马氏珠母贝组蛋白H2分子进化及功能分析

分析马氏珠母贝组蛋白H2的分子进化特征,及其在马氏珠母植核免疫调控中的作用,为进一步阐述组蛋白H2在马氏珠母贝中的生理功能提供理论基础。应用生物信息学分析方法对马氏珠母贝(Pinctada fucata martensi)、人(Homo sapiens)、长牡蛎(Crassostrea gigas)等9个物种中的组蛋白H2A和H2B进行全基因组鉴定,并分析了它们的分子进化历程;利用课题组已有数据,分析组蛋白H2A和H2B在马氏珠母贝发育、组织和植核免疫中的功能。通过比较基因组分析发现,人的基因组中含有27个组蛋白H2A、20个组蛋白H2B,长牡蛎基因组中含有12个组蛋白H2A、8个组蛋白H2B,马氏珠母贝基因组中仅含有2个H2A(H2A-1和H2A-2)、1个H2B,与其他物种相比呈现收缩现象。序列比对分析发现,人的基因组中有6个H2A变体和2个H2B变体,牡蛎有3个H2A变体和1个H2B变体,马氏珠母贝中有1个H2A变异体(H2A-2)。在马氏珠母贝中,植核后H2A-1和H2B的表达发生了不同程度的变化,说明它们参与植核免疫调控;基因H2A-1在原肠胚期表达量较高,H2A-2在担轮幼虫和D型幼虫中的表达量较高,H2B发育前期表达量较高。H2A-1在珍珠囊中表达量较高,H2A-2在血细胞、足和外套膜套膜区表达量相对较高,H2B在性腺和珍珠囊中表达量较高。马氏珠母贝基因组中仅含有2个组蛋白H2基因,它们参与调控植核免疫且在免疫调控过程中发挥的作用不同。

组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1缺陷小鼠造血干细胞增殖加快且凋亡增加

目的研究组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1缺陷(MYSM1-/-)小鼠骨髓造血干细胞(HSC)的静息状态、增殖与凋亡情况。方法分离MYSM1-/-小鼠和野生对照(MYSM1+/+)小鼠的骨髓细胞,利用免疫磁珠和流式细胞仪分选获得表面标志为lin-Sca-1+c-kit+的HSC。采用腹腔注射溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)的方法检测HSC增殖与细胞周期、采用Hoechst 33342-派若宁(pyronin)Y双染色法检测静息态HSC的比例、采用异硫氰酸荧光素标记膜联素Ⅴ/7-氨基放线菌素D(annexinⅤ-FITC/7-AAD)双染色法检测HSC凋亡。比较MYSM1-/-小鼠和MYSM1+/+对照小鼠HSC数目、细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡的变化情况。结果 MYSM1-/-小鼠的骨髓细胞、HSC总数与野生型小鼠相比明显降低;HSC的S期比例增加、增殖加快、静息期细胞减少但功能有缺陷的MYSM1-/-HSC凋亡率显著上升。结论 MYSM1对维持HSC的静息状态有非常重要的作用,其缺陷可引起静息态的HSC大量进入S期,异常增殖的HSC凋亡增加并最终引起HSC和骨髓细胞总数减少。

组蛋白H2B单泛素化在原发性结肠腺癌中的表达及意义

目的探讨组蛋白H2B单泛素化(histone H2B monoubiquitination,u H2B)在原发性结肠腺癌中的表达及其与临床病理参数的关系。方法采用免疫组化ABC法检测116例原发性结肠腺癌及15例正常结肠黏膜组织中u H2B的表达,并复习相关文献。结果 u H2B在低分化原发性结肠腺癌中的阳性率(19.4%,6/31)显著低于高+中分化腺癌(49.4%,42/85)及正常结肠黏膜组织(86.7%,13/15),差异有统计学意义(P<0.05)。u H2B与肿瘤分化程度、Dukes分期、TNM分期及淋巴结转移相关(P<0.05),与患者性别、年龄无关(P>0.05)。结论 u H2B作为一种抑癌因子可能与原发性结肠腺癌的恶化过程密切相关。其可能会成为原发性结肠腺癌早期检测、治疗及预后评估的新分子生物学标志并应用于临床,而其在结肠腺癌中的具体作用机制仍有待进一步研究。

组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1抑制骨髓来源树突状细胞的抗原提呈功能及炎性细胞因子的分泌

目的研究组蛋白H2A去泛素化酶Myb样SWIRM和MPN结构域1(MYSM1)对骨髓来源树突状细胞(BMDC)吞噬、抗原提呈、炎性细胞因子mRNA水平的影响。方法分离小鼠的骨髓细胞,在体外联合粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)诱导骨髓细胞分化为DC,利用小干涉RNA(siRNA)下调MYSM1的表达,采用免疫荧光微球实验检测BMDC的吞噬功能、流式细胞术检测BMDC的抗原提呈功能、实时定量PCR检测BMDC的IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达变化,探讨MYSM1下调后DC在固有免疫应答中的作用。结果下调MYSM1的表达后,BMDC的吞噬功能无显著变化,抗原提呈功能增强,IL-6、TNF-α的表达增强。结论 MYSM1在固有免疫应答中可以抑制BMDC的抗原提呈功能及炎性细胞因子分泌能力。

利用重组荧光素酶报告基因载体研究E2F调控组蛋白H2A的转录

转录因子E2F与细胞增殖、凋亡及癌变密切相关,组蛋白H2A是构成核小体的重要成员之一。研究通过特异性的阻断Rb基因的表达发现组蛋白H2A家族成员:HIST1H2AJ表达下调,再进一步研究转录因子E2F对HIST1H2AJ的转录调控。通过PCR得到HIST1H2AJ的5'非翻译区序列,克隆到荧光素酶报告载体pGL3中,然后转染入HEK293,再检测荧光素酶的活性来判断E2F是否调控HIST1H2AJ的转录。研究结果表明:转录因子E2F能够调控组蛋白H2A家族成员之一HIST1H2AJ的转录。

中华鳖组蛋白H2A变体克隆及其在卵母细胞中的表达分析

为研究组蛋白H2A对龟鳖动物生殖细胞发育分化作用和机制,克隆了中华鳖(Pelodiscus sinensis)组蛋白H2A变体的同源物(命名为PsH2A),分析其转录本的表达模式及在卵巢发育成熟过程中的细胞定位。PsH2A cDNA序列全长575 bp,5′端非编码区68 bp,3′端非编码区108 bp,开放阅读框399 bp,编码133个氨基酸。氨基酸序列比对结果显示其与龟类的H2A变体同源性更高,与哺乳类同源性较低。RT-qPCR和RT-PCR结果显示,PsH2A转录本在1冬龄、2冬龄和3冬龄的中华鳖卵巢中高表达(P<0.01),而在精巢和其他成体组织中几乎检测不到。化学原位杂交结果显示,PsH2A mRNA在卵母细胞中特异性表达,其中初级卵母细胞中表达信号最强,且均匀的分布在细胞质中。随着卵母细胞发育成熟进入到生长期和成熟期后,目的信号逐渐减弱,并且主要在核周区域表达。此外,PsH2A mRNA的相对表达量也表现出中华鳖卵巢发育的季节性变化。综上,研究结果表明PsH2A在中华鳖卵母细胞发育过程中可能发挥着重要作用。

磷酸化组蛋白H2AX介导的DNA损伤精子受精卵内修复

成熟精子易受外界影响产生DNA损伤,却缺乏DNA损伤修复系统。由于DNA损伤精子仍具有受精能力和发育潜力,其损伤修复可能发生在受精后。遗憾的是,DNA损伤精子受精后的修复机制尚不清楚。研究发现磷酸化组蛋白H2AX(histone H2AX phosphorylation,γH2AX)参与了DNA损伤精子受精后的修复。本综述主要探讨DNA损伤精子受精后受精卵内经由γH2AX介导修复的可能机制。

组蛋白H2AX的磷酸化及其在肿瘤中的应用

组蛋白H2AX磷酸化与DNA损伤及修复密切相关,并在细胞周期检测点调控、基因组稳定的维持和肿瘤抑制中起着重要作用。文章对组蛋白H2AX磷酸化在检测肿瘤致癌物、探讨肿瘤发生机制及指导肿瘤放化疗等方面作一综述。

组蛋白H2B泛素化修饰研究进展

组蛋白翻译后修饰包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化和糖基化等。其中,组蛋白泛素化可能与基因的转录调控、异染色质的基因沉默、DNA修复等有关。笔者介绍了组蛋白H2B的泛素化机制及其意义。

C2株蓝氏贾第鞭毛虫组蛋白H2B基因的克隆与同源性分析

目的获取C2株蓝氏贾第鞭毛虫H2B组蛋白基因序列,与WB株蓝氏贾第鞭毛虫及其他物种进行同源分析。方法 PCR扩增获取H2B组蛋白基因,连接pGM-T载体,转化E.coli DH5α感受态宿主细胞,挑选阳性克隆并进行序列分析,与美国WB株蓝氏贾第鞭毛虫及模式生物H2B组蛋白基因和蛋白序列进行同源分析。结果测序C2株蓝氏贾第鞭毛虫H2B组蛋白基因序列,同源比对结果显示其基因序列与美国WB株完全一致,进化树分析表明贾第虫H2B组蛋白基因在进化过程中与其他物种分化较早。结论蓝氏贾第鞭毛虫H2B组蛋白基因同源分析结果显示贾第虫与其他现存真核生物亲缘关系较为疏远,为进一步研究蓝氏贾第鞭毛虫的生物进化地位提供有价值的资料。

组蛋白H2BK在胶质瘤中的表达及其临床意义

目的探讨胶质瘤组织中组蛋白H2BK(HIST1H2BK)表达与临床特征和预后的关系。方法选取北海市第二人民医院和广西医科大学附属肿瘤医院86例接受手术治疗的胶质瘤病例资料,免疫组织化学分析不同病理级别胶质瘤H2BK的表达,评估H2BK表达与临床病理的关系。生存分析研究H2BK对胶质瘤预后的影响。结果高级别胶质瘤组织中H2BK的表达率(82.22%)明显高于低级别胶质瘤(14.63%)。术后随访1~60个月,死亡71例。多因素Cox回归分析显示,H2BK高表达[风险比(HR)=0.393,95%可信区间(CI):0.224~0.688,P<0.01]是胶质瘤病人总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)不良的独立危险因素(P<0.05)。生存曲线分析显示,H2BK高表达胶质瘤病人中位OS、PFS较低表达病人明显缩短(χ^(2)=15.092,P<0.05)。结论高级别胶质瘤中H2BK高表达与胶质瘤患者不良生存预后呈负相关。

组蛋白H2B单泛素化参与植物生长发育和逆境响应的研究进展

组蛋白H2B单泛素化(histone H2B monoubiquitination,H2Bub1)是组蛋白的一种重要的修饰形式,主要通过调节靶基因的转录来参与调控植物的生长发育过程以及逆境胁迫响应。本文综述H2Bub1的修饰过程,其在调控植物的种子休眠、叶和根的生长、生物钟、开花时间和花药发育中的作用以及在植物抵抗病原菌的防卫反应和盐胁迫、干旱胁迫的逆境响应中的功能,并对H2Bub1的功能研究进行了讨论和展望。

蓝氏贾第鞭毛虫中国株组蛋白H2A基因的克隆与重组表达

目的获取蓝氏贾第鞭毛虫中国株GlH2A基因及重组蛋白。方法 PCR扩增获取GlH2A基因,连接至pMD-19T并进行测序分析。连接至pET28a构建表达载体,并转化宿主菌E.coli BL21(DE3),然后进行异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达。表达产物进行亲和层析纯化,再用Western blotting进行免疫学鉴定。结果序列测定获得蓝氏贾第鞭毛虫中国株GlH2A基因的编码序列,与美国WB株H2A(GL50803_14256,Accession:NW_001844132)序列完全一致。该基因编码124个氨基酸,预测分子量13900Mr,保留了与核小体形成相关的重要氨基酸位点,在大肠埃希菌中获得表达,纯化后纯度达90%以上。Western blotting检测表明重组蛋白能够被抗His6标签抗体识别。结论克隆得到GlH2A基因编码序列;得到了重组GlH2A蛋白,并进行了纯化,为进一步研究组蛋白及其修饰酶在基因转录调控中的作用奠定了基础。

苯并(a)芘致人支气管上皮细胞DNA损伤及与组蛋白H2A单泛素化水平的关系

[目的]通过体外细胞培养途径,探讨苯并(a)芘(benzo[a]pyrene,B[a]P)作用下人支气管上皮细胞(16HBE)DNA损伤与组蛋白H2A单泛素化表达水平的关系。[方法]取对数生长期16HBE细胞,采用2μmol/L B[a]P染毒不同时间(0、1、2、4、8、12、24、48h)进行实验,用碱性单细胞凝胶电泳实验检测细胞DNA损伤水平,并以Olive尾矩值(olivetail moments,OTM)评价DNA损伤程度;用Western-blot法检测组蛋白H2A单泛素化水平。[结果]单细胞凝胶电泳结果显示:2μmol/L B[a]P染毒不同时间时,随着染毒时间的延长,各染毒组细胞DNA损伤程度均明显增高,与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01);Western-blot结果显示:2μmol/L B[a]P染毒不同时间时,与对照组相比,组蛋白H2A的单泛素化水平增高,且在染毒2h后,差异有统计学意义(P<0.01);回归分析显示,单泛素化H2A的表达水平与DNA损伤程度存在高度相关,决定系数(R2)为0.910,P<0.01。[结论]B[a]P染毒致16HBE细胞DNA损伤与组蛋白H2A单泛素化水平之间存在密切关系。

褐飞虱组蛋白H3与H2A基因启动子克隆与序列分析

褐飞虱是对水稻危害最严重的害虫之一,目前缺少对褐飞虱内源高效启动子的研究。以褐飞虱的组蛋白H3与H2A基因为研究对象,通过已知的果蝇H3与H2A序列搜寻Genbank上褐飞虱表达序列标签(expressed sequence tags,简称EST)数据库,从而获得同源序列来设计嵌套引物。然后通过染色体步移的交错式热不对称PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,简称Tail-PCR)技术获得H3与H2A ATG前侧翼序列,分别为1 664、538 bp。PLACE软件在线分析TATA框、CAAT框、GATA框。为外源基因在褐飞虱细胞内高效表达以及褐飞虱转基因相关研究奠定基础。

^(56)Fe^(17+)重离子束对人淋巴细胞磷酸化组蛋白H2AX表达影响研究

目的探讨^(56)Fe^(17+)重离子束对人淋巴细胞磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)表达的影响。方法取非洲淋巴细胞瘤病毒转化正常人B淋巴细胞(Peng-EBV细胞),分别予照射剂量为0.0(对照组)、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0Gy的^(56)Fe^(17+)重离子照射,照射剂量率为0.23~0.55 Gy/min,分别于照射后0、2、4、8、48及72 h采用流式细胞术检测细胞γH2AX的表达量。结果γH2AX表达水平在56Fe12+重离子照射剂量与照射后处理时间之间存在交互效应(P<0.01)。照射后2~72 h,γH2AX的表达水平在照射剂量为0.3~2.0 Gy时均高于同时间点对照组(P<0.05)。在0.3~2.0 Gy范围内,γH2AX的表达水平在照射后8~72 h均低于同组照射后2和4 h时间点的表达水平(P<0.05)。当照射剂量为0.5、1.0或2.0 Gy时,γH2AX的表达水平照射后72 h内呈随着照射后时间的延长而下降的趋势(P<0.05)。在照射后2~4 h,当照射剂量为0.0~1.0 Gy时,γH2AX表达水平随照射剂量增加而增加(P<0.01)。结论在照射剂量为0.0~1.0时,^(56)Fe^(17+)重离子诱导的Peng-EBV细胞γH2AX表达水平于照射后2~4 h内存在剂量-响应关系。

H2B-RFP融合蛋白在观测肿瘤活细胞有丝分裂中的应用

目的:肿瘤细胞染色体分裂异常是导致肿瘤基因组不稳定的根本原因,这种不稳定性促进了肿瘤的进展和恶化。本文旨在探讨H2B-RFP融合蛋白能够更好地观测肿瘤活细胞有丝分裂过程。方法:将携带H2B-RFP融合基因的质粒瞬时转染人宫颈癌细胞系Hela并利用抗性药物筛选得到阳性细胞克隆,利用激光共聚焦显微镜活细胞培养系统记录稳定筛选Hela细胞的细胞周期。结果:得到稳定表达H2B-RFP的Hela细胞且其与亲本Hela细胞相比对细胞周期的运行没有影响,并且可以展示Hela细胞有丝分裂的进程。结论:H2B-RFP融合蛋白可以非常敏感地显示肿瘤细胞的染色体并跟踪活体状态下肿瘤细胞有丝分裂过程。

H2A-H2B类型组蛋白及其伴侣蛋白的研究进展

染色质是真核细胞中遗传物质DNA的载体,染色质结构动态变化与DNA复制、转录、重组、修复等重要生物学事件密切相关.组蛋白是染色质结构的基本组成元件之一,组蛋白变体和组蛋白修饰是两类基本的染色质结构调控因子.在构成核小体的四种核心组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)当中,H2A拥有最多的变体类型并在染色质结构调控中发挥重要作用.H2A组蛋白伴侣对H2A组蛋白及其变体的特异识别对于后者的折叠、修饰、传递、转运、组装、移除等生物学功能至关重要.本文着重探讨了组蛋白伴侣特异识别H2A组蛋白的分子机理,二者调控染色质结构的作用机制以及相应的生物学意义.

盐离子作用下组蛋白变体H2A.Z增强核小体结构的稳定性

真核生物染色质的基本结构组成单元是核小体,基因组DNA被压缩在染色质中,核小体的存在通常会抑制转录、复制、修复和重组等发生在DNA模板上的生物学过程。组蛋白变体H2A.Z可以调控染色质结构进而影响基因的转录过程,但其详细的调控机制仍未研究清楚。为了比较含有组蛋白变体H2A.Z的核小体和常规核小体在盐离子作用下的稳定性差异,本文采用F rster共振能量转移的方法检测氯化钠、氯化钾、氯化锰、氯化钙、氯化镁等离子对核小体的解聚影响。实验对Widom 601 DNA序列进行双荧光Cy3和Cy5标记,通过荧光信号值的变化来反映核小体的解聚变化。F rster共振能量转移检测结果显示:在氯化钠、氯化钾、氯化锰、氯化钙和氯化镁作用下,含有组蛋白变体H2A.Z的核小体解聚速度相比于常规核小体要慢,且氯化钙、氯化锰和氯化镁的影响更明显。电泳分析结果表明,在75℃条件下含有组蛋白变体H2A.Z的核小体的解聚速率明显低于常规核小体。采用荧光热漂移检测(fluorescence thermal shift analysis,FTS)进一步分析含有组蛋白变体H2A.Z核小体的稳定性,发现两类核小体的荧光信号均呈现2个明显的增长期,含有组蛋白变体H2A.Z核小体的第1个荧光信号增速期所对应的温度明显高于常规核小体,表明核小体中H2A.Z/H2B二聚体的解聚变性温度要高于常规的H2A/H2B二聚体,含有组蛋白变体H2A.Z核小体的热稳定性高。研究结果均表明,含有组蛋白变体H2A.Z的核小体的结构比常规核小体的结构稳定。

γH2AX和53BP1蛋白在肺正常上皮细胞DNA氧化损伤反应中的表达

目的探讨肺正常上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBE)中磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX,γH2AX)和p53结合蛋白1(p53-Binding protein 1,53BP1)在DNA氧化损伤反应中的表达。方法用0、25、50、100、200、400μmol/L过氧化氢(H2O2)处理HBE细胞1 h,对其造成氧化损伤引起DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs);CCK-8比色法检测H2O2对HBE细胞活性的影响,流式细胞术检测细胞凋亡情况,荧光显微镜检测HBE细胞核内γH2AX和53BP1蛋白的聚集情况,western blot检测γH2AX、53BP1、BRCA1蛋白的表达水平。结果与对照组比较,25μmol/L H2O2处理组细胞活性(1.07±0.01)升高,50、100、200、400μmol/L H2O2处理组细胞活性(分别为0.97±0.01,0.96±0.01,0.95±0.01和0.94±0.01)降低,差异具有统计学意义(F=50.35,P<0.01)。细胞凋亡检测结果显示,与对照组[(4.65±0.32)%]比较,50、100、200、400μmol/L H2O2处理组细胞凋亡率[分别为(7.54±0.57)%、(7.84±0.68)%、(8.40±0.50)%和(14.03±1.03)%]升高(F=35.879,P<0.01)。与对照组比较,经25、50、100、200、400μmol/L H2O2处理后γH2AX的平均荧光强度升高(F=223.97,P<0.01),而经50、100、200、400μmol/L H2O2处理后53BP1的平均荧光强度降低(F=117.78,P<0.01);western blot结果显示,随着H2O2浓度升高,γH2AX蛋白表达水平升高,BRCA1和53BP1的表达水平下降,差异均具有统计学意义(F分别为96.20,11.55,21.92,P均<0.01)。结论在H2O2导致HBE细胞的氧化损伤中,γH2AX可作为DNA氧化损伤标志物,但53BP1的表达下降提示HBE细胞可能通过其他途径进行DNA氧化损伤的修复。