组织块结合酶消化法培养婴幼儿血管瘤内皮细胞

目的:探讨血管瘤内皮细胞体外培养的方法并观察其生物学特性。方法:收集新鲜手术切除的婴幼儿血管瘤标本,采用组织块结合酶消化法培养内皮细胞,免疫组化EnVision法对培养的细胞进行鉴定;流式细胞仪FITC-CD34检测内皮细胞纯度;相差显微镜下观察血管瘤内皮细胞的生物学特性。结果:共收集血管瘤标本14例,有8例成功培养出内皮细胞,内皮细胞呈现两种形态:多角形和梭形,经免疫组化鉴定为内皮细胞;培养的细胞中CD34+细胞数为76.28%;血管瘤内皮细胞有明显的"管腔形成"。结论:组织块结合酶消化法能成功培养较纯的婴幼儿血管瘤内皮细胞,培养的内皮细胞具有某些生物学特性。

改良组织块酶消化法原代培养人牙髓干细胞的研究

目的探索应用改良组织块酶消化法原代培养人牙髓干细胞并对细胞进行鉴定。方法选取18~26岁健康人因正畸或阻生而拔除的健康、完整、无龋坏的牙齿30颗,采用改良组织块酶消化法原代培养人牙髓干细胞并通过对细胞的形态观察、细胞表面标记物检测、多向分化能力检测和生长曲线检测等方法鉴定人牙髓干细胞。结果对人牙髓组织经改良组织块酶消化法原代培养得到的细胞形态类似于成纤维细胞和间充质细胞,生长曲线为S型,细胞表面标记物检测显示间充质干细胞标记物CD29、CD44、CD90表达阳性,造血干细胞表面标记物CD34、CD45、CD106表达阴性,同时细胞具有多向细胞分化的能力。结论应用改良组织块酶消化法可以从人牙髓组织中成功原代培养人牙髓干细胞。

应用改良的组织块酶消化法体外培养人大肠癌原代细胞

目的探讨应用改良的组织块酶消化法体外培养人大肠癌原代细胞的方法.方法应用结合组织块法和Ⅳ胶原酶消化法的改良的组织块酶消化法体外原代培养人大肠癌细胞,通过对培养条件、促进贴壁、控制污染、细胞纯化等方面的探索得到了大肠癌细胞,并最终用形态学方法(瑞姬氏染色)、和免疫学方法(免疫细胞化学)鉴定所得细胞.结果经改良的组织块酶消化法体外培养的人大肠癌原代细胞,瑞姬氏染色进行细胞形态学鉴定,结果显示胞核呈紫红色,核质比明显增大,符合肿瘤细胞特征;细胞胃肠癌相关糖链抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,C A19-9)进行细胞免疫学鉴定,结果显示胞浆呈棕色,细胞CA19-9阳性.结论改良的组织块酶消化法在培养方法改良、促进贴壁、控制污染和去除杂细胞四方面进行了改进,既可快速获得游离细胞,又充分利用了未彻底消化的组织块.采用该改良的组织块酶消化法原代培养细胞成功率高,所培养的细胞进行初步鉴定证明为大肠癌细胞.

改良组织块结合胶原酶消化法培养食管癌细胞

目的:探讨食管癌细胞体外分离培养方法,建立合理、高效的食管癌细胞原代培养模式。方法:应用改良的培养方法,即先将组织用机械法剪碎后再用胶原酶进行消化,对13例新鲜的食管癌组织进行体外培养,观察人食管癌细胞生长情况。结果:改良方法培养的细胞生长率为61%,污染率为15%。结论:改良组织块结合胶原酶消化法成功建立了较为合理、高效的食管癌细胞原代培养模式。

两种人鼻咽癌活检组织上皮细胞原代培养方法比较

目的比较两种人鼻咽癌活检组织上皮细胞原代培养方法,并初步探讨鼻咽癌原代培养细胞的生长特性。方法收集未经放、化疗的鼻咽癌初诊病人鼻咽部肿瘤活检组织33例,其中17例采用组织块培养法,16例采用组织块预消化培养法,用含2%胎牛血清的Keratinocyte-SFM培养基培养,比较两种方法干贴壁时间、成功率及细胞长出所需平均天数,并通过倒置显微镜、抗人角蛋白单克隆抗体免疫细胞化学染色、生长曲线、生存分析来观察原代培养细胞的特性。结果组织块培养法成功率为23.5%(4/17),干贴壁时间为4.47±0.48h,细胞长出所需时间为13.75±1.5d;组织块预消化培养法成功率为62.5%(10/16),干贴壁时间为7.88±1.01h,细胞长出所需时间为8.3±4.55d,差异有统计学意义(P<0.05)。组织块培养法,细胞多层重叠排列,结构不清,始终没有继续繁殖生长;组织块预消化培养法,细胞呈梭形,核大居中,多个核仁,抗人角蛋白单克隆抗体免疫细胞化学染色阳性,生存时间均数为62.72d。结论组织块预消化培养法较组织块法成功率高,细胞长出所需平均天数短,干贴壁时间长;低浓度血清的Keratinocyte-SFM培养基适合鼻咽癌原代上皮细胞体外培养。

两种骨髓间充质干细胞分离方法的对比研究

目的比较全骨髓贴壁法和骨组织消化法分离获取骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMMSCs)的效果。方法分离获取小鼠股骨,冲洗骨髓腔并收集骨髓悬液培养BMMSCs为全骨髓贴壁法;去骨髓的股骨剪碎、消化后培养BMMSCs为骨组织消化法。比较两组BMMSCs的原代细胞数量、细胞生长曲线、细胞传代增殖能力、免疫表型及成骨分化潜能。结果骨组织消化法的BMMSCs原代细胞数量明显多于全骨髓组,并且在第7天细胞就可以融合达到90%;骨组织组的BMMSCs生长快,并且细胞传代增殖能力比全骨髓组强,传代计数实验显示第5次传代后,骨组织组的细胞数量达全骨髓组的4倍(P<0.05);流式表型鉴定结果显示,两组细胞均高表达干细胞表面标志物Sca-1及表面黏附分子CD29,其中骨组织组Sca-1及CD29阳性细胞的比例均高于全骨髓组;骨组织组BMMSCs几乎不表达CD45和CD11b,而全骨髓组CD45阳性细胞的比例为3.18%,CD11b阳性细胞的比例为9.11%。两组BMMSCs均能分化为成骨细胞。结论骨组织消化法操作简单、成本低,且获得的BMMSCs纯度高,可短时间内纯化得到大量BMMSC细胞,是基础研究中值得推广的实验方法。

绒山羊附睾上皮细胞培养方法的建立及其生长特性

本研究旨在建立一种简单易行、获取细胞纯度高的绒山羊附睾上皮细胞体外培养体系。10~12月龄绒山羊附睾头部分别采用酶消化法和改良组织块消化法进行原代培养,利用免疫细胞化学染色法和免疫荧光化学法对细胞进行鉴定,同时利用流式细胞仪和CCK法分别检测细胞纯度和增殖情况,在电镜下观察细胞超微结构。结果表明,两种培养方法所获的细胞均呈岛屿状克隆生长和较好的增殖能力,具有活跃的分泌和代谢功能;上皮细胞特异性的角蛋白18和附睾特异性的谷胱甘肽过氧化物酶5(GPx5)的表达以及流式细胞仪结果显示,两种方法所获细胞均为纯度较高的附睾上皮细胞,但改良组织块消化法获得原代细胞需要的时间长,酶消化法获得原代细胞时间短,获得的细胞量大。本研究结果为进一步研究绒山羊附睾上皮功能提供了良好的基础。

间充质干细胞分离方法的研究与进展

背景:间充质干细胞作为种子细胞广泛应用于组织工程和临床治疗,而安全、高效的分选方法是间充质干细胞建系的前提。目的:综述近年来间充质干细胞分选方法的研究进展,比较各方法的优缺点,为安全、高效分离间充质干细胞提供理论依据。方法:第一作者检索CNKI数据库(http://epub.cnki.net/)和Pub Med数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)的相关文献。中文检索词为"间充质干细胞、分离方法";英文检索词为"mesenchymal stem cells(mscs),isolation methods"。查阅1965至2014年来间充质干细胞分离方法的相关文献,包括综述、临床研究和基础研究,最终纳入52篇文献。结果与结论:1全骨髓贴壁法可快速获得大量间充质干细胞,但需要进一步纯化。2梯度密度离心法选择密度为1.073 g/m L的介质在原代能得到相对较纯的间充质干细胞。3组织消化法适用于脂肪、脐带等组织进行消化分离,选用胶原酶Ⅱ消化效果更佳,但是均存在操作技术要求高的缺陷。4免疫磁珠法适用于研究表达特定细胞表面标记物的某一个间充质干细胞亚群的生物学特性。5各种分离方法相结合也是一种理想选择。6对于近年来出现的分离新方法,由于案例有限,其可靠性有待进一步研究。

三种方法原代培养人牙周膜细胞

背景:牙周膜细胞培养是牙周细胞生物学研究的基础。牙周膜细胞原代培养因其成功率较低,一直是制约牙周细胞生物学研究的瓶颈之一。如何寻找一种简单有效的培养方法,提高原代培养成功率一直是近年来牙周细胞生物学的研究热点之一。目的:比较组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法对人牙周膜细胞的培养效果,探索一种更有效的人牙周膜细胞的体外培养方法。方法:取58例正常恒牙牙周膜组织,随机分为3组,分别采用组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法进行原代培养,再进行传代培养、倒置显微镜下观察细胞生长情况以及细胞形态;免疫组织化学鉴定波形蛋白与角蛋白;取第4代细胞,绘制生长曲线。结果与结论:酶消化结合组织块法培养成功率(35%)明显高于其他两种方法(11%和21%)。3种方法获得的细胞均符合正常人牙周膜细胞形态学特征和生物学特征,生长良好。第4代细胞生长曲线均为近似的"S"形,有明显的滞留期、对数生长期和平台期。提示实验建立的酶消化结合组织块法较为简单并具有较高的成功率,是一种培养牙周膜细胞的可行办法。

人黄韧带细胞体外原代培养方法的比较

目的比较不同的人黄韧带细胞(LFCs)原代培养方法,优化培养条件,提高培养成功率。方法采集成年腰椎间盘突出症患者后路椎间盘摘除术中的黄韧带,分别采用组织块法、酶消化法、胶原酶消化加组织块法体外原代培养LFCs,传代培养;倒置相差显微镜下观察细胞从组织块内迁出时间、细胞形态和生长状态;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定其吸光度(OD)值,评价细胞增殖状况,绘制细胞生长曲线;用免疫荧光染色法检测传3代细胞的波形蛋白和Ⅰ型胶原的表达。结果胶原酶消化加组织块法中组织块解离、贴附和细胞游出状况均优于单纯组织块法或单纯酶消化法,成功率较高。原代培养细胞的波形蛋白和Ⅰ型胶原免疫荧光染色呈阳性。结论胶原酶消化加组织块法可提高LFCs原代培养的成功率。

新生大鼠肝细胞分离及体外培养方法

背景:新生大鼠肝细胞是中度分化细胞,兼具肝祖细胞和成熟肝细胞的特性和功能,是研究肝细胞特性的理想细胞来源。目的:探讨新生大鼠肝细胞分离及体外培养方法。设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/08在解放军总医院普通外科研究所完成。材料:SD新生大鼠,雌雄不限,3月龄。方法:采用组织块-胰酶冷消化法和多步低速离心获取新生大鼠肝细胞,给予含体积分数10%胎牛血清的HepatoZYME-SFM培养基体外二维培养。采用相差显微镜观察、MTT分析、PAS染色和脲酶法对培养的肝细胞生长及功能进行检测和分析。主要观察指标:肝细胞形态、活性,糖原水平,培养上清中的尿素浓度。结果:分离纯化的新生大鼠肝细胞总数1.0×106～2×106/肝,活力在90%以上,光镜下肝细胞呈圆形或卵圆形,核大而圆,胞体较成熟肝细胞小。通过多步低速离心可去除红细胞、其他非实质细胞和死亡的肝细胞,其纯度可达95%以上。肝细胞活性在培养初期即缓慢上升,至第3天时开始快速增殖,第11天时达到高峰,与第1天相比差异有显著性意义(P=0),但随后又缓慢降低,到15天时与第11天相比差异有显著性意义(P=0)培养的肝细胞贴壁生长,并保持肝细胞特异细胞形态。培养至第7天的肝细胞PAS染色呈强阳性,之后阳性细胞逐渐减少,至15d时可见少量阳性细胞。培养上清中尿素在培养初期基本没有变化,培养至第7天时显著下降。结论:组织块-胰酶冷消化法和HepatoZYME-SFM培养基二维培养为种简单有效的新生大鼠肝细胞分离培养方法。

联合培养法进行人牙周膜细胞的比较培养与鉴定

目的比较消化法与组织块法联合培养与单纯组织块法两种方法获得人牙周膜细胞的成功率及细胞来源鉴定情况.方法刮取因正畸需要而拔牙的牙周膜,分别进行组织块法和消化法与组织块法联合培养进行人牙周膜细胞的原代培养,并进行波形丝蛋白、角蛋白和碱性磷酸酶(ALP)的检测,以鉴定细胞来源.结果组织块法在1～2周内有原代细胞游出.在第2或第3天,联合培养法消化游离出来的细胞开始贴壁,消化后的疏松状牙周膜亦可贴壁,且有细胞爬出.组织块法的成功率为27%,联合培养法成功率为70%.ABC免异组化法及ALP鉴定其为非牙龈来源的中胚层细胞.结论联合培养法可显著提高原代细胞培养的成功率,并在短期内获得大量和相对纯化的实验用细胞.

三种方法培养慢性阻塞性肺疾病大鼠气道平滑肌细胞的比较

背景:原代培养方法被广泛应用于正常和哮喘大鼠气道平滑肌细胞的培养,但少见用于慢性阻塞性肺疾病大鼠气道平滑肌细胞培养的报道。目的:建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型,比较组织块法、酶消化法和改良组织块消化法原代培养模型大鼠气道平滑肌细胞生长情况的差异。方法:将16只清洁级雄性健康SD大鼠随机分成2组,对照组正常饲养,慢性阻塞性肺疾病组用熏烟法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型,显微镜下观察大鼠肺组织病理学特点。分别应用上述3种方法原代培养慢性阻塞性肺疾病大鼠气道平滑肌细胞,相差显微镜下观察细胞形态,用α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色鉴定细胞类型。结果与结论:经病理学证实成功构建慢性阻塞性肺疾病大鼠模型。在倒置相差显微镜下见培养的细胞表现为典型的"谷-峰状"生长。经免疫细胞化学染色后,可见胞质呈棕色阳性反应,所培养的细胞有94%以上为气道平滑肌细胞。3种方法在耗时和细胞质量方面均无明显差别,但组织块法更经济、稳定可靠和简单。

血管瘤血管内皮细胞体外分离纯化方法的优化

目的:寻找更高效的婴幼儿血管瘤内皮细胞培养方法,为婴幼儿血管瘤的研究提供基础的科研保证。方法:选取增生期婴幼儿血管瘤手术标本,采用组织块贴壁法与酶消化法结合进行原代培养;二代细胞进行流式分选,取CD31阳性的细胞继续培养。分别进行细胞形态学观察、细胞表面标记物免疫荧光鉴定、细胞表面标记物流式鉴定。结果:培养48～72h清晰可见组织块周围细胞游出,细胞核清晰,细胞呈长梭形及多边形,2周左右部分可形成"血管腔样"结构,20d可铺满平传代;细胞流式测定CD31阳性率达98.4%,VWF与CD31双阳率90.3%,免疫荧光染色CD31、VWF均呈阳性表达。结论:组织块与消化结合法经流式分选后可获得高纯度的内皮细胞,为下一步研究婴幼儿血管瘤增生消退机制奠定了基础。

改良原代大鼠骨源间充质干细胞的体外培养方法及鉴定

目的改良原代大鼠骨源间充质干细胞体外分离培养方法,以获得纯度高、增殖活力强、分化潜能大的理想工程细胞。方法基于“仿原位生态培养”方法及原理,剪取大鼠前后肢股骨、胫骨,剔除附着的肌肉、筋膜组织,完全不用冲洗骨髓腔,直接将其剪碎成约1 mm^(3)骨块后,移入0.1%Ⅱ型胶原酶中消化90 min;经洗涤、离心后,接种于培养皿中进行原代培养。当细胞融合度达80%~90%时,予0.25%胰蛋白酶消化液进行二次消化,按1:3比例进行传代培养。采用流式细胞仪检测第4代细胞表面CD分子标志物,并进行成脂、成骨诱导分化实验。结果接种48 h后,少量长梭形细胞从骨块周围爬出;96 h后,细胞逐渐融合成片;传至第4代时,细胞形态均一,以“成纤维样”细长梭形为主,融合后呈“涡旋式”生长,具有一定方向性;传至第10代,细胞形态仍基本保持不变。流式细胞仪检测结果提示CD44、CD90和CD29表达阳性,CD34、CD11b/c和CD45呈阴性表达;成脂、成骨诱导分化实验均为阳性。结论基于“仿原位生态培养”原理,采用组织块结合酶消化法,能够简单、高效分离培养出大鼠骨源间充质干细胞,值得推广。

酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的 提高人牙周膜成纤维细胞 (humanperiodontalligamentfibroblasts,HPLF)原代培养的成功率 ,快速建立体外细胞研究模型。方法 采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块 ,获取细胞 ;用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源 ,通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果 原代培养成功率为 77 8%。获得的细胞呈梭形 ,抗波形丝蛋白染色呈阳性 ,抗角蛋白染色呈阴性 ,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性 ,生长良好。结论 酶消化组织块法可显著提高人牙周膜成纤维细胞原代培养成功率 ,方法可行。

组织块消化法原代培养大鼠输精管平滑肌细胞及鉴定

目的建立一种稳定高效、存活率高的大鼠输精管平滑肌细胞体外分离及培养方法,为相关研究提供理想的细胞模型。方法采用组织块消化法对大鼠离体输精管平滑肌细胞进行原代培养。采用形态学观察、HE染色、抗α-SMA免疫细胞化学荧光染色对细胞进行鉴定,台盼蓝染色计算细胞存活率及细胞总数,胰酶消化传代并绘制生长曲线。结果对照实验表明胶原酶Ⅱ消化效果优于胶原酶Ⅰ,最佳消化时间为60 min,同时控制吹打次数、沉淀时间及培养环境,获得了理想的平滑肌细胞总数及存活率。平滑肌细胞呈典型的梭形、长条形,可传代,且出现平滑肌细胞培养典型的"峰-谷"状特征,生长曲线为"S"型。经抗α-SMA免疫荧光鉴定,培养细胞为平滑肌细胞,纯度为(92.6±4.3)%。结论采用组织块消化法成功建立了大鼠输精管平滑肌细胞的体外分离及培养方法。

具有抗氧化能力的人脐带间充质干细胞制备及评价策略研究

目的:从人脐带中分离制备一种具有抗氧化能力的间充质干细胞(antioxidant mesenchymal stem cell,AO-MSC)并评价其细胞生物学特性。方法:采用无血清培养体系,结合胶原酶消化培养法以及胶原酶消化组织块培养法,从人脐带华通氏胶组织分离培养MSC。使用0.2%Ⅱ型胶原酶消化,未完全消化的组织块贴壁培养收获AO-MSC。以常规消化培养法为对照。成纤维细胞集落形成实验检测MSC集落形成能力;CCK-8检测MSC增殖能力;流式细胞术及免疫荧光染色检测MSC表面标志物;体外诱导分化评价MSC成脂成骨能力,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测成骨和成脂关键转录因子的表达差异;RT-qPCR检测MSC抗氧化还原物质SOD-1、GSH、GAT、NQO1的表达情况。结果:本策略分离的AO-MSC在18 d汇合率为80%-90%,细胞呈漩涡状生长。流式细胞术及免疫荧光染色检测结果显示,AO-MSC高表达CD73、CD29、CD105、CD90,低表达CD31、CD45、HLA-DR;胶原酶消化组织块培养法收获的AO-MSC自我更新及分化能力强于对照组MSC;对照组MSC体外成脂成骨能力强于胶原酶消化组织块培养法所得AO-MSC;RT-qPCR检测结果显示,胶原酶消化组织块培养法收获的AO-MSC其表达的抗氧化还原物质水平高于对照组。结论:成功制备了基于无血清体系的具备抗氧化能力的人脐带MSC。

探讨年龄因素对人黄韧带细胞原代培养的影响

目的探讨从不同年龄的人获得黄韧带组织与原代培养细胞游出之间的关系,以提高黄韧带细胞原代培养的成功率。方法采用酶消化加组织块培养法,对来自21例不同年龄腰椎管狭窄和腰椎间盘突出症患者的黄韧带组织进行黄韧带细胞原代培养,倒置相差显微镜下观察细胞从组织块迁出时间、形态和生长状态;采用细胞免疫荧光染色法对传第3代细胞进行Ⅰ型胶原和波形蛋白表达鉴定;对组织块内细胞游出率和年龄进行相关性分析。结果倒置显微镜下见黄韧带细胞形态生长良好,培养细胞的波形蛋白和Ⅰ型胶原免疫荧光化学染色均呈阳性。患者年龄与黄韧带组织块原代培养时细胞游出率之间呈负相关关系(r=-0.618,P<0.05),年轻患者黄韧带组织细胞游出率高。结论原代培养人黄韧带细胞时尽量采用年轻人黄韧带组织。