内皮祖细胞作为组织工程瓣膜内皮种子细胞的可行性研究

目的探讨利用外周血内皮祖细胞(EPCs)制备组织工程瓣膜的可行性。方法分离人外周血EPCs,采用酶-去垢剂法去除新鲜猪主动脉瓣细胞制备去细胞瓣膜支架,将培养的人外周血EPCs接种到去细胞瓣膜上。结果经酶-去垢剂法去除新鲜猪主动脉瓣细胞后,细胞成分全部去除,纤维支架保存完好。去细胞处理后瓣膜无明显细胞毒性。人外周血EPCs与去细胞瓣膜共孵育2周后,细胞紧贴瓣膜表面生长形成一层连续的单细胞层,初步生物力学测定示去细胞前与再内皮化后,瓣膜力学特性无明显改变。结论外周血分离培养扩增得到的EPCs能够再内皮化去细胞猪主动脉瓣构建组织工程瓣膜,外周血EPCs是组织工程瓣膜内皮种子细胞的新的来源。

组织工程心脏瓣膜体外脉动反应器的初步研制

目的:探讨自行研制的体外脉动反应器应用于组织工程心脏瓣膜应力预适应的可行性。方法:根据流体力学原理,采用特殊材料自行设计制作了体外脉动反应器和预适应应力培养系统;将生物瓣置于反应器中运转,观察生物瓣的工作状态和系统的稳定性。以脱细胞猪主动脉瓣作支架,新生牛主动脉内皮细胞作种子细胞构建组织工程心脏瓣叶,静态培养4 d后,置入反应器内进行预适应处理24 h(流量由30 ml/min调至400 ml/min,频率30次/min),观察内皮细胞残留情况,并与静态培养的瓣膜相比较。结果:预适应应力培养系统能产生搏动性液体流,生物瓣正常工作,运转7 d,系统状态稳定。静态培养成功构建组织工程心脏瓣膜,内皮细胞与瓣叶支架黏附紧密,沿瓣叶表面形成单层细胞层,生长状态良好;动态培养的瓣叶内皮细胞部分被冲刷脱落,但仍有少部分细胞(6.26％)残留黏附。结论:自行设计和构建的体外脉动反应器基本能模拟体内心脏瓣膜的血流动力学,用于组织工程心脏瓣膜预适应研究具有可行性。

胶原膜与聚-β-羟基丁酯在组织工程心脏瓣膜中应用的研究

目的 :对胶原膜与聚 β 羟基丁酯在组织工程心脏瓣膜技术中的应用进行比较。方法 :对照研究胶原膜和聚 β 羟基丁酯膜在材料结构、皮下包埋和细胞生长对照实验情况。结果 :胶原膜呈网孔状结构 ,皮下包埋8周仍保持膜状结构 ,皮下包埋 8～ 12周完全降解 ,生物相容性优于聚β羟基丁酯膜。结论 :胶原膜在材料结构特征、降解率和生物组织相容性方面均优于聚β羟基丁酯 。

人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架构建的组织工程心脏瓣膜

背景:去细胞处理的猪主动脉瓣膜植入人体后发生了免疫排斥反应,分析引起免疫排斥反应的原因是由于猪瓣膜的细胞外基质与宿主发生接触引起了免疫激活。目的:试图将人自身的细胞外基质履盖去细胞猪瓣膜表面起到隔离猪瓣膜与宿主血液成分接触的作用。同时应用免疫组化的方法验证人细胞外基质覆盖瓣膜的效果。设计、时间及地点:观察性实验,于2008-08/2009-04在解放军第二军医大学长海医院胸心外科实验室完成。材料:新鲜猪心脏瓣膜取自上海五丰上食肉联厂,采用酶消化法将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理。密度梯度离心法从健康志愿者骨髓中获取骨髓基质干细胞。方法:用人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架来构建组织工程瓣膜,再应用前期制备的抗人细胞外基质单克隆抗体,采用免疫组织化学染色鉴定人细胞外基质在体外构建的组织工程瓣膜上的黏附情况。以未构建的去细胞猪瓣叶为对照组。主要观察指标:①组织工程瓣膜上种子细胞的黏附和生长情况。②免疫组织化学法检测人细胞外基质在瓣膜上覆盖的效果。结果:光镜下观察瓣膜表面均形成了细胞层。扫描电镜所见细胞排列欠规则,未完全覆盖去细胞瓣叶表面,可见裸露的瓣膜支架。免疫组织化学方法检测构建的瓣膜表面呈阳性反应证明有人的细胞外基质黏附,而对照组呈阴性证明了检测方法具有特异性。结论:体外构建的组织工程瓣膜上检测到有人的细胞外基质黏附。

应用胶原膜构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的 :探讨应用胶原膜构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法 :扫描电镜观察材料结构特点。材料兔皮下包埋实验 ,分别于 4,6 ,8,12周观察材料的生物相容性和降解率。培养犬主动脉瓣间质细胞、主动脉壁间质细胞和皮肤成纤维细胞 ,对照其生长曲线、平滑肌α肌动蛋白表达和扫描电镜特点。将犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞种植于胶原膜上 ,观察其形态并测定细胞合成前列环素的功能。结果 :胶原膜呈网孔状结构 ,孔径 10 7μm。皮下包埋实验显示材料生物相容性好 ,体内降解时间为 12周。犬主动脉瓣间质细胞和主动脉壁间质细胞平滑肌α肌动蛋白均为部分阳性表达 ,细胞内有大量粗面内质网 ,生长曲线相似。种植实验示细胞在材料表面生长良好 ,并具有合成、分泌前列环素 (84.2 pg/ m L vs0 .4pg/ m L ,P<0 .0 5 )的功能。结论 :以胶原膜为支架体外构建组织工程心脏瓣膜细胞不仅能在材料表面生长 ,还能合成、分泌血管活性物质 ,是具有“生理功能 "的组织工程心脏瓣膜。

转化生长因子-β_1对体外构建组织工程瓣膜的实验研究

目的研究转化生长因子-β1(TGF-β1)在组织工程心脏瓣膜(TEHV)体外构建中的作用。方法经胰酶/EDTA、去污剂Triton X-100和核酸酶处理,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分,然后在其表面种植大鼠肌成纤维细胞,构建TEHV。实验组培养基中添加TGF-β1(10ng/ml),对照组采用普通培养基。体外培养2周后取瓣叶,行HE染色和扫描电镜观察,并检测羟脯氨酸、DNA含量及瓣叶最大负荷力,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测瓣膜细胞MMP-13和TIMP-1mRNA的表达。结果HE染色和扫描电镜显示实验组较对照组的细胞联合紧密且细胞外基质更丰富,羟脯氨酸含量和DNA含量增高,最大负荷力提高,MMP-13mRNA和TIMP-1mRNA的表达增强。结论TGF-β1在TEHV体外构建过程中具有积极作用,能为种子细胞生长提供有利因素,促进细胞增殖和细胞外基质分泌,提高瓣膜的最大负荷力。

应用骨髓干细胞和自制胶原-壳聚糖构建组织工程心瓣膜

目的探讨应用骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化的内皮细胞为种子细胞,以胶原-壳聚糖复合物为支架材料,运用组织工程学的原理和方法体外构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)的可行性。方法兔主动脉壁体外分离、培养、传代平滑肌细胞、成纤维细胞,将培养的成纤维细胞、平滑肌细胞与兔骨髓基质干细胞诱导分化的内皮细胞按顺序种植在预湿处理的胶原-壳聚糖复合支架上,通过组织学及倒置显微镜、扫描电镜观察内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞在支架上生长、增殖和基质分泌情况。结果 HE染色示内皮细胞能够在胶原-壳聚糖复合支架黏附、伸展、增殖,在TEHV表面长成连续的细胞层;扫描电子显微镜示TEHV表面光滑,细胞生长良好,细胞层完整,且瓣膜表面的内皮细胞具有合成和分泌前列环素(PGI2)的功能。结论以兔主动脉壁体外分离、培养、传代的平滑肌细胞、成纤维细胞和BMSCs诱导分化的内皮细胞为种子细胞,依次种植在胶原-壳聚糖复合支架上可以构建TEHV,且内皮细胞能够分泌PGI2。

心脏瓣膜组织工程中理想种植细胞的来源比较

背景:现有的人工瓣膜,无论是机械瓣膜还是生物瓣膜,都存在与取材有关、无法从工艺制作方式改进解决的固有缺陷。组织工程心脏瓣膜概念的提出为解决该难题提供了新的方向。目的:通过比较成熟分化血管内皮细胞和骨髓间充质干细胞骨的获取手段、体外增殖能力以及在脱细胞基质上的生长情况,分析何者更适合作为制备组织工程人工心脏瓣膜的种植细胞。设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-06/09在上海市胸科医院动物实验基地完成。材料:用胰蛋白酶(胰酶)-EDTA、TritonX-100、DNase、RNase消化猪主动脉瓣膜获得脱细胞基质。从1只12kg2岁雄性杂交犬大隐静脉、股外侧动脉及肋骨骨髓获取种植细胞。方法:用胰酶消化并收集内皮细胞,收集骨髓细胞,分别进行培养。通过贴壁法获得内皮细胞及骨髓间充质干细胞。利用内皮细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,并绘制细胞生长曲线。以抗Ⅷ因子抗体以及抗血管内皮生长因子抗体荧光染色,荧光显微镜观察。将细胞种植于脱细胞瓣膜上培养3d后进行扫描电镜观察。主要观察指标:①试验犬伤口愈合情况。②细胞培养、增殖情况。③骨髓来源骨髓间充质干细胞表型分析以及形态学观察。结果:成熟血管内皮细胞体外增殖能力低下,骨髓间充质干细胞则增殖旺盛。生长曲线显示骨髓间充质干细胞的倍增时间约30h,而成熟内皮细胞生长曲线平直。对骨髓间充质干细胞进行抗Ⅷ因子抗体以及抗VEGF抗体荧光染色,可见荧光染色阳性。扫描电镜见种植骨髓间充质干细胞的脱细胞瓣膜上散在星状细胞贴附。结论:骨髓间充质干细胞体外增殖能力强,在内皮细胞生长因子诱导下可向内皮细胞转化,并可以生长贴附于脱细胞瓣膜,是作为组织工程人工心脏瓣膜制备的理想细胞来源。

去细胞组织工程异种瓣膜支架制备方法的比较(英文)

背景:采用何种去细胞方法以获取良好的低抗原异种生物瓣膜支架是构建组织工程瓣膜的前提。目的:通过测试不同脱细胞方法的效果及保留脱细胞支架的能力来探讨异种组织工程心脏瓣膜生物支架的最佳制备方法。设计、时间及地点:前瞻性随机对照实验,于2007-01/2008-06在泰安市中心医院中心实验室完成。材料:16个新鲜猪主动脉瓣分为4组,对照组,NaCl-SDS组、胰蛋白酶组、曲拉通组,每组4个。方法:对照组未经去细胞处理,3个实验组分别用NaCl、胰蛋白酶、Triton-100脱细胞处理。主要观察指标:各种方法处理后的猪心脏瓣膜支架大体标本结构,光学和电子显微镜观察超微结构。采用免疫组化法检测血管内皮细胞MHC-Ⅰ类抗原的表达。结果:NaCl-SDS法脱细胞处理的瓣膜内皮细胞去除不彻底,细胞外基质的三维网状结构虽完整但纤维模糊,肿胀。胰蛋白酶法处理的瓣膜内皮细胞基本去除,但瓣膜支架结构改变很明显,胶原纤维肿胀,边缘毛糙,纤维网状间隙增宽、不规则。曲拉通法处理的瓣膜内皮细胞去除彻底,支架结构保存完好。NaCl-SDS法、胰蛋白酶法和曲拉通法脱细胞后的瓣膜均存在一定的免疫原性,但用胰蛋白酶法和曲拉通法脱细胞后的瓣膜支架所表达的免疫原性较NaCl-SDS法显著降低。结论:应用曲拉通法制作的瓣膜支架去内皮细胞较为彻底,不改变瓣叶支架结构,而且免疫原性小。

外周血分离制备组织工程瓣膜内皮种子细胞的研究

目的:探讨从外周血分离制备组织工程瓣膜内皮种子细胞的方法。方法:采集正常人外周血,用密度梯度离心法分离单个核细胞(MNCs)进行体外定向培养,应用免疫组织化学和细胞流式术进行内皮细胞表面标记物检测,应用细胞荧光化学检测培养细胞的内皮细胞功能,用硝酸还原酶法测培养液中的NO, 最后进行细胞计数。结果:人外周血MNCs经体外培养,表达内皮细胞的特异性抗原,包括Ⅷ因子(VWF)、 VE-Cadherin、KDR和CD34,早期(7 d内)还表达CD133并显示出能内吞乙酰低密度脂蛋白(acLDL)以及释放NO的内皮细胞特性,培养10 d后细胞融合生长,20 d左右成典型的鹅卵石样内皮细胞形态,28 d 时细胞数量级达到107。结论:用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞进行体外定向培养可以获得作为组织工程瓣膜种子细胞的血管内皮细胞。

Amplex Red荧光法检测组织工程瓣膜赖氨酰氧化酶活性

目的采用Amplex red荧光法检测组织工程心脏瓣膜(tissue engineered heart valve,TEHV)中赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)的活性。方法经胰蛋白酶+乙二胺四乙酸、聚乙二醇辛基苯基醚和核酸酶处理,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分,然后在其表面种植大鼠肌成纤维细胞,构建TEHV。用高糖培养基在体外培养瓣膜27 d,再用不含酚酞和血清的培养基培养24h,收集此时的培养基作为样本,用Amplex red荧光法检测样本中LOX的浓度,同时应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TEHV中LOXmRNA的表达。结果样本中LOX的荧光值为45.60±1.66,根据标准曲线获得相应的LOX浓度为0.123±0.003μg/ml,同时各个TEHV均有LOXmRNA的表达,与Amplex red荧光法检测的结果相一致。结论应用Amplex red荧光法检测TEHV中LOX的活性具有可行性,并为反映LOX对TEHV细胞外基质中胶原交联的重要作用提供了方法依据。

间充质干细胞构建组织工程瓣膜的生物力学性能研究

目的采用碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)联合间充质干细胞(mesenchy-mal stemcells,MSCs)构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineered heart valve,TEHV),并对其生物力学性能进行研究。方法分离培养大鼠MSCs,进行细胞鉴定后种植于去细胞瓣叶支架上。将瓣叶置于含5 ng/ml bFGF的培养液中,分别培养7 d和14 d作为实验组A和实验组B。实验组C除培养液中不添加bFGF外,其余同实验组B。对照组为大鼠肌成纤维细胞构建的TEHV。对各组TEHV进行形态学观察,生化检测和生物力学测试。结果MSCs表达CD29(94.82%)和CD44(93.59%)。各组TEHV具有相似的形态结构,DNA和羟脯氨酸含量、最大负荷、最大应力、最大应变和弹性模量的差异无统计学意义(P>0.05)。结论采用MSCs和肌成纤维细胞构建的TEHV具有相同的生物力学性能,而采用bFGF联合MSCs体外构建TEHV能在更短的时间内获得相同的生物力学性能。

组织工程心脏瓣膜支架材料的血液相容性

目的:评价去细胞猪主动脉瓣、胶原-透明质酸钠复合膜、胶原膜、胶原-壳聚糖复合膜的血液相容性,展望其在组织工程心脏瓣膜支架材料中的应用前景。方法:进行体外的动态凝血试验、血小板黏附性能试验、溶血试验和体内的犬腹主动脉内移植试验的血液相容性评价。结果:4种材料的溶血率均小于5%;前3者的OD-凝血时间曲线下降缓慢且吸光度高,同时血小板黏附少且没有明显变形和伪足。腹主动脉包埋试验大体解剖只有胶原-壳聚糖复合膜形成血栓。结论:前3种材料在血液相容性方面适合组织工程心脏瓣膜的要求;胶原-壳聚糖复合膜需要改进。

组织工程心脏瓣膜构建的研究新进展

在全球范围内每年约280 000个瓣膜置换术需进行[1],并且逐年增长,有研究预测到2050年需瓣膜置换术的人数将达850 000[2].我国每年也有近10万例患者接受瓣膜置换术,机械瓣膜和生物瓣膜在瓣膜置换术中的使用数量相当.然而目前的瓣膜假体存在许多问题：机械瓣有感染和血栓栓塞并发症的发生,为了防止血栓形成,需要终身抗凝治疗（如华法林）,由此而造成的出血发生率大大增加;生物瓣寿命只有10~15年,而且瓣膜开裂、瓣膜变性、瓣膜钙化等一系列问题还没有十分有效的预防措施;并且由于机械瓣和生物瓣再生、成长能力及耐用性的不足,尤其在儿童和年轻人中应用受到限制.为克服目前假体瓣膜在临床上的局限性,组织工程心脏瓣膜（tissue engineered heart valve,TEHV）应运而生.TEHV因其优良的组织相容性、耐久性及可生长性,不良反应小,具有非常大的临床应用潜能.现就TEHV的支架材料改性、种子细胞、支架材料与种子细胞的相互作用、生物反应器、临床研究以及微创TEHV植入等方面作如下综述.

Galectin-8蛋白对组织工程心脏瓣膜种子细胞的增殖、黏附功能的影响

目的体外研究Galectin-8在不同浓度或状态下对组织工程心脏瓣膜种子细胞增殖及黏附的影响。方法以骨髓间充质干细胞分化而来的内皮细胞作为种子细胞,离体状态下常规培养。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定不同浓度下Galectin-8作用12、24、48 h后对细胞增殖的影响;将细胞分为重组质粒p GFP-Galectin-8转染组、空质粒p GFP转染组、阴性对照组及蛋白预铺组,分别铺于96孔板中,观察相同时间段的细胞黏附数量。结果 Galectin-8 10、20、40μg/ml剂量组的细胞增殖数目均显著高于空白对照组,其中20μg/ml组表现尤为显著(P<0.05);p GFP-Galectin-8转染组的转染效率与空质粒p GFP转染组无显著差异(P>0.05),且Galectin-8的表达量显著高于空质粒p GFP转染组和阴性对照组(P<0.05);细胞种植到培养板上1、2、4 h后,蛋白预铺组相同时间的细胞黏附数量显著高于其他各组(P<0.05),p GFP-Galectin-8转染组的细胞黏附数量显著小于其他各组(P<0.05),空质粒p GFP转染组和阴性对照组的细胞黏附数量无显著差异(P>0.05)。结论 Galectin-8对内皮细胞的增殖具有促进作用,且在细胞种植前预铺蛋白固定后能够显著增加内皮细胞的黏附,而胞内Galectin-8过表达则抑制细胞黏附。

环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶1、3表达的影响

目的探讨环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶-1、3(matrix metalloproteinase-13、,MMP-1、3)表达的影响。方法采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备的脱细胞猪主动脉瓣膜支架作为对照组,用30 g/L环氧氯丙烷处理24 h的去细胞支架材料作为实验组。将培养的人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymalstem cells,hBMSCs)种植于脱细胞支架上的组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV),分别行石蜡包埋切片HE染色和扫描电镜观察TEHV的组织结构,并行RT-PCR测定hBMSCs分泌MMP-1、3的功能。结果hBMSCs在实验组脱细胞瓣膜表面生长良好,MMPs的表达比对照组降低。结论环氧氯丙烷处理的脱细胞猪主动脉瓣膜支架,可以抑制hBMSCs的MMP-1、3的表达。

风湿性心脏病患者瓣膜组织自身抗原变化与IL-10、TGF-β1血清浓度变化之间的关系

目的:探讨风湿性心脏病(RHD)患者瓣膜组织自身抗原细胞变化及外周血指标细胞的检测结果与IL-10、TGF-β1血清浓度间的关系。方法:对63例RHD患者和63例健康志愿者清晨空腹采集抗凝外周静脉血,应用流式细胞检测法对CD4+、CD25+、调节性T细胞的标志性分子(Foxp3 Treg)的比例进行检测,ELISA检测IL-10、TGF-β1的浓度;构建风湿性心脏病基因表达文库筛选相应抗原。结果:自身抗原RHDAG1与对照组间具有明显的差异,RHD患者血清Treg比例低于对照组样本中的相关数据,IL-10、TGF-β1血清浓度的比较具有差异性,组间比较具有统计学差异。结论:自身抗原RHDAG1的表达对RHD的进展有一定作用,对外周血相关指标的浓度及Treg细胞变化的检测对RHD的诊断具有一定的临床意义。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽固定去细胞瓣构建组织工程瓣膜的实验研究

目的:研究促黏附分子精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽对去细胞瓣组织工程心脏瓣膜(TEHV)构建的影响。方法:酶+去污剂法制备去细胞瓣天然支架,应用化学交联剂Sulfo-LC-SPDP,使GRGDSPC肽与之稳定结合,然后表面种植大鼠肌成纤维细胞以构建TEHV。实验组采用GRGDSPC肽固定去细胞瓣,对照组则为未处理去细胞瓣。体外培养1周后取瓣叶,作苏木精-伊红(H-E)染色和扫描电镜观察,检测羟脯氨酸和DNA含量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测瓣膜Ⅰ型胶原、赖氨酰氧化酶(LOX)mRNA表达。结果:与对照组比较,实验组形态学显示细胞紧密联合且胞外基质丰富,羟脯氨酸和DNA含量值增高,Ⅰ型胶原、LOX mRNA表达增强。结论:RGD肽表面修饰去细胞瓣,提高天然支架细胞黏附性,促进种子细胞生长、繁殖与细胞外基质分泌,有利TEHV构建。

脱细胞猪主动脉瓣膜与可降解聚合材料共同构建复合组织工程瓣膜

目的对新型复合组织工程瓣膜进行体外生物力学和动物体内移植试验,为临床应用过渡提供依据。方法以脱细胞猪主动脉瓣作为支架,用可降解聚合材料3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate,PHBHHx)涂层,构建新型复合组织工程瓣膜。(1)复合组织工程瓣膜、新鲜猪主动脉瓣和脱细胞猪主动脉瓣各12枚,用单轴生物拉伸机进行体外生物力学测试;(2)小尾寒羊10只,其中5只在全身麻醉非体外循环下接受复合组织工程瓣膜,移植到羊的肺动脉瓣位;其余接受脱细胞猪主动脉瓣作为对照。术后18周处死动物,取出移植瓣膜,进行组织学、免疫荧光染色、扫描电子显微镜检查和钙含量测定。结果复合组织工程瓣膜保持了自然瓣形态,抗拉强度显著提高(P<0.05);瓣膜柔软,表面光滑无血栓;免疫荧光染色检测,瓣膜新生内膜中内皮细胞呈CD31阳性反应,沿瓣表面连续排列,间质细胞呈现单克隆鼠抗人平滑肌actin(SMA)阳性反应;复合组织工程瓣膜钙含量明显低于脱细胞猪主动脉瓣(P<0.05)。结论复合组织工程瓣膜具有自然瓣膜的三维形态结构,良好的生物力学特性、生物相容性和细胞引导性,初步具备组织工程瓣膜雏形。