度。

肝组织工程支架的仿生设计与有限元分析

为了解决细胞在细胞支架复合培养中难以植入的问题,提出了一种卷裹型支架.将平面多孔支架采用卷裹的方式成型,使细胞在整个支架内部形成螺旋状三维分布,支架表面的管道结构可使培养液在支架内部渗透,从而提高物质交换效率.提出了一种具有仿生参数的流道设计方案,从肝脏血管铸型中提取血管的形状数据,作为仿生学依据进行流道设计,具体为树状多层分支结构.用此流道结构仿生了动脉、静脉的血液循环功能,并利用多孔材料仿生了毛细血管的渗透功能.建立了不同形状参数的流场分析模型,进行流体与多孔材料的渗流分析.结果表明,仿生设计方案的流场分布最为均匀,且平均流速较高,间接表明营养物质的输送效率最高.该支架能够使细胞呈三维分布,并扩大培养液在支架内的有效分布范围,更好地维持细胞的存活、增殖和迁移,为向组织化方向发展奠定了一定的基础.

肝组织工程材料的研究进展

肝组织工程支架材料是肝组织工程学的重要研究内容,是解决肝脏器官严重短缺的关键。目前用于肝组织工程支架材料的主要有天然生物材料和人工合成生物材料。天然类主要包括生物相容性较好的壳聚糖、海藻酸钠等,但其力学性能和可加工性较差;人工合成材料主要包括优良机械性能和可加工性的聚乙酰内脂、聚乳酸-羟基乙酸共聚物等,但其组织相容性较差。如果能利用修饰或者改性的方法,使天然生物材料和人工高分子聚合物扬长避短,则有可能制造出一类兼有良好的力学性能和细胞相容性的生物材料。

蚕丝蛋白和明胶复合组织工程材料的组织相容性研究

目的研究蚕丝蛋白-明胶三维材料支架,在SD大鼠体内所引起的免疫排斥反应,以及随着时间的降解情况。方法将3种不同比例总共90个蚕丝蛋白-明胶三维材料支架,植入3组共45只雄性SD大鼠(200～250g)背部皮下,每组15只大鼠,每只大鼠背部均匀植入3个同种比例材料,分别于植入后第7天、第14天、第30天处死各组内5只大鼠,取出被皮下纤维包裹的材料,4%多聚甲醛固定后行蜡块包埋,切片后进行HE染色。结果随着明胶成份在复合材料中所占比例增加,材料在大鼠体内的降解明显增快,3种比例材料第7天HE切片染色均显示较少单核细胞及中性粒细胞等炎性细胞渗出;第14天HE切片染色显示单核细胞及中性粒细胞等炎性细胞伴少量成纤维细胞渗出,材料开始出现降解;第30天材料大部分被组织机化、降解,大量成纤维细胞包绕材料残片。结论蚕丝蛋白与明胶复合材料支架具有良好的组织相容性和一定的降解能力,通过改进,在肝组织工程应用方面将具有一定应用前景。

人肝组织脱细胞支架的制备

目的探究人肝组织脱细胞支架的制备。方法本研究利用手术切除的人肝血管瘤左外叶组织,经反复冻融,0.01%SDS、0.1%SDS和1%Triton X-100循环灌注制备人肝组织脱细胞支架,并通过灌注过氧乙酸消毒。将L-02细胞通过门静脉插管种植于脱细胞支架内进行培养。结果 HE、DAPI染色和扫描电镜结果显示脱细胞支架内无细胞成分残留,残余DNA检测为25.3±14.6 ng/mg干质量,小于新鲜肝脏DNA含量的1%。免疫组化证实支架内保留了Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、纤连蛋白、弹力蛋白成分。L-02细胞在支架上生长良好且有增殖,并表达白蛋白及葡萄糖-6-磷酸酶。结论利用手术切除的人肝标本行肝组织脱细胞支架的制备是可行的,且为构建更适用于临床的组织工程肝脏提供了新思路。

大鼠肝细胞微球皮下移植生成肝组织初探

目的 探讨大鼠肝细胞微球皮下移植生成肝组织的可行性，为构建组织工程肝寻找新的方法。 方法 新鲜分离的SD大鼠肝细胞接种在琼脂糖包被的培养皿上进行培养，待其形成肝细胞微球后采用直接注射方式植入大鼠腹股沟处皮下腔。1 周后取腹股沟处组织，HE 染色法观察生成的肝组织形态。 结果 体外培养3 d，肝细胞形成致密的肝细胞微球，直径大小在43 ～ 185 μm，HE 染色显示微球中的肝细胞保持天然肝细胞形态特征。将其植入大鼠腹股沟处皮下腔1 周，HE 染色显示植入的肝细胞成活，并呈三维肝样组织团，肝细胞保持其特有形态特征：胞体为圆形，核大而圆，多为双核。 结论 肝细胞微球皮下移植可形成肝组织，为组织工程肝的构建创建了新的方法。

蚕丝蛋白/明胶多孔肝组织支架的制备及性能研究

采用冷冻干燥法制备了蚕丝蛋白/明胶多孔支架,并分别在-20℃和-70℃预冻,以观察支架的微孔结构,测量支架的孔隙率、溶胀吸水性及力学性能,研究HepG2细胞在支架中的生长增殖情况.结果表明:随预冻温度降低,支架的孔径减小且微孔分布更加均匀,孔隙率及力学性能均得到提高.细胞培养结果显示:随预冻温度降低,支架的细胞贴壁率减小,-20℃预冻支架中的细胞数量稳步增加,而-70℃预冻支架中的细胞在培养前期生长良好,在培养后期增殖受到限制.此项研究证明,采用冷冻干燥法可以成功制备蚕丝蛋白/明胶多孔支架,通过改变预冻温度可以控制支架的孔隙结构及性能.

大鼠脱细胞肝支架的制备研究

目的 本研究旨在探索优化脱细胞肝支架的简易脱细胞方案,可为脱细胞肝的下一步应用研究提供良好的生物材料。方法 依次采用0.9%氯化钠注射液500mL冲洗1h、0.5%乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸1500mL冲洗3h和1%十二烷基硫酸钠溶液3000mL冲洗大鼠肝脏6h,速度均为120滴/min,用来制备脱细胞肝支架。通过HE染色、扫描电镜和免疫荧光染色、DNA含量检测、X线下显影测试和流动性测试等方式检测脱细胞肝的结构完整性和主要成分。结果 经过10h的灌流,肝脏中的血管清晰可见,HE染色中显示脱细胞肝去除了细胞核,免疫组织化学染色见胶原蛋白I、纤连蛋白和层粘连蛋白表达,扫描电镜显示支架呈疏松多孔的结构,DNA含量显示<50ng/mg,X线测试表明对注射进入的显影剂有良好的显影效果,流动性测试表明脱细胞肝保留了较为完整和通畅的血管系统。结论 本研究所采用的脱细胞方法成功制备了脱细胞肝脏模型,达到了较为理想的脱细胞效果。

转染SV40永生化基因对正常成人肝细胞生长特性的影响

背景:生物型人工肝采用猪肝细胞或肝癌细胞作为移植物来源存在动物源性疾病和致瘤性的担心,而正常成人肝细胞也具有一定的局限性。目的:通过检测转染前、后正常成人肝细胞的活率、生长曲线和细胞周期的变化,了解转染SV40永生化基因对正常成人肝细胞生长特性的影响。方法:培养不同时间的正常人肝细胞和永生化正常成人肝细胞,采用胎盘蓝染色和AO-PI染色,于培养后1～8d采用MT染色法计数细胞活率;用MTT比色法测定细胞的A值并绘制生长曲线;采用流式细胞术检测细胞的生长周期。结果与结论:3种染色法检测显示两种细胞的活率为95%～99%,存活率无明显差异。转染前、后的两种正常成人肝细胞的生长曲线无明显差异,均在培养3～5d时呈指数型生长,但转染后正常成人肝细胞较转染前增殖略快。采用流式细胞术测得的两种肝细胞的细胞周期:转染后肝细胞S期细胞占65.64%,G0～G1期细胞占34.36%,G2期细胞占0%;转染前肝细胞S期占21.27%,G0～G1期细胞占62.64%,G2期细胞占12.09%,提示转染后肝细胞的S期细胞明显增多,增殖能力增强。转染SV40永生化基因的正常成人肝细胞较转染前细胞的增殖活力增高,存活率无明显差异,提示转染后细胞增殖能力更强。