富含血小板血浆凝胶复合脂肪间充质干细胞构建可注射组织工程髓核

目的:探讨以自体富含血小板血浆(PRP)凝胶复合脂肪间充质干细胞(ADSCs)构建可注射组织工程髓核的可行性。方法:将体外扩增的第3代兔ADSCs经流式细胞仪鉴定后接种至自体PRP凝胶中,体外立体培养2周、4周、8周时分别行大体观察、组织学检查、5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)免疫荧光法观察细胞在PRP凝胶中的分布及存活情况;分光光度法检测PRP凝胶-细胞复合体中糖胺聚糖(GAG)含量,实时荧光定量PCR法检测低氧诱导因子(HIF-1α)、蛋白多糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)基因表达情况。结果:流式细胞仪检测显示体外扩增的第3代细胞CD90阳性率为95.2%,CD45阳性率为0.9%。培养2、4、8周时PRP凝胶细胞复合体均为表面光滑的凝胶状,弹性较好;番红O染色2周时细胞外基质几乎不着色,4周时可见细胞周围呈粉色的弱阳性染色,8周时多数细胞周围呈红色阳性染色。HE染色和扫描电镜各时间点均可见细胞均匀分布于网络状支架内;BrdU免疫荧光法显示细胞在支架中生存状态良好,培养4周时阳性细胞数较培养2周时明显增多(P<0.05),8周时较4周时明显增多(P<0.05)。培养4周时GAG含量较培养2周时明显增高(P<0.05),8周时较4周时明显增高(P<0.05);培养4周时与培养2周时比较3个目的基因mRNA表达量均增高,差异有显著性(P<0.05),8周时与4周时比较亦明显增高(P<0.05)。结论:以兔自体PRP凝胶与ADSCs构建的复合体在体外培养时细胞可以向类髓核样细胞分化,用此方法构建可注射组织工程髓核具有可行性。

DSCM支架结合兔滑膜干细胞体外构建组织工程髓核

目的评估体外构建组织工程髓核的可行性。方法从成年新西兰大白兔体内提纯兔滑膜干细胞(synovium-derived stem cells,SDSCs),接种到预制备的脱细胞细胞外基质(decellularized stem cell matrix,DSCM)支架中。实验分为3组:分别为空白组(空白DSCM支架)、实验组(SDSCsDSCM复合体)和对照组(正常兔髓核组织)。肉眼以及光镜下观察材料和细胞的形态特征,扫描电镜(SEM)观察各组内部结构和细胞粘附情况,HE染色观察各组细胞分布情况,荧光免疫组织化学染色观察细胞外Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)蛋白表达情况,实时定量PCR(qRT-PCR)测定两组CollagenⅡ、Aggrecan相关基因的变化,压缩载荷检测各组抗压缩性能。结果肉眼下,组织工程髓核形态接近正常髓核;SEM显示细胞在支架内部粘附、生长良好;HE染色表明,随时间的延长,实验组材料内部细胞的分布逐渐均匀;免疫组化显示CollagenⅡ、Aggrecan分泌量随时间递增;qRT-PCR测定结果提示:实验组CollagenⅡ、Aggrecan mRNA表达量随时间递增,但均低于正常对照组(P <0. 05);支架的压缩载荷检测结果显示:在相同位移下,SDSCs-DSCM与正常髓核的压缩载荷差异无统计学意义。结论采用DSCM支架复合SDSCs可在体外成功构建组织工程髓核。

体外构建可注射式组织工程髓核的初步研究

目的研究兔髓核细胞在温敏性壳聚糖水凝胶支架上的生长情况,探讨其构建可注射式组织工程髓核的可行性。方法取3周龄新西兰乳兔,体重150～200 g,雌雄不限,分离培养兔髓核细胞。以壳聚糖、β-甘油磷酸钠水溶液和羟乙基纤维素溶液为原料制备壳聚糖水凝胶支架,并行物理性状及大体观察。将支架与兔髓核细胞复合构建组织工程髓核。复合培养2 d,观察髓核细胞在壳聚糖水凝胶中的存活情况;复合培养1周,扫描电镜观察髓核细胞在支架上的生长情况;复合培养3周后,行组织学、免疫组织化学检测,并用RT-PCR检测其分泌的聚集蛋白聚糖、ColⅡmRNA表达。结果制备的温敏性壳聚糖水凝胶室温呈液态,37℃放置15 min可发生交联反应成为固态凝胶。吖啶橙/碘化丙啶染色示壳聚糖水凝胶中大多数髓核细胞存活,少数死亡,细胞存活率>90%;扫描电镜示髓核细胞分布于网状支架中,细胞表面有分泌的ECM;HE、甲苯胺蓝、番红O染色及免疫组织化学染色结果显示软骨细胞具有分泌ECM的功能;RT-PCR检测示髓核细胞在壳聚糖水凝胶支架中立体培养3周后ColⅡ、聚集蛋白聚糖mRNA分别为0.631±0.064、0.832±0.052,较单纯培养(0.528±0.039、0.773±0.046)分泌基质的能力更强,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论温敏性壳聚糖水凝胶材料具有良好的细胞相容性,髓核细胞与其复合培养后可保持正常形态及分泌功能,有望成为髓核细胞载体构建组织工程髓核。

不同种子细胞复合壳聚糖水凝胶构建可注射组织工程髓核的比较研究

目的比较兔髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)和BMSCs在温敏性壳聚糖水凝胶支架中的生长及细胞外基质合成,筛选用于构建可注射组织工程髓核的种子细胞。方法取3周龄新西兰乳兔,体重150～200g,雌雄不限,分离培养兔NPCs;取1月龄新西兰白兔,体重1.0～1.5kg,雌雄不限,穿刺抽取骨髓分离培养BMSCs。以壳聚糖、β甘油磷酸钠水溶液和羟乙基纤维素溶液为原料制备壳聚糖水凝胶支架。取第2代NPCs和第3代BMSCs分别与壳聚糖水凝胶混匀,构建可注射组织工程髓核。复合培养2d,观察NPCs和BMSCs在壳聚糖水凝胶中的存活情况;复合培养1周,扫描电镜观察两种细胞在支架中的生长分布;复合培养3周,行组织学、免疫组织化学检查,并用RT-PCR检测组织工程髓核中聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA的表达。结果温敏性壳聚糖水凝胶室温呈液态,37℃放置15min发生交联反应成为半固态凝胶。吖啶橙/碘化丙啶染色示壳聚糖水凝胶中多数NPCs和BMSCs存活,少数死亡,细胞存活率均>90%。扫描电镜示NPCs和BMSCs分布于网状支架中,细胞表面有分泌的细胞外基质。HE染色、番红O染色及免疫组织化学染色显示细胞具有分泌细胞外基质的功能。RT-PCR检测示NPCs在壳聚糖水凝胶支架中复合培养3周,Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达量分别为0.564±0.071、0.725±0.046,BMSCs复合培养物分别为0.713±0.058、0.852±0.076,两种细胞比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论温敏性壳聚糖水凝胶具有良好的细胞相容性,与NPCs比较,BMSCs复合壳聚糖水凝胶培养保持了更好的形态、增殖及细胞外基质合成功能。

不同胶原支架对髓核间充质干细胞分化的影响

目的 :比较不同胶原支架中髓核间充质干细胞(NPMSCs)的细胞存活、增殖能力和分化相关基因及蛋白表达等方面的差异。方法:在体外构建Ⅰ型、Ⅰ/Ⅱ型混合和Ⅱ型胶原支架,观察其显微结构、孔隙率及降解特性。从健康雄性大鼠尾椎提取NPMSCs,分别采用细胞微球、Ⅰ型胶原、Ⅰ/Ⅱ型混合胶原、Ⅱ型胶原支架培养,其中细胞微球作为对照。通过乳酸脱氢酶(LDH)检测材料生物毒性,CCK-8测定细胞增殖,实时定量PCR和Western Blot测定SOX9、聚集蛋白聚糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的基因和蛋白表达水平,阿尔新蓝组织学染色检测硫酸蛋白聚糖的表达。结果:Ⅰ型、Ⅰ/Ⅱ型混合和Ⅱ型胶原支架孔隙率均为90%以上,构建21d后的降解率分别为(10.30±0.66)%、(9.87±0.71)%和(10.40±0.53)%。培养后7d细胞LDH检测结果Ⅰ型、Ⅰ/Ⅱ型混合和Ⅱ型胶原支架组分别为12.24±0.65、12.13±1.03、12.67±1.15,与对照组12.50±1.32比较无显著性差异(P>0.05)。胶原支架中培养5d及7d的细胞CCK-8检测结果 (Ⅰ型胶原组为0.67±0.04、1.20±0.05,Ⅰ/Ⅱ型混合胶原组为0.62±0.05、1.20±0.07,Ⅱ型胶原组为0.69±0.02、1.34±0.04)明显高于对照组(0.53±0.03,1.02±0.02)(P<0.05)。培养21d后,三种胶原支架组与对照组比较,SOX9、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的基因表达均显著上升(P<0.05),其中Ⅱ型胶原支架组上述基因表达量最高,与Ⅰ型及Ⅰ/Ⅱ型混合胶原支架组有显著性差异(P<0.05);与对照组比较,Ⅰ型胶原支架组中仅Ⅰ型胶原及聚集蛋白聚糖的蛋白表达上升(P<0.05);Ⅰ/Ⅱ型混合及Ⅱ型胶原支架组中SOX9、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的蛋白表达有显著上升(P<0.05),其中Ⅱ型胶原支架组上述蛋白表达量最高,且与Ⅰ型及Ⅰ/Ⅱ型混合胶原支架组有显著性差异(P<0.05)。阿尔新蓝组织学染色检测硫酸蛋白聚糖在Ⅱ型胶原支架组表达明显高于其余各组。结论:Ⅰ型胶原、Ⅰ/Ⅱ型混合胶原、Ⅱ型胶原支架均促进NPMSC的分化,而Ⅱ型胶原支架促进NPMSC成髓核细胞分化作用尤为显著。Ⅱ型胶原是髓核组织工程学的理想生物支架材料。

细胞密度对髓核细胞产生蛋白聚糖影响的体外实验

背景:退变的椎间盘组织一个重要改变是聚集蛋白聚糖明显减少,如何能够刺激髓核细胞产生更多的蛋白聚糖是学者们一直探索的问题。目的:将椎间盘髓核细胞以不同的密度植入凝胶材料中,评价细胞密度对蛋白聚糖含量的影响。设计、时间及地点:对比观察实验,于2007-08/2008-02在解放军北京军区总医院骨科实验室完成。材料:清洁级3月龄日本大耳兔3只。Live/DeadAssaykit,sGAGAssaykit试剂盒由北京纵横洋洲医药生物科技有限公司提供。方法:无菌条件下取兔椎间盘,常规分离消化其髓核细胞,传第2代时以1.0×109L-1密度接种在自制的壳聚糖支架中,细胞密度扩增至4×109L-1和25×109L-1时进行检测。主要观察指标:阿利辛蓝法测蛋白聚糖含量。氪氩激光器共聚焦显微镜下观察培养细胞存活情况。结果:培养14d,细胞密度为4×109L-1时,聚集的蛋白聚糖总量为(551.65±70.10)mg/L,当细胞密度增加到25×109L-1时,聚集蛋白聚糖总量为(2245.28±462.52)mg/L。但蛋白聚糖增加的量和细胞密度并不成比例,细胞密度增加了6倍,蛋白聚糖含量只增加了两三倍。低密度培养7d时,结果显示100%的细胞存活。高密度培养7d时,30%的细胞在材料中央死亡,边缘部位的细胞几乎全部存活。结论:体外三维培养髓核细胞产生的蛋白聚糖随种植细胞密度增加而缓慢增加,高细胞密度对蛋白聚糖聚集有限制作用。

透明质酸水凝胶包封对携带BMP-2基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞增殖活性及其表达的影响

目的:探讨携带骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后应用透明质酸水凝胶(hyaluronic acid hydrogel,HAH)包封对BMSCs增殖能力及其表达目标蛋白BMP-2的影响。方法:体外分离、提取、鉴定BMSCs,并将提前构建好的Ad-BMP-2转染BMSCs并使用HAH进行包封,激光共聚焦显微镜下观察Ad-BMP-2转染的BMSCs在HAH包封下的三维形态。实验分为4组(各组培养条件无差异):A组(未转染BMP-2的BMSCs);B组(HAH+未转染BMP-2的BMSCs);C组(转染BMP-2的BMSCs);D组(HAH+转染BMP-2的BMSCs)。分别一周内不同时相点(1d、2d、3d……7d)使用CCK-8法检测各组OD值来评价细胞增殖活性;ELISA法检测各组BMP-2的量(pg/ml)来评价目标蛋白的表达状况。结果 :激光共聚焦显微镜三维重建可观察到BMSCs可在HAH中任意平面铺展,有充足的生长空间。BMSCs的增殖活性检测显示,随着培养时间延长,细胞增殖活性逐渐增强,A组、C组4d后的OD值较1d时明显增大(P<0.05);B组和D组5d后的OD值较1d时明显增大(P<0.05);至7d时,A组OD值为1.283±0.061,B组为1.844±0.075;C组为1.570±0.099;D组为1.976±0.142,包封HAH的B、D组OD值均优于没有包封HAH的A、C组(P<0.05)。BMP-2的表达在A、B组较弱,不同时间点间无显著性差异(P>0.05);C、D组的BMP-2表达各时间点均明显高于A、B组(P<0.05);从4d时起,C、D两组的BMP-2表达显著增加(与1d时比较P<0.05),且D组明显优于C组,差异有显著性(P<0.05)。结论 :三维环境下(即包封HAH后),Ad-BMP-2转染的BMSCs不仅有较强的增殖活性;而且对BMP-2的表达具有一定的促进作用。

BMSCs-壳聚糖凝胶复合体移植治疗椎间盘退变的实验研究

目的探讨兔BMSCs-壳聚糖凝胶复合体移植治疗椎间盘髓核缺损退变的效果,为临床应用提供实验依据。方法6只健康1月龄新西兰白兔,雌雄不限,体重1.0～1.5 kg。取骨髓2 mL,分离培养BMSCs。取第3代BMSCs,5-BrdU活细胞示踪剂标记,与壳聚糖凝胶混匀,制备BMSCs-壳聚糖凝胶复合体。将6只动物建立兔椎间盘髓核缺损退变模型,并随机分为3组(n=2):正常对照组仅分离暴露椎间盘,不作任何处理;移植治疗组将30μL自体BMSCs-壳聚糖凝胶复合体注射入缺损椎间盘中心;缺损退变组仅注射入0.01 mol/L PBS液30μL。移植后4周处死动物,取出移植修复的椎间盘,行细胞5-BrdU标记检测、HE、aggrecan番红O染色及ColⅡ免疫组织化学染色;ColⅡ免疫组织化学染色切片行灰度值测定。结果细胞标记检测发现,自体BMSCs移植后继续存活并增殖,形成细胞克隆。正常对照组及移植组椎间盘HE染色示椎间盘结构清晰,髓核组织及外周纤维环分界清晰,细胞核及细胞浆染色明显;缺损退变组示椎间盘结构紊乱,髓核组织和外周纤维化分界不清。aggrecan番红O染色示正常对照组及移植治疗组椎间盘染色明显,椎间盘结构清晰;缺损退变组椎间盘结构紊乱,髓核组织和外周纤维化分界不清。ColⅡ免疫组织化学染色示正常对照组以中央髓核组织染色为主,呈黄褐色阳性反应,椎间盘结构清晰;移植治疗组中央髓核组织呈阳性反应,细胞间质可见明显黄褐色,大体结构仍保持完整;缺损退变组染色较前两组浅,且结构不清。3组ColⅡ免疫组织化学染色切片行灰度值测定,正常对照组为223.84±3.93,与移植治疗组(221.03±3.53)比较差异无统计学意义(P>0.05),但两组与缺损退变组(172.50±3.13)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论兔BMSCs-壳聚糖凝胶复合体可修复椎间盘缺损退变,为临床应用可注射式组织工程髓核移植治疗椎间盘退变奠定实验基础。