组蛋白变体H2A.Z的转录调控功能与动态作用机制

H2A.Z是组蛋白H2A常见的组蛋白变体。近年来,人们通过多学科手段探究了H2A.Z对于基因转录的激活或抑制作用。本文在概述组蛋白变体和H2A.Z发展史的基础上,重点阐述了H2A.Z不同亚型、不同翻译后修饰和基因组分布在转录调控过程中的作用,明确了其生物学意义和在肿瘤发生发展、神经系统分化发育过程中的病理生理学意义,并总结了H2A.Z在染色质沉积或者移除的动态调控机制方面的研究进展,以期为深入了解组蛋白变体的多样性,并为寻找相关疾病诊疗的新靶点提供参考。

盐离子作用下组蛋白变体H2A.Z增强核小体结构的稳定性

真核生物染色质的基本结构组成单元是核小体,基因组DNA被压缩在染色质中,核小体的存在通常会抑制转录、复制、修复和重组等发生在DNA模板上的生物学过程。组蛋白变体H2A.Z可以调控染色质结构进而影响基因的转录过程,但其详细的调控机制仍未研究清楚。为了比较含有组蛋白变体H2A.Z的核小体和常规核小体在盐离子作用下的稳定性差异,本文采用F rster共振能量转移的方法检测氯化钠、氯化钾、氯化锰、氯化钙、氯化镁等离子对核小体的解聚影响。实验对Widom 601 DNA序列进行双荧光Cy3和Cy5标记,通过荧光信号值的变化来反映核小体的解聚变化。F rster共振能量转移检测结果显示:在氯化钠、氯化钾、氯化锰、氯化钙和氯化镁作用下,含有组蛋白变体H2A.Z的核小体解聚速度相比于常规核小体要慢,且氯化钙、氯化锰和氯化镁的影响更明显。电泳分析结果表明,在75℃条件下含有组蛋白变体H2A.Z的核小体的解聚速率明显低于常规核小体。采用荧光热漂移检测(fluorescence thermal shift analysis,FTS)进一步分析含有组蛋白变体H2A.Z核小体的稳定性,发现两类核小体的荧光信号均呈现2个明显的增长期,含有组蛋白变体H2A.Z核小体的第1个荧光信号增速期所对应的温度明显高于常规核小体,表明核小体中H2A.Z/H2B二聚体的解聚变性温度要高于常规的H2A/H2B二聚体,含有组蛋白变体H2A.Z核小体的热稳定性高。研究结果均表明,含有组蛋白变体H2A.Z的核小体的结构比常规核小体的结构稳定。

组蛋白变体H3.3 L27M突变与胶质瘤发生

组蛋白变体在基因表达等基本细胞过程中发挥重要调节功能。人类有5种H3变体,分别为H3.1、H3.2、H3.3、着丝粒特异性CENP-A和睾丸特异性H3t。人H3.3由H3F3A和H3F3B两个基因编码。采用DNA全基因组测序法在儿童高级别胶质瘤如恶性胶质瘤(GBM)和弥漫性内在脑桥胶质瘤(DIPG)鉴定出高频的H3F3A突变。超过70%DIPG和30%GBM携带H3.3 K27M氨基酸错义突变(27位赖氨酸被甲硫氨酸代替)。H3.3 K27M通过与组蛋白H3K27甲基转移酶EZH2亚基相互作用而抑制多梳抑制复合物2(PRC2)活性并全面减少H3K27me3含量。因此,H3.3 K27M突变重塑了表观修饰状态和基因表达模式,从而驱动肿瘤发生。K27M突变可作为分子标志物以更好区分儿童胶质瘤亚型,还可作为特异、敏感的预后标志物。通过抑制组蛋白去甲基化酶如JMJD3活性而增加H3K27甲基化可作为K27M突变胶质瘤治疗的有效策略。本文综述了组蛋白变体H3.3 K27M在胶质瘤中的突变模式、分子机制和临床应用。

中华鳖组蛋白H2A变体克隆及其在卵母细胞中的表达分析

为研究组蛋白H2A对龟鳖动物生殖细胞发育分化作用和机制,克隆了中华鳖(Pelodiscus sinensis)组蛋白H2A变体的同源物(命名为PsH2A),分析其转录本的表达模式及在卵巢发育成熟过程中的细胞定位。PsH2A cDNA序列全长575 bp,5′端非编码区68 bp,3′端非编码区108 bp,开放阅读框399 bp,编码133个氨基酸。氨基酸序列比对结果显示其与龟类的H2A变体同源性更高,与哺乳类同源性较低。RT-qPCR和RT-PCR结果显示,PsH2A转录本在1冬龄、2冬龄和3冬龄的中华鳖卵巢中高表达(P<0.01),而在精巢和其他成体组织中几乎检测不到。化学原位杂交结果显示,PsH2A mRNA在卵母细胞中特异性表达,其中初级卵母细胞中表达信号最强,且均匀的分布在细胞质中。随着卵母细胞发育成熟进入到生长期和成熟期后,目的信号逐渐减弱,并且主要在核周区域表达。此外,PsH2A mRNA的相对表达量也表现出中华鳖卵巢发育的季节性变化。综上,研究结果表明PsH2A在中华鳖卵母细胞发育过程中可能发挥着重要作用。

基于ProteinGoggle 2.0的组蛋白H4蛋白质变体的自上而下表征（英文）

由于大量可能蛋白质变体以及每一个翻译后修饰大量可能位点的存在,核心组蛋白上密集的组合式翻译后修饰的自上而下表征一直是一个巨大的分析挑战。结合高分辨串级质谱,基于同位素质荷比和轮廓指纹比对的整体蛋白质数据库搜索引擎ProteinGoggle 2.0在组蛋白翻译后修饰的自上而下鉴定方面拥有诸多独特的优势。该文报道ProteinGoggle 2.0对HeLa核心组蛋白H4的数据库搜索及蛋白质变体的鉴定结果。基于从UniProt网站下载的人类核心组蛋白H4的纯文本文件和"鸟枪法"注释,ProteinGoggle 2.0首先创建包含所有可能蛋白质变体的理论数据库;从纯文本文件中提取的信息主要是氨基酸序列、可能的翻译后修饰(单甲基化、二甲基化、三甲基化、乙酰化和磷酸化)及氨基酸变异(A77→P)。在控制质谱水平假阳性率低于1%的前提下,共鉴定到426个蛋白质变体,这是目前为止H4蛋白质变体的最全报道。这些ProteinGoggle 2.0鉴定到的H4蛋白质变体也与之前报道的ProSightPC 2.0的鉴定结果进行了肩并肩比较。总而言之,ProteinGoggle 2.0可以对具有复杂组合修饰及氨基酸变异的蛋白质组进行数据库搜索和蛋白质变体鉴定。

组蛋白变体macroH2A1调控肿瘤增殖的研究进展

组蛋白变体不仅为染色质提供独特的功能,而且通过特殊的沉积和清除机制参与基因表达调控。macroH2A1是主要的组蛋白变体之一,早期发现其与女性X染色体失活和转录抑制有关,但目前研究发现其在特定的条件下可通过调控细胞衰老和代谢抑制肿瘤增殖。该文基于目前研究进展阐述macroH2A1调控基因表达的分子机制及其在肿瘤进展中的作用。

植物染色质组蛋白H3变体的研究进展

组蛋白H3是构成染色质的重要成分之一。高等真核生物中,组蛋白H3的氨基酸序列较为保守,在染色质动态变化中,有着非常重要的作用。除共价修饰外,如组蛋白H3甲基化、乙酰化,近期研究表明,动物组蛋白H3变体(H3 variants)也是一种重要的染色质功能调节手段,但对植物中组蛋白H3的报道较少。根据近年最新研究成果,对植物组蛋白H3变体种类及其相关功能进行了总结和讨论。

组蛋白H3变体H3.3及其在细胞重编程中的作用

组蛋白是真核生物中一类进化上相对保守的蛋白质。由组蛋白八聚体及缠绕其上的DNA构成的核小体是真核生物染色质的基本组成单位。核小体使DNA保持固缩状态,既能维持基因组的稳定性,又能保证DNA序列可以正确地进行复制、转录、重组和修复。核小体调控细胞的生物过程除了通过组蛋白翻译后修饰,还可以通过组蛋白变体替换的方式进行。研究发现,组蛋白H3变体H3.3与常规组蛋白H3尽管仅有几个氨基酸的区别,但H3.3却能由特异的分子伴侣介导,整合进入染色质的特定区域,从而发挥不同的作用。同时,H3.3作为一种母源因子在正常受精和体细胞核移植等细胞重编程过程中也发挥着重要作用。本文总结了H3.3的结构特点和富集情况,探讨了特异的分子伴侣及其在细胞重编程中的作用,以期为提高体细胞重编程效率提供新思路,为体细胞重编程的应用奠定基础。

H2A变体在小鼠不同时期雄性生殖细胞核质区的分布

【目的】了解小鼠雄性生殖细胞中macro H2A、H2A.Z和H2A.X 3种组蛋白变体变化与其发育特征间的联系,为揭示原始生殖细胞(PGCs)的发育机理及其分子调控机制奠定基础。【方法】以C57BL/6J小鼠胚胎的中肾和生殖嵴为试验材料,通过免疫荧光染色技术检测11.5dpc、12.5dpc和13.5dpc不同发育时期含有PGCs的组织石蜡切片及单细胞中macro H2A、H2A.X和H2A.Z变体的分布情况。【结果】macro H2A变体在11.5dpc胚胎时主要存在于细胞质中,12.5dpc时在细胞质中的表达增强,但进入生殖嵴后(13.5dpc)表达消失;H2A.X变体在11.5dpc和12.5dpc时存在于PGCs的核质区,13.5dpc时主要存于细胞质,且呈聚集分布;H2A.Z变体在11.5dpc时在PGCs的核质区均有存在,12.5dpc和13.5dpc时主要分布在细胞核,且表达明显增强。【结论】随着PGCs的不断迁移、增殖与分化,macro H2A、H2A.X和H2A.Z 3种组蛋白H2A变体在细胞核质区的分布及表达情况也发生变化,即H2A变体分布特征与PGCs的性别分化及其有丝分裂停止相关。

组蛋白H3.3 G34R/V突变在神经胶质瘤中的研究进展

人组蛋白H3.3变体包含H3F3A和H3F3B两个编码基因,其中H3F3A突变的高级别胶质瘤中G34R/V突变率低于K27M,与后者在形态学上相对一致相比,H3.3 G34突变的肿瘤组织学具有明显异质性,镜下表现可以是经典的胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM),也可以是中枢神经系统原始神经外胚层肿瘤(central nervous system primitive neuroectodermal tumours,CNS-PNET),甚至星形母细胞瘤。H3.3 G34突变肿瘤在发病年龄、病变累及范围以及预后治疗上有其独特的表现。基因组和表观基因组学研究显示H3.3 G34突变的CNS肿瘤表现为一致的表观遗传学特征,提示其具有同一生物学起源。与其他GBM亚型细胞遗传学相比分析,G34突变的肿瘤3q和4q缺失的频率和特异性均较高,并常伴有PDGFRA或CCND2扩增。本文对组蛋白H3.3 G34R/V突变神经胶质瘤的临床病理特征及分子遗传学特点进行综述。

H2A变体在卵原细胞及其前体细胞核质区的分布

小鼠卵原细胞发育之前经历细胞的迁移、大量繁殖和性别分化,为了进一步了解分子调控机制,通过组织石蜡切片免疫荧光染色和单细胞免疫荧光染色技术,对配种时间为11.5d、12.5d和13.5d卵原细胞及其前体细胞,组蛋白H2A变体MacroH2A、H2A.Z、H2A.X的分布情况进行研究。结果表明,配种时间为12.5d细胞中3种组蛋白H2A变体荧光强度减弱,macroH2A在配种时间为11.5d、12.5d细胞质表达,有少量的沉积,13.5d细胞质中macroH2A沉积明显增多。H2A.X在配种时间为11.5d、12.5d细胞核和细胞质中弥散分布,13.5d主要集中于细胞核。H2A.Z在配种时间为11.5d整个细胞核和细胞质都有表达,12.5dH2A.Z在细胞质内表达减弱,细胞核出现部分沉积,13.5d细胞中H2A.Z主要集中分布于细胞质。组蛋白H2A变体的分布特征,可能与细胞的性别分化及细胞的减数分裂相关。

3种H2A变体在卵原及前体细胞中的分布研究

通过组织石蜡切片和单细胞免疫荧光染色及定量PCR技术,对卵原及前体细胞中组蛋白H2A变体macroH2A、H2A.Z、H2A.X的分布情况进行了研究。结果表明:12.5 dpc细胞中3种组蛋白H2A变体荧光强度减弱,macroH2A在11.5 dpc、12.5 dpc的细胞质中表达,有少量沉积,13.5 dpc细胞质中macroH2A沉积明显增多。H2A.X在11.5 dpc、12.5 dpc细胞核质中弥散分布,13.5 dpc时主要集中于细胞核表达。H2A.Z在11.5 dpc细胞核质区都有表达,在12.5 dpc细胞质内表达减弱的同时细胞核中表达增强,13.5 dpc时主要集中在细胞质中表达。不同时期组蛋白H2A 3种变异体定量PCR结果与免疫荧光技术分析结果一致。由此推断,组蛋白H2A变体的分布可能与细胞的性别分化及减数分裂相关。

进入生殖嵴前PGCs中H2A变体的分布

小鼠原始生殖细胞进入生殖嵴之前经历细胞迁移、大量繁殖。为进一步解分子调控机制，文章通过组织石蜡切片免疫荧光染色和单细胞免疫荧光染色技术，对8.5、10.5 dpcPGCs中组蛋白H2A变体MacroH2A、H2A.Z、H2A. X的分布情况进行研究。结果表明，8.5-10.5 dpc，H2A.Z在PGCs中的表达明显递增，10.5 dpc PGCs中H2A.Z的表达主要集中于细胞核；而MacroH2A和H2A.X在此过程中无明显变化，在细胞质和细胞核中弱表达。综合分析发现，8.5-10.5 dpc PGCs中H2A.Z可能是装配核小体的主要变体，PGCs大量繁殖可能有H2A.Z的参与。

H2A-H2B类型组蛋白及其伴侣蛋白的研究进展

染色质是真核细胞中遗传物质DNA的载体,染色质结构动态变化与DNA复制、转录、重组、修复等重要生物学事件密切相关.组蛋白是染色质结构的基本组成元件之一,组蛋白变体和组蛋白修饰是两类基本的染色质结构调控因子.在构成核小体的四种核心组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)当中,H2A拥有最多的变体类型并在染色质结构调控中发挥重要作用.H2A组蛋白伴侣对H2A组蛋白及其变体的特异识别对于后者的折叠、修饰、传递、转运、组装、移除等生物学功能至关重要.本文着重探讨了组蛋白伴侣特异识别H2A组蛋白的分子机理,二者调控染色质结构的作用机制以及相应的生物学意义.

组蛋白macroH2A在G_1/S和M期的分布差异

组蛋白macro H2A(m H2A)具有独特的结构和丰富的亚型,不但具有转录活化和抑制功能,还作用于细胞增殖和肿瘤发生等过程。采用同步化培养的NIH/3T3细胞,分别提取G1/S和M期的组蛋白H2A及m H2A,通过免疫荧光和Western blot从定性和定量2方面分析m H2A的分布情况。结果显示,在总含量保持不变的情况下,m H2A在G1/S和M期的分布有显著差异,从G1/S期进入M期,m H2A在染色体上的分布出现约30%的增长。结果表明,m H2A在细胞周期内的分布有显著差异,很可能与转录激活有关。

基于DNA弯曲度的H2A.Z核小体定位与修饰研究

在真核生物染色质中,H2A.Z是高度保守的组蛋白变异体,与转录调控、基因组的稳定性密切相关。为了探讨组蛋白修饰、DNA弯曲度与H2A.Z核小体定位三者之间的关联,在得到实验所测的相关数据后,利用MINE算法并结合皮尔逊相关系数在酵母全基因组的转录起始位点周围探讨了三者间的线性与非线性关系。其中MIC算法可以定量的得出数据之间关联度大小的值,用于衡量数据之间是否存在着关联,而皮尔逊相关系数则用于检查是否为线性关联。结果除了发现大部分组蛋白修饰种类和核小体定位之间存在着线性关联外,还探测到有两种组蛋白修饰数据(H4ac修饰与GCN4修饰)和核小体定位数据之间存在着以往未发现的非线性关系(大致呈正余弦函数),并从数据的生物背景(组蛋白修饰与核小体位置)上探讨了出现非线性现象的原因。

组蛋白伴侣VPS72驱动H2AFZ的表达并协同促进肝癌进展

目的:探讨组蛋白伴侣VPS72和H2AFZ在肝细胞癌(肝癌)的表达调控和促进肝癌发展的机制。方法:利用Lenti-shNC和Lenti-shVPS72-1、Lenti-shVPS72-2慢病毒感染相对高表达VPS72的肝癌细胞系SNU398、Hep3B、SNU449,构建VPS72稳定敲低肝癌细胞系,并使用qRT-PCR和Western blot在转录水平和蛋白水平验证敲低效率。采用CCK-8实验、平板克隆实验、划痕实验、Transwell迁移实验检测各种处理下肝癌细胞的增殖迁移能力,并通过回复实验验证VPS72与H2AFZ的调控关系。使用qRT-PCR、Western blot在转录水平和蛋白水平检测不同分组肝癌细胞VPS72、H2AFZ的表达情况。多组间实验数据比较采用方差分析。结果:Lenti-shNC和Lenti-shVPS72-1、Lenti-shVPS72-2慢病毒感染相对高表达VPS72的肝癌细胞系SNU398、Hep3B、SNU449,成功构建了VPS72稳定敲低肝癌细胞系。Lenti-shVPS72-1、Lenti-shVPS72-2相较于对照组Lenti-shNC均成功干扰了VPS72的表达,并且敲低VPS72明显抑制了H2AFZ的表达,这一结果在3种细胞系中均得到验证。在SNU398细胞中,相较于对照组Lenti-shNC,Lenti-shVPS72-2组的H2A.Z红色荧光减弱,并证明H2A.Z的亚细胞定位在细胞核。细胞增殖实验和克隆形成实验证明,敲低VPS72明显抑制Hep3B、SNU449细胞的增殖能力。细胞划痕实验和Transwell迁移实验证明,与对照组Lenti-shNC相比,Hep3B、SNU449细胞的Lenti-shVPS72-1、Lenti-shVPS72-2组的迁移能力被明显抑制。H2AFZ过表达回复实验显示Hep3B、SNU449被抑制的增殖、迁移表型并未完全缓解,提示VPS72与H2AFZ之间存在潜在协同作用。结论:组蛋白伴侣VPS72可驱动肝癌组蛋白变体H2AZ1的表达,并可能与H2AFZ协同促进肝癌进展,VPS72可作为肝癌表观遗传治疗靶点。

小檗碱靶向HDAC/H3K9ac/KLF4抑制棕榈酸诱导的HepG2脂肪变性体外实验研究

目的探讨小檗碱(BBR)调控HDAC/H3K9ac/KLF4对棕榈酸(PA)诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)细胞模型的保护作用及其可能的机制。方法应用PA诱导HepG2细胞构建NAFLD细胞模型,采用油红O染色法测定细胞脂肪变,采用Western blot法检测细胞HDAC1、H3K9ac、KLF4、SREBP-1c和PPARγ表达,使用染色质免疫沉淀技术(ChIP)测定KLF4启动子区H3K9ac水平,采用ELISA检测细胞培养上清细胞因子,采用SiRNA技术沉默KLF4基因验证BBR靶向HDAC/H3K9ac/KLF4对PA诱导的HepG2细胞脂肪变的保护作用。结果与模型组比,BBR处理使PA诱导的HepG2细胞脂质沉积显著改善,培养上清TNF-α、IL-1β和IL-6水平分别为(514.7±46.4)pg/ml、(241.5±37.7)pg/ml和(362.7±19.9)pg/ml,均显著低于模型组【分别为(1162.0±110.8)pg/ml、(635.8±73.4)pg/ml和(1110.0±85.1)pg/ml,P<0.001】;与模型组比,BBR干预组HDAC1蛋白表达降低了19.0%,而H3K9ac和KLF4蛋白表达增加了1.53倍和1.52倍,KLF4启动子区H3K9ac水平增加了3.97倍,脂质合成相关基因SREBP-1c蛋白表达降低了49.1%,脂质分解相关基因PPARγ蛋白表达增加了1.84倍;与空质粒转染组比,转染真核表达质粒细胞HDAC1蛋白表达水平增加了2.02倍,而H3K9ac蛋白表达水平降低了57.1%;与SiRNA-NC转染组比,转染SiRNA-KLF4的HepG2细胞KLF4蛋白表达水平显著下降(P<0.01),而细胞脂质沉积显著增加,培养上清TNF-α、IL-1β和IL-6水平分别为(887.9±89.9)pg/ml、(471.9±38.4)pg/ml和(793.1±59.3)pg/ml,均显著高于SiRNA-NC转染组【分别为(534.2±46.1)pg/ml、(260.3±26.9)pg/ml和(372.0±30.6)pg/ml,P<0.01】,脂质合成相关基因SREBP-1c蛋白表达增加了1.77倍,而脂质分解相关基因PPARγ蛋白表达降低了41.6%。结论本研究结果提示BBR可能通过调节PA诱导的HepG2细胞HDAC/H3K9AC表达,激活了KLF4,抑制了细胞内炎症反应和脂质沉积,为临床干预NAFLD提供了新的思路。

植物组蛋白H3的研究进展

组蛋白H3是构成染色质的重要成分之一。高等植物中,组蛋白H3的氨基酸序列非常保守。越来越多的研究证明组蛋白H3在维持染色质结构的稳定性及细胞分裂的正常进行、调控植物生长发育、适应不断变化的环境等方面具有重要的作用。笔者根据近些年的研究进展,对组蛋白H3变体的分类、结构和功能、表观遗传修饰以及CENH3介导的单倍体诱导技术等方面进行了综述,并对未来的研究方向进行了展望。

H2B-RFP融合蛋白在观测肿瘤活细胞有丝分裂中的应用

目的:肿瘤细胞染色体分裂异常是导致肿瘤基因组不稳定的根本原因,这种不稳定性促进了肿瘤的进展和恶化。本文旨在探讨H2B-RFP融合蛋白能够更好地观测肿瘤活细胞有丝分裂过程。方法:将携带H2B-RFP融合基因的质粒瞬时转染人宫颈癌细胞系Hela并利用抗性药物筛选得到阳性细胞克隆,利用激光共聚焦显微镜活细胞培养系统记录稳定筛选Hela细胞的细胞周期。结果:得到稳定表达H2B-RFP的Hela细胞且其与亲本Hela细胞相比对细胞周期的运行没有影响,并且可以展示Hela细胞有丝分裂的进程。结论:H2B-RFP融合蛋白可以非常敏感地显示肿瘤细胞的染色体并跟踪活体状态下肿瘤细胞有丝分裂过程。