组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1缺陷小鼠造血干细胞增殖加快且凋亡增加

目的研究组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1缺陷(MYSM1-/-)小鼠骨髓造血干细胞(HSC)的静息状态、增殖与凋亡情况。方法分离MYSM1-/-小鼠和野生对照(MYSM1+/+)小鼠的骨髓细胞,利用免疫磁珠和流式细胞仪分选获得表面标志为lin-Sca-1+c-kit+的HSC。采用腹腔注射溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)的方法检测HSC增殖与细胞周期、采用Hoechst 33342-派若宁(pyronin)Y双染色法检测静息态HSC的比例、采用异硫氰酸荧光素标记膜联素Ⅴ/7-氨基放线菌素D(annexinⅤ-FITC/7-AAD)双染色法检测HSC凋亡。比较MYSM1-/-小鼠和MYSM1+/+对照小鼠HSC数目、细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡的变化情况。结果 MYSM1-/-小鼠的骨髓细胞、HSC总数与野生型小鼠相比明显降低;HSC的S期比例增加、增殖加快、静息期细胞减少但功能有缺陷的MYSM1-/-HSC凋亡率显著上升。结论 MYSM1对维持HSC的静息状态有非常重要的作用,其缺陷可引起静息态的HSC大量进入S期,异常增殖的HSC凋亡增加并最终引起HSC和骨髓细胞总数减少。

组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1抑制骨髓来源树突状细胞的抗原提呈功能及炎性细胞因子的分泌

目的研究组蛋白H2A去泛素化酶Myb样SWIRM和MPN结构域1(MYSM1)对骨髓来源树突状细胞(BMDC)吞噬、抗原提呈、炎性细胞因子mRNA水平的影响。方法分离小鼠的骨髓细胞,在体外联合粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)诱导骨髓细胞分化为DC,利用小干涉RNA(siRNA)下调MYSM1的表达,采用免疫荧光微球实验检测BMDC的吞噬功能、流式细胞术检测BMDC的抗原提呈功能、实时定量PCR检测BMDC的IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达变化,探讨MYSM1下调后DC在固有免疫应答中的作用。结果下调MYSM1的表达后,BMDC的吞噬功能无显著变化,抗原提呈功能增强,IL-6、TNF-α的表达增强。结论 MYSM1在固有免疫应答中可以抑制BMDC的抗原提呈功能及炎性细胞因子分泌能力。

组蛋白赖氨酸甲基转移酶2D调控H9c2细胞中HIF-1α/VEGF通路(英文)

组蛋白赖氨酸甲基转移酶2D(histone-lysine N-methyltransferase 2D,KMT2D)作为主要的组蛋白3第4位赖氨酸(H3K4)甲基转移酶,在调控胚胎发育、组织分化、代谢和肿瘤抑制方面发挥重要作用。在小鼠体内,敲除Kmt2d会导致严重的心脏发育缺陷最终造成胚胎期死亡。低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)作为调节细胞应对低氧的关键转录因子,能够调控多种下游基因转录。有相关研究揭示,表观遗传调控者能够调节HIF-1α的稳定性和活性。同样,作为表观遗传调控者的组蛋白甲基转移酶KMT2D是否参与低氧条件下HIF-1α对下游基因的调控,目前仍未知。在本研究中,观察在Kmt2d正常或缺乏的情况下,心肌细胞H9c2对低氧环境的应答反应。结果显示,与常氧条件相比,低氧状态下HIF-1α、组蛋白乙酰化酶P300、KMT2D及其介导的H3K4一甲基化(H3K4 mono-methylation,H3K4me1)的蛋白质水平增加(P<0.05);HIF-1α下游基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,Vegf)的mRNA表达水平明显上调(P<0.01)。染色质免疫共沉淀实验(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP-qPCR)检测结果显示,H3K4me1和组蛋白3第27位赖氨酸乙酰化(histone 3 lysine 27 acetylation,H3K27ac)在Vegf基因启动子区域的结合丰度明显增加(P<0.05)。低氧条件下沉默Kmt2d之后,H3K4me1蛋白水平和Vegf的mRNA表达下降(P<0.05)。本研究表明,低氧条件下KMT2D参与调控HIF-1α和下游基因Vegf的表达。

小鼠MYSM1基因稳定敲除的间充质干细胞系C3H10T 1/2的建立及其体外免疫调节作用

目的:本研究旨在构建小鼠组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1基因敲除的间充质干细胞系(mesenchymal stem cells,MSC),并初步探讨MYSM1基因敲除后MSC免疫学特性的变化。方法:通过CRISPR-Cas9技术对小鼠间充质干细胞系(C3H10T 1/2)MYSM1基因进行特异性基因敲除,再采用流式细胞术、定量PCR和蛋白印迹(Western blot)技术检测基因敲除情况。为检测MYSM1敲除对MSC免疫调节能力的影响,将MYSM1基因敲除的MSC上清加入脾脏淋巴细胞培养体系中,在镜下观察其对淋巴细胞增殖的调节作用,并进一步采用定量PCR检测淋巴细胞内炎性因子白介素4,干扰素γ、白介素17A和Foxp3的表达情况。结果:流式细胞术、定量PCR及Western blot的鉴定结果表明,CRISPR-Cas9技术稳定敲除了MSC细胞系内MYSM1基因。敲除了MYSM1基因之后的MSC上清显著抑制刀豆蛋白A诱导的淋巴细胞增殖及炎性因子分泌(P<0.05)。结论:本研究成功地构建了小鼠MYSM1稳定敲除的间充质干细胞系,同时发现MYSM1敲除后MSC体外免疫抑制作用增强,此相关发现为深入研究MYSM1基因的功能,探索基因修饰MSC对免疫相关性疾病的治疗奠定了基础。