贝类中3种组织血型抗原ELISA检测方法的建立与分型

人类组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)是诺如病毒(NoVs)的结合受体,本研究假设贝类中也存在类似的HBGAs并且特异性地富集NoVs,利用HBGAs单克隆抗体,建立贝类中3种HBGAs的ELISA检测方法,分析牡蛎(Crassostrea gigas)、缢蛏(Sinonovacula constricta)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)、紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)、毛蚶(Scapharca subcrenata)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)等6种双壳贝类中HBGAs的类型。结果显示,在上述6种贝类中都检测出A型抗原,其中菲律宾蛤仔的检出率为11.6%(9/77),紫贻贝的检出率为28.1%(16/57),缢蛏样品为72.3%(47/65),栉孔扇贝为84.6%(58/69),其余贝类检出率为100%;只有牡蛎样品检出H抗原,检出率为30.7%(28/91);在缢蛏和毛蚶样品中检测出B型抗原,检出率分别为76.9%(50/65)和77.8(56/72)。结果表明贝类中存在不止1种类型的HBGAs。

我国GII.4型诺如病毒Sydney株P颗粒的表达及其组织血型抗原结合特征

目的表达我国新发现GII.4型诺如病毒优势流行株—Sydney株的P颗粒,并探究其结合人类组织血型抗原(HBGAs)受体特征及变化规律。方法扩增SH 2012_05株中的P区域序列,构建进化树分析其氨基酸序列,并在原核表达系统中表达P颗粒。目的重组蛋白经Western blot确定其特异性,并采用ELISA法检测P颗粒结合HBGAs的能力及方式。结果 SH 2012_05毒株P区域与Sydney/2012原型株同源性为99.1%,为GII.4/Sydney基因簇。SDS-PAGE电泳和Western blot分析验证SH 2012_05株P颗粒具有特异性。其结合HBGAs受体方式与以往流行的基因簇一致,即与A、B、O、AB型分泌型唾液均能结合,其中与B型抗原亲和力最高。结论成功表达了我国新发现GII.4型诺如病毒Sydney株的P颗粒,明确了Sydney株能结合分泌型HBGAs受体的特征。本研究为诺如病毒疫苗株选择提供了技术储备,这将为GII.4型诺如病毒的预防和控制提供科学基础。

诺如病毒及其受体人类组织血型抗原的研究进展

人类诺如病毒(Noroviruses,NoV)归属于杯状病毒家族,是全球暴发性非细菌性胃肠炎的重要致病原。以往的研究提示宿主遗传因素可能与NoV易感性有关,近几年发现组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)可以作为NoV的结合受体被识别,该领域的研究不仅部分揭示不同个体对NoV易感性的差异,而且对于探索NoV感染的发病机制、流行病学规律和防治措施有重要意义。[临床儿科杂志,2007,25(12):1036-1039]

溶氧量及pH对太平洋牡蛎类A型组织血型抗原表达的影响研究

目的研究环境因素溶氧量及pH对太平洋牡蛎类A型组织血型抗原表达的影响。方法分离提取太平洋牡蛎中的类组织血型抗原,利用人体组织血型抗原抗体进行分型,采用ELISA方法对类A型组织血型抗原进行检测,计算P/N值,通过人工模拟改变牡蛎养殖条件海水溶氧量及pH,检测太平洋牡蛎内脏及鳃中类A型组织血型抗原的含量变化,分析溶氧量及pH对类A型组织血型抗原的影响。结果通过对牡蛎不同组织的类组织血型抗原进行分型,选定了牡蛎内脏及鰓中类A型组织血型抗原作为后续实验的主要研究型别,人工模型实验结果显示高溶氧量利于牡蛎内脏中类A型组织血型抗原的表达,高pH利于牡蛎鳃中类A型组织血型抗原的表达。结论实验结果与诺如病毒疫情暴发期为冬春季节的现象吻合,表明了诺如病毒疫情暴发的季节性与牡蛎类A型组织血型抗原的表达量存在一定的相关性。

组织血型抗原Le^(y)低表达的人巨核细胞系的建立和鉴定

目的应用CRISPR/cas9技术,建立血小板Le^(y)抗原差异化表达的人白血病巨核细胞系,为后续研究Le^(y)抗原在血小板活化中的作用奠定基础。方法选取人巨核细胞白血病细胞DAMI,用Western Blot及流式细胞法确定Le^(y)抗原的表达量;用实时定量PCR方法检测编码Le^(y)抗原合成相关的岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase,FUT)基因的表达,确定候选敲除基因,用CRISPR/Cas 9敲除候选FUT基因,使用流式细胞仪分选出Le^(y)抗原低表达的细胞群,培养细胞并鉴定Le^(y)抗原的表达量。用活细胞染色结合流式细胞法监测细胞增殖。结果DAMI细胞上具有大量的Le^(y)抗原表达;FUT1和FUT4在DAMI中有相对较高的mRNA表达,可能对Le^(y)抗原的表达起关键作用;敲除FUT1后的DAMI细胞系Le^(y)抗原的表达量与对照相比有显著降低,细胞增殖能力与野生型细胞相比没有显著改变。结论Le^(y)抗原的生物合成涉及多种FUT基因,对其中主要的FUT进行基因敲除无法彻底阻断Le^(y)抗原的合成,只能降低Le^(y)抗原的表达,本研究应用CRISPR/cas9技术敲除FUT基因建立的稳转人白血病巨核细胞系,为研究Le^(y)抗原对血小板功能的影响和意义奠定了基础。

人类组织血型抗原在小儿轮状病毒感染中的研究进展

轮状病毒(RV)是引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体之一,RV感染宿主细胞主要依赖于病毒识别细胞表面的特异性受体并与其发生结合,因此,受体是病毒感染细胞的重要因素。近年研究发现,组织血型抗原(HBGAs)可以作为RV的结合受体被病毒蛋白VP8识别。该领域的研究不仅部分揭示HBGAs在RV感染、进化中的重要作用,也提示了不同个体对RV易感性的差异,而且对于探索RV感染的发病机制、流行病学规律和防治措施具有重要意义。文章分析RV感染与HBGAs的相关性以进一步探讨最佳疫苗的研发。

组织血型抗原Lewis Y通过调控微管乙酰化水平促进细胞迁移

目的组织血型抗原Lewis Y(LeY)是血型抗原Lewis B的异构体,有报道其与细胞运动性及肿瘤转移高度相关。然而,尽管细胞骨架是细胞迁移的结构基础,LeY和细胞骨架之间的关系却不为人知。在本研究中,我们的目标是检查LeY对细胞运动性以及细胞骨架构建的作用,找出其中的效应分子。方法对乳腺癌细胞MCF-7和/或MDA-MB231进行以下处理:1)转染FUT1的过表达载体(pcDNA-FUT1),2)转染针对FUT1的特异性siRNA(siFUT1),3)用抗LeY-处理,通过Transwell试验和细胞划痕试验检测细胞迁移能力,对其中过表达FUT1的细胞用抗-乙酰化α-tubulin抗体进行Western Blot杂交或免疫荧光染色,观察微管乙酰化的变化。由于α-tubulin的乙酰化明确受到去乙酰化酶HDAC6的调控,使用HDAC6的特异性抑制剂Tubacin和广谱HDAC抑制剂TSA阻断HDAC6的作用后,再次检验FUT1过表达对细胞迁移的影响。结果 1)pcDNA-FUT1转染后细胞迁移能力增加,且Western Blot和免疫荧光染色结果都显示其α-tubulin的乙酰化水平降低,而siFUT1的转染及抗体阻断降低了细胞迁移能力;2)Tubacin或TSA处理后,乙酰化α-tubulin的形成受到强烈抑制,同时细胞迁移显著减少,而此时pcDNA-FUT1的转染对细胞迁移的影响相比处理前也有显著减少(P<0.01)。结论 LeY抗原对细胞迁移有显著正向影响,对微管蛋白α-tubulin的乙酰化的调控是机制之一,这一点为研究其他Lewis家族血型抗原提供了新的思路——对肿瘤患者进行输血治疗时,或许应该考虑到血型抗原作为肿瘤转移促进剂的意义,以降低输血潜在的风险。

人红细胞和组织血型抗原研究进展

国际输血学会将已确定的200余种红细胞血型抗原分为23个系统,5个关联和2个系列。Rh、MNS系统抗原代表大多数决定簇为多肽的血型抗原;ABH抗原代表决定簇为糖分子的血型抗原,根据其分布、发生和结构等特点,又称该类抗原为组织血型抗原。本文扼要综述近年来一些研究成果:Rh、MNS、ABH血型抗原及其基因结构;其抗原表位的变异及基因的调控。此外,对组织血型抗原之一的T/T。结构,表达以及其临床意义等也作一简单介绍。

人GⅡ.14诺如病毒VLP抗原性及组织血型抗原结合特征

本研究旨在制备人GⅡ.14诺如病毒的(Norovirus,NoV)病毒样颗粒(Virus⁃like particle,VLP),探索其抗原性与组织血型抗原结合的特征。利用杆状病毒系统表达人GⅡ.14 NoV VP1蛋白,通过超速离心和分子筛层析纯化VLP;将VLP免疫动物制备兔多抗血清,通过免疫印迹(Western blot,WB)、酶联免疫吸附(ELISA)进行抗原性评价及多抗功能验证;利用唾液结合实验检测人GⅡ.14 VLP的糖结合特征;通过蛋白序列及结构比较分析GⅡ.14 P蛋白潜在的糖结合位。纯化获得人GⅡ.14 VP1蛋白,电镜观察显示可以形成结构较为均一的VLP;制备的兔多抗能与GⅡ.14 VLP特异性结合,与检测的其他基因型VLP没有交叉反应;唾液结合实验表明GⅡ.14 VLP与人A/B/O/AB型别唾液都有较好的结合;序列和结构分析显示GⅡ.14 P蛋白模拟结构与GⅡ.9最为接近,具有与GⅡ.9以及流行株GⅡ.4等相似的潜在糖结合区。本研究表明GⅡ.14具有较为广泛的唾液结合特性,通过序列比对和结构学方法分析了GⅡ.14潜在的受体结合机制,为不同型别NoVs的流行监测提供了更多依据。

高表达H2型人类组织血型抗原HEK-293T细胞系的构建及其应用

目的通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶2(fucosyltransferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生相互作用的细胞系。方法构建FUT2慢病毒质粒,采用Lipofectamine 2000将FUT2慢病毒质粒及pMD.2G和psPAX2包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染对数生长期的HEK-293T细胞,嘌呤霉素加压筛选获得HEK-293T/FUT2细胞系。PCR鉴定FUT2基因是否整合到基因组中,RT-qPCR检测HEK-293T/FUT2细胞FUT2 mRNA转录水平,流式细胞术分析HEK-293T/FUT2细胞HBGAs的表达,间接免疫荧光法分析HEK-293T/FUT2细胞与诺如病毒病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结合活性。结果成功构建了序列正确的慢病毒质粒PLVX-IRES-Puro-FUT2,并获得了慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染HEK-293T细胞后,通过嘌呤霉素加压筛选获得了HEK-293T/FUT2细胞系,PCR验证显示,FUT2基因成功整合到HEK-293T细胞基因组中。HEK-293T/FUT2细胞FUT2 mRNA水平提高了330倍。99.9%的HEK-293T/FUT2细胞表达H2型人类组织血型抗原。GI.1重组诺如病毒VLP可以与HEK-293T/FUT2细胞产生很好的结合反应,EC50为2.007μg/mL。结论建立了H2型人类组织血型抗原稳定高表达的HEK-293T细胞系,并基于该细胞系初步建立了GI.1型重组诺如病毒VLP结合活性评价方法。

轮状病毒与人类组织血型抗原相关性的研究进展

轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的重要病原体,该病毒颗粒的VP4在病毒颗粒吸附和侵入宿主细胞过程中发挥着重要作用。最近研究发现VP4刺突蛋白远端的VP8*与人类组织血型抗原结合,是轮状病毒新的受体,并发表在Nature,Journal of Virology等杂志。本文对人类组织血型抗原与轮状病毒之间的研究进展进行简要概述,总结已有的研究结果,阐明组织血型抗原与轮状病毒研究的重要意义。

P[14]型轮状病毒VP8蛋白特异结合A型组织血型抗原

目的 研究轮状病毒与组织血型抗原之间的关系。方法以直接从人粪便标本中检测到的比较少见的G8P[14]型轮状病毒为研究对象，表达纯化得到P[14]VP8蛋白，通过寡糖结合和唾液结合实验，研究其与组织血型抗原的结合。结果P[14]VP8蛋白可以与A型寡糖和A型唾液特异结合，而没有检测到与其他型别的组织血型抗原结合。结论A型组织血型抗原可能是P[14]型轮状病毒的潜在受体，这为进一步研究其他型别轮状病毒受体结合特征及轮状病毒监测提供了一定的基础和依据。

溃疡性结肠炎患者中组织血型抗原基因多态性及单倍型研究

目的 探讨组织血型抗原基因[岩藻糖基转移酶（FUT）2和FUT3]多态性及单倍型与溃疡性结肠炎（UC）的相关性.方法 收集233例UC患者和292例对照者,采用单碱基末端延伸（SNaPshot）技术检测FUT2（C357T/ A385 T/G428 A）及FUT3（T59G/G508A/T1067A）6个基因位点的多态性,并进行单倍型分析.结果 在UC组和对照组中,FUT2和FUT3基因6个位点的等位基因和基因型频率分布差异均无统计学意义（P＞0.05）.但分层分析发现,广泛结肠型UC患者中FUT3 （T59G）的等位基因（G）和基因型（TG±GG）的频率低于远端结肠型UC患者[17.5％（35/200）比25.9％ （69/266）;31.0％ （31/100）比45.9％ （61/133）,P＜0.05].单倍型分析发现各单倍型频率分布差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 FUT2基因多态性与UC的易感性无明显相关;FUT3 （T59G）基因突变可能影响UC患者的病变部位.

南京腹泻患儿轮状病毒感染与受体组织血型抗原相关性研究

目的了解南京地区5岁以下腹泻患儿轮状病毒感染及流行基因型与受体人组织血型抗原易感性。方法收集295名急性腹泻儿童和150名健康儿童粪便和相应的唾液样本;应用抗原检测方法对粪便样本进行轮状病毒检测,利用RT-PCR方法对轮状病毒阳性样本基因分型;利用抗组织血型抗原单克隆抗体ELISA方法对唾液样本进行人组织血型抗原表型测定;对轮状病毒感染与组织血型抗原易感性进行统计分析。结果病例组295例标本中139例(47.12%)为轮状病毒阳性,其中G9[P8]型为最常见的轮状病毒基因型(84.17%,117/139)。轮状病毒感染患儿出现发热(χ^(2)=34.81,P<0.001)、呕吐(χ^(2)=25.01,P<0.001)和合并呼吸道症状比例(χ^(2)=4.73,P=0.03),均高于非轮状病毒感染组,差异有统计学意义。在ABO血型系统中,AB型儿童更易发生腹泻(95%CI:1.029~2.622;P=0.036),B型儿童感染轮状病毒的风险更高(OR=1.783,95%CI:1.027~3.095,P=0.039);在分泌型系统中,分泌型儿童更易发生腹泻和感染轮状病毒,G9[P8]基因型感染与分泌型表型有关(OR=2.854,95%CI:1.641~4.962),非分泌型儿童不易感染轮状病毒和G9[P8]基因型轮状病毒(χ^(2)=5.723,P=0.017)。结论南京地区5岁以下腹泻儿童轮状病毒感染以G9[P8]基因型为主,分泌型表型个体更易感染G9[P8],为预防和控制该地区轮状病毒腹泻提供科学依据。

重组轮状病毒疫苗VP8~*蛋白与组织血型抗原的结合性研究

目的评价轮状病毒(Rotaviruses,RVs)疫苗株Rotarix和RotaTeq VP8^*蛋白与组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)基因融合的免疫效果。方法从GenBank获取Rotarix和RotaTeq两种疫苗VP8^*蛋白基因序列,根据大肠埃希菌常用密码子进行序列优化后人工合成Rotarix和RotaTeqVP8^*蛋白基因并采用PCR扩增合成的两种基因,引物上、下游分别引入Nde I和Xho I限制性内切酶酶切位点。将PCR产物及载体pET-30a用Nde I和Xho I双酶切,经1.5%琼脂糖凝胶电泳回收目的片段后在T4连接酶作用下连接,连接产物转化至DH5α感受态细胞并进行PCR鉴定,取阳性菌液提取质粒,经Nde I和Xho I双酶切鉴定正确后测序。将合成的基因序列与表达载体pET-30a连接后导入大肠埃希菌BL21(DE3),加入IPTG诱导表达,经Ni2+beads亲和层析纯化得到VP8*-His融合蛋白,进行SDS-PAGE电泳分析。利用寡糖结合试验检测目的蛋白与lea、lex、leb、ley、A、B、H1、H2 8种寡糖的结合特性,利用唾液结合试验检测VP8*蛋白与不同血型组织抗原表型唾液的结合特征。结果成功构建重组质粒,SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量约为26×103,与预期的分子质量相符合。寡糖结合试验显示Rotarix和RotaTeq VP8^*蛋白能与H1型HBGAs结合,唾液结合试验显示二者能与分泌型唾液结合而不与非分泌型唾液结合。结论成功克隆表达了轮状病毒疫苗株Rotarix和RotaTeq VP8^*蛋白,两种蛋白均有与H1型HBGAs结合的特性。

GII.3型诺如病毒GZ31597株变异情况及与受体组织血型抗原结合模式分析

诺如病毒(Noroviruses,NoVs)是引起非菌型胃肠炎暴发流行的主要病原体之一。为了解我国GII.3型NoVs毒株的变异以及受体结合模式,本研究对来自2015年一起中国广州NoVs胃肠炎暴发的GII.3型毒株GZ31597株进行聚合酶区和完整VP1区基因扩增、序列测定和序列分析,并表达VP1突出区蛋白(P蛋白),通过P蛋白与不同血型唾液样本的酶免疫分析法(EIA)测定实验确定其组织血型抗原(Histo-blood group antigens,HBGAs)结合模式。GZ31597株聚合酶和VP1基因系统进化分析表明,GZ31597株为GII.P12/GII.3-SubD基因型(聚合酶/衣壳区),该毒株较先前的GII.3毒株相比,在既是抗原表位又是HBGAs受体结合位点的氨基酸385残基发生了氨基酸转换。根据Western Blotting结果,证实P蛋白成功表达。唾液结合分析结果显示,该毒株P蛋白与A、B、AB、O型分泌型以及O型非分泌型唾液均可以结合,但结合值相对低。本研究表明该GII.P12/GII.3-SubD亚型的GII.3毒株在长期的流行过程中,通过氨基酸的转换,改变抗原性和受体结合活性,使GII.3型毒株在人群中继续流行。通过探索GII.3型NoVs在人群中长期广泛流行的原因,为GII.3型诺如病毒性胃肠炎的预防和控制提供重要依据。

组织血型抗原:轮状病毒可能的潜在受体

轮状病毒(RVs)是引起婴幼儿及动物非细菌性胃肠炎的重要病原体.研究发现,人类组织血型抗原(HBGAs)可能是RVs的结合受体.HBGAs具有丰富的多态性,包含ABO、分泌型及Lewis抗原.研究表明,不同P型的RVs与HBGAs的结合具有型特异性,而且不同人群对各型RVs易感性存在差异.因此,研究RVs与HBGAs的相互作用对于阐明RV感染的致病机理及RV疫苗的设计具有重要意义.

GⅡ.2型诺如病毒P蛋白的表达及组织血型抗原结合模式分析

目的2016年冬季,GⅡ.2型诺如病毒(norovirus,NoV)在我国暴发流行,为了阐明其流行机制,本文对其衣壳蛋白P区与组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)结合特征进行研究。方法选取2016年底北京市暴发的GⅡ.2型ZTX株为研究对象,构建重组的原核表达质粒,表达纯化得到病毒P蛋白,通过唾液和寡糖结合实验对其与HBGAs的结合特征进行研究。结果成功获得可溶性P蛋白,P蛋白与A型,B型,AB型唾液均结合。结论明确了北京暴发的GⅡ.2型NoV的唾液的结合特征,为其致病机制及防控措施提供了一定的基础和依据。

GII.26型诺如病毒的组织血型抗原结合特征

诺如病毒(Noroviruses,NoVs)是引起全球急性胃肠炎的常见病原。组织血型抗原(Histo-blood groups antigens,HBGAs)是NoVs黏附因子(受体),能促进病毒感染宿主细胞。NoVs主要衣壳蛋白突出(Protruding,P)区是与HBGAs结合的关键结构域。本研究构建了非流行毒株GII.26型NoVs P区的原核表达重组质粒,以谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione s-transferase,GST)亲和层析纯化P蛋白,人鼻病毒的3C蛋白酶去掉GST标签,通过酶联免疫吸附实验探索P蛋白与HBGAs相互作用的特点,借助同源结构模拟以及结构重叠分析其与相应糖分子之间可能存在的对接位点。结果表明,P蛋白可与包括A型、B型、AB型、O型和非分泌型的215种唾液中的大部分发生结合,但只与19种寡糖中的H双糖结合;模拟的GII.26 P单体的空间构象与GII.17类似,可通过糖结合位点的5个氨基酸与H双糖特异性结合。本研究阐明了GII.26 P蛋白与HBGAs的结合特征及潜在分子机制,为进一步揭示GII.26 NoVs可能的流行趋势及研发潜在抗病毒药物奠定一定的基础。

GI.5和GII.4诺如病毒P蛋白的克隆表达及与长牡蛎类HBGAs的结合特性

为明确人诺如病毒(human norovirus,HuNoV)与长牡蛎类组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)的结合特性,本实验运用大肠杆菌表达系统,克隆表达了基因簇I.5(genogroup I.5,GI.5)和GII.4 HuNoV P蛋白,采用酶联免疫吸附测定研究HuNoV P蛋白与唾液HBGAs和长牡蛎类HBGAs的结合特性。结果表明,GII.4 HuNoV与唾液A型、B型、AB型和O型HBGAs均有较好的结合,而GI.5 HuNoV与B型HBGAs结合较弱,与O型HBGAs具有明显的结合优势。GI.5和GII.4 HuNoV在长牡蛎鳃、消化腺和外套膜中均可富集,其中在消化腺中富集最多,二者主要与类A型和H1型HBGAs结合,GII.4HuNoV与类Lea型、Leb型、Lex型和Ley型HBGAs有不同程度的结合,而GI.5 HuNoV与类Leb型HBGAs仅微弱结合,与类H1型HBGAs具有明显结合优势。综上,不同型别HuNoV与HBGAs的结合特性不尽相同,GII.4HuNoV具有广谱结合特性,GI.5HuNoV具有选择结合特性。