IgA肾病患者CpG岛组蛋白H3赖氨酸4三甲基化水平的研究

目的研究IgA肾病患者CpG岛组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)水平。方法采用染色质免疫共沉淀联合芯片技术(ChIP-chip)对15例IgA肾病患者和15例健康者的外周血单个核细胞(PBMCs)H3K4me3进行高通量的筛选,染色质免疫共沉淀-实时定量聚合酶链反应(ChIP-qPCR)验证芯片结果。定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测H3K4me3显著差异基因的mRNA表达水平。结果与健康对照组相比,IgA肾病患者的83个基因存在H3K4me3显著差异,其中有39个基因显示H3K4me3水平增高,44个基因H3K4me3水平降低;ChIP-qPCR验证结果与CpG岛芯片结果相符,基因H3K4me3异常变化影响mRNA的表达。结论 IgA肾病患者PBMCs基因组H3K4me3存在显著改变,异常基因有助于研究IgA肾病的发病机制。

类风湿关节炎患者外周血单个核细胞组蛋白H3赖氨酸4三甲基化水平检测及意义

目的研究类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMCs)组蛋白H3赖氨酸4(H3K4)三甲基化(Me3)水平。方法梯度密度离心法分离8例RA患者和8例健康者的PBMCs,采用染色质免疫共沉淀联合芯片技术(ChIP-chip)在全基因组范围内对RA患者及健康者的PBMCs组蛋白H3K4me3进行高通量的筛选。染色质免疫共沉淀-实时定量聚合酶联反应(ChIP-qPCR)验证芯片结果。定量反转录聚合酶联反应(qRT-PCR)检测H3K4me3显著差异基因的mRNA表达水平。结果RA患者与对照比较,鉴定出364个基因存在H3K4me3显著差异,其中有66个基因显示有H3K4me3程度增高,298个基因有H3K4me3程度降低;ChIP-qPCR验证结果与CpG岛芯片结果一致。结论RA患者与健康者之间的PBMCs存在组蛋白H3K4me3显著改变。ChIP-chip技术有利于进一步揭示RA分子机制,发现新的治疗靶点。

三甲基化组蛋白H3赖氨酸4对调节性T淋巴细胞foxp3基因表达的影响

目的探讨天然调节性T淋巴细胞(nTreg)的三甲基化组蛋白H3赖氨酸4(H3K4me3)对foxp3基因的影响,寻找维持调节性T淋巴细胞(Treg)表型长期稳定的方法。方法使用免疫磁珠细胞(MACS)分选法从健康人外周血中分离出CD4+CD25+Treg。对CD4+CD25+Treg分别进行0 d、3 d、7 d培养,其中0 d为阴性对照组,3 d为阳性组1,7 d为阳性组2,采用流式细胞仪(FCM)对0 d、3 d、7 d nTreg膜表面标志CD25的变化进行检测,并分别对培养0 d、3 d、7 d的nTreg细胞通过染色质免疫共沉淀(ChIP-PCR)法检测foxp3基因启动子区H3K4me3及DNA水平变化。结果 1.使用细胞计数Kit-8(CCK-8)法确定植物血凝素(PHA)质量浓度在10 mg.L-1时为最佳的药物质量浓度,对Treg细胞的增殖作用最为显著。nTreg细胞培养0 d、3 d、7 d的表型变化呈递减趋势。随着培养时间(0 d、3 d、7 d)的延长,与foxp3基因启动子区结合的H3K4me3表达逐渐减少。2.采用ChIP-PCR法对培养0 d、3 d、7 d的nTreg细胞检测与H3K4me3结合的foxp3基因启动子区DNA水平变化。DNA凝胶电泳图显示,0 d、3 d在204 bp处可见条带(灰度值分别为2.31、0.91),7 d有模糊条带或无条带。三者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PHA不能维持Treg细胞的表型稳定,其机制与H3K4me3减少有关。

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞组蛋白H3赖氨酸4三甲基化水平的研究

目的研究系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单个核细胞（PBMCs）组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）三甲基化（Me3）水平。方法梯度密度离心法分离10例SLE活动期患者、7例SLE稳定期患者和8名健康者的PBMCs，采用染色质免疫共沉淀联合芯片技术（ChIP—chip）在全基因组范围内对SLE患者及健康者的PBMCs组蛋白H3K4me3进行高通量的筛选。染色质免疫共沉淀一实时定量聚合酶链反应（ChIP—qPCR）验证芯片结果。定量反转录一聚合酶链反应（qRT—PCR）检测H3K4me3显著差异基因的mRNA表达水平。结果10例SLE活动期患者与健康对照相比较，鉴定出413个基因存在H3K4me3显著差异，其中137个基因显示H3K4me3程度增高，276个基因H3K4me3程度降低；7例SLE稳定期患者与健康对照相比较，发现393个基因存在H3K4me3表达差异，其中有112个基因H3K4me3程度增高，281个基因H3K4me3程度降低。ChIP—qPCR验证结果与CpG岛芯片的结果相一致。结论SLE患者与健康者之间的PBMCs存在组蛋白H3K4me3显著改变。ChIP—chiD技术有利于进一步揭示SLE分子机制，发现新的治疗靶点。

组蛋白赖氨酸去甲基化酶5A在中枢神经系统疾病中的作用

组蛋白甲基化修饰是表观遗传的重要机制之一,最近研究发现组蛋白赖氨酸去甲基化酶5A(KDM5A)在个体发育、组织分化和肿瘤发生发展等过程中发挥重要的调控作用。成年动物大部分脑区已经失去神经发育功能,但是最新单细胞测序技术和精神疾病的动物模型研究揭示动物脑内KDM5A表达改变与神经疾病发生相关,提示KDM5A是探究脑疾病潜在的靶分子。本文从KDM5A分子结构、表达调控通路等方面总结最新进展,从而为后续其他中枢神经系统疾病研究提供参考。

IgA肾病组蛋白H3K4三甲基化和DNA甲基化基因修饰的相关性

目的:探讨IgA肾病(IgAN)外周血单个核细胞(PBMCs)组蛋白H3赖氨酸4(H3K4)三甲基化与DNA甲基化之间的关系。方法:采用染色质免疫共沉淀联合芯片技术(ChIP-chip)对40例IgAN患者和40例健康者的PBMCs H3K4三甲基化进行高通量筛选,染色质免疫共沉淀-实时定量聚合酶链反应(ChIP-qPCR)验证芯片结果,定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测阳性基因的mRNA表达水平,采用甲基化DNA免疫共沉淀定量聚合酶链反应(MeDIP-qPCR)检测DNA甲基化水平。结果:IgAN病人PBMCs基因组H3K4三甲基化水平升高,基因组DNA甲基化水平降低。4个阳性基因H3K4三甲基化水平和DNA甲基化水平与正常对照组相比,显著差异(P<0.05)。结论:IgAN患者PBMCs基因组H3K4三甲基化和DNA甲基化水平存在显著改变,DNA甲基化和组蛋白H3K4三甲基化基因修饰存在相互作用。

采用ChIP-chip技术分析大鼠肺成纤维细胞转分化前后全基因组蛋白H3K4三甲基化水平的改变

目的研究经二氧化硅(Si O_2)染毒的肺成纤维细胞(LF)转分化前后全基因组蛋白H3赖氨酸4(H3K4)三甲基化(met3)水平的改变。方法原代培养大鼠肺泡巨噬细胞(AM)和LF,采用transwell共培养,建立共培养模型,用100 mg·L^(-1)游离Si O_2粉尘染毒AM 24 h,收集LF细胞,免疫组织化学法对转分化后的LF进行表型鉴定。采用染色质免疫共沉淀联合芯片技术(Ch IP-chip)对LF全基因组蛋白H3K4met3进行高通量筛选,采用染色质免疫共沉淀-实时荧光定量聚合酶联反应技术(Ch IP-q PCR)验证芯片结果,采用定量逆转录聚合酶联反应技术(q RT-PCR)检测H3K4出现显著差异的m RNA表达水平。结果通过对经Si O_2染毒前后LF全基因组蛋白H3K4met3水平的对比,共筛选出1815个基因存在H3K4显著性差异(Cy3/Cy5比值>2.0或<0.5,Nimble Scan V2.5软件),其中518个基因出现H3K4met3程度增高,1297个基因H3K4met3程度降低。随机挑选2个差异表达基因nfib和kpna3,以Ch IP-q PCR和q RT-PCR方法验证,取得与Cp G岛芯片一致的结果。结论经Si O_2染毒的LF转分化前后全基因组蛋白H3K4met3水平存在显著改变。Ch IP-chip技术有利于进一步揭示矽肺纤维化发生的分子机制,有助于发现新的蛋白标志物和基因干预靶点。

三阴性乳腺癌组织H3K4me3、H3K9ac表达与临床病理特征和预后的关系

目的探讨三阴性乳腺癌(TNBC)组织组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化(H3K4me3)、组蛋白H3第9位赖氨酸残基乙酰化(H3K9ac)表达与临床病理特征和预后的关系。方法选择TNBC患者145例,收集术中切除的TNBC组织,采用免疫组化法检测H3K4me3、H3K9ac和Ki-67表达,分析TNBC组织H3K4me3、H3K9ac表达与临床病理特征、Ki-67表达强度以及预后的关系。结果145例份TNBC组织中,H3K4me3高表达84例份、低表达61例份,H3K9ac高表达78例份、低表达67例份。TNBC组织H3K4me3、H3K9ac表达均与T分期、N分期和组织分化程度有关(P均<0.05),而与年龄、绝经状态、肿瘤直径、病理类型无关(P均>0.05)。随着Ki-67表达强度增加,TNBC组织H3K4me3、H3K9ac阳性表达逐渐增多(P均<0.05)。TNBC组织H3K4me3高表达者与低表达者3年累积生存率分别为60.7%、78.7%,H3K9ac高表达者与低表达者3年累积生存率分别为58.3%、82.0%,TNBC组织H3K4me3、H3K9ac高表达者3年累积生存率均显著低于其低表达者(P均<0.05)。结论TNBC组织H3K4me3、H3K9ac高表达,其高表达与肿瘤侵袭、转移以及患者预后不良密切相关。

组蛋白共价修饰——组蛋白H3第4赖氨酸甲基化

染色体组蛋白的共价修饰在调节染色体结构,控制基因的转录等方面发挥重要的作用。组蛋白H3第4赖氨酸的甲基化作为共价修饰的方式之一,可以调控基因的转录激活。随着对组蛋白甲基化转移酶及相关作用蛋白研究的深入,人们对组蛋白H3第4赖氨酸的甲基化的功能也有了更深的了解。目前研究发现它与癌症也有很密切的关系。

镧暴露对子代大鼠学习记忆及海马组蛋白H3K4me3表达的影响

目的探讨镧暴露对子代大鼠学习记忆能力及海马组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)水平的影响。方法将24只SPF级雌性Wistar孕鼠随机分为对照组,2.5、5.0和10.0 g/L氯化镧(LaCl_(3))染毒组,其子代大鼠断乳后通过自由饮水方式按原浓度继续镧暴露。而后在不同时间采用Morris水迷宫实验检测子代大鼠的学习记忆能力,ELISA法测定海马中组蛋白甲基转移酶(HMT)的活性,Western blot法检测海马中H3K4me3和脑源性神经营养因子(BDNF)的蛋白表达水平。结果与对照组比较,出生后第14、21、28、35和49天LaCl_(3)染毒组子代大鼠体质量明显下降(P<0.05)。LaCl_(3)染毒组子代大鼠寻找逃逸平台的潜伏期延长(P<0.05),穿越平台次数和目标象限停留时间均减少(P<0.05),提示子代大鼠空间学习记忆能力受损;与对照组相比,LaCl_(3)染毒组子代大鼠海马HMT活性降低(P<0.05),H3K4me3和BDNF蛋白表达水平均降低(P<0.05),并呈剂量-反应关系。结论镧暴露导致子代大鼠学习记忆能力损伤可能与海马组蛋白H3K4me3表达下降有关。

组蛋白去甲基化酶LSD1抑制剂对MLL-ENL白血病细胞诱导分化的研究

目的研究组蛋白去甲基化酶LSD1抑制剂对MLL-ENL亚型白血病细胞的影响,为LSD1成为MLL-ENL亚型白血病的治疗新靶点提供证据。方法首先采用LSD1酶活性抑制剂反式环苯丙胺(TCP)处理细胞,通过细胞增殖、克隆形成实验和瑞士吉姆萨染色等实验技术,检测LSD1抑制剂处理对MLL-ENL白血病细胞的影响;进一步采用蛋白质印迹和RT-PCR实验技术,探索LSD1抑制在MLL-ENL白血病细胞中的作用机制。结果 LSD1抑制剂处理显著降低MLL-ENL白血病细胞的增殖和克隆形成能力,并诱导细胞分化;LSD1抑制剂处理后,组蛋白修饰H3K4me2整体水平升高,致癌基因Bmi1表达显著降低并且分化相关基因的表达被激活。结论 LSD1抑制剂处理促进MLLENL白血病细胞分化并抑制白血病细胞生长,可能与组蛋白修饰H3K4me2改变后抑制关键致癌基因和激活分化基因有关。

长链非编码RNA MYU对宫颈癌Hela细胞增殖的影响及其机制

目的探讨长链非编码RNA MYU对宫颈癌Hela细胞增殖的影响及其机制。方法检测长链非编码RNA MYU在宫颈癌组织和癌旁组织中的表达差异,将Hela细胞株分为:1组:转染对照NC序列;2组:转染MYU siRNA;3组:转染对照pc DNA3.1;4组:转染pc DNA3.1-MYU过表达序列。采用CCK-8法检测各组细胞细胞增殖活力,Western blotting和RT-PCR检测c-myc、CDK4、CDK6基因mRNA及蛋白的表达,采用RNA结合蛋白免疫沉淀试验验证WDR5与MYU的结合,染色质免疫沉淀试验检测组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)水平。结果癌组织LncRNA MYU的表达量高于癌旁组织(P<0.05);转染24、48 h,OD值比较,2组低于1组,4组高于3组,P均<0.05;Ki-67阳性细胞所占百分比比较,1组高于2组,3组低于4组,P均<0.05;c-myc、CDK4、CDK6mRNA及蛋白比较,1组高于2组,3组低于4组,P均<0.05;LncRNA MYU与WDR5的富集量高于阴性对照(P<0.05);H3K4me3水平比较,1组低于2组,3组高于4组,P均<0.05。结论长链非编码RNA MYU通过募集WDR5抑制c-myc基因启动子区H3K4me3,上调c-myc转录从而促进Hela细胞增殖。

职业性铝接触工人认知功能与H3K4me3和BDNF的关系

目的探讨职业性铝接触对工人认知功能影响及其与外周血淋巴细胞组蛋白H3赖氨酸残基4位点三甲基化修饰（H3K4me3）、血浆脑源性神经生长因子（BDNF）蛋白水平的关系。方法于2015年9月，采用整群抽样的方式，选择山西某铝厂235例男性工人作为研究对象。采用简短精神状态量表（MMSE）、画钟试验（CDT）、数字广度测验[DST，包括正序测试（DSFT）和倒序测试（DSBT）]、物体记忆测验（FOME）、言语流畅性测验（VFT）等进行调查，收集研究对象的一般情况并进行认知功能评分；采用石墨炉原子吸收法测定血铝含量，以血铝水平的肘（P25，P75）分为低、中、高血铝组；酶联免疫吸附试验（ELISA）方法定量检测外周血淋巴细胞中H3K4me3水平和血浆BDNF蛋白水平。结果工人血铝水平M（P25，P75）为134．36（100．14，178．96）μg/L。高血铝组工人MMSE、DSFF、DSBT、DST平均得分分别为27．98±1．53、9．19±2．00、6．08±1．63、15．27±3．11，均低于低血铝组（28．83±1．25、10．64±2．87、7．19±3．07、17．81±4．72），差异均有统计学意义（均P〈0.05）。3个血铅组工人的CDT、FOME、VFT平均得分比较，差异均无统计学意义（均P〉0．05）。高血铝组工人外周血淋巴细胞H3K4me3水平为（18．45±9．81）ng/μg Pro、血浆BDNF蛋白水平为（26．07±10．18）ng／ml，均分别低于低血铝组[（23．76±9．89）ng/μg Pro、（31．66±9．24）ng/ml]，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。Spearman秩相关分析结果显示，H3K4me3、BDNF、MMSE、DSFT和DST与血铝水平之间存在负相关（rs=-0．307、-0．214、-0．252、-0．197和-0．181，均P〈0.01）。结论长期职业性铝接触可能引起认知功能改变，并伴随外周血淋巴细胞H3K4me3水平和血浆BDNF蛋白表达降低。

猫爪草对缺血再灌注小鼠急性肾损伤的作用及机制

目的探讨猫爪草(RTT)对缺血再灌注(IR)小鼠急性肾损伤(AKI)的作用及其可能机制。方法15只雄性C57BL/6小鼠随机均分为假手术组(sham组)、IR组、RTT预处理组(IR+RTT组),IR+RTT组术前14 d每天按2 g/kg剂量予RTT预灌胃处理,IR组和sham组给予等体积双蒸水灌胃;sham组小鼠仅钝性剥离肾蒂,另两组小鼠夹闭双侧肾蒂45 min构建IR模型;术后24 h处死小鼠,取眼球血液及肾脏;生化法检测血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN),HE染色观察肾组织改变,免疫组织化学、Western blot检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、组蛋白H3赖氨酸36三甲基化(H3K36me3)、组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)的表达变化,Pearson相关性分析H3K36me3、H3K4me3、TNF-α与NGAL的相关性。结果IR组小鼠血清Scr和BUN高于sham组(P<0.05),IR+RTT组小鼠血清Scr和BUN低于IR组(P<0.05);HE染色显示,sham组小鼠肾小管和肾小球形态结构清晰,IR组肾小管上皮细胞出现肿胀、脱落、坏死,IR+RTT组肾脏病变明显改善;免疫组织化学、Western blot结果显示,与sham组相比,IR组小鼠肾脏组织NGAL、TNF-α、H3K36me3、H3K4me3蛋白水平上调(P<0.05);与IR组相比,IR+RTT组小鼠肾脏组织NGAL、TNF-α、H3K36me3、H3K4me3蛋白水平下调(P<0.05);Pearson相关性分析结果显示,IR-AKI小鼠肾组织H3K36me3、H3K4me3、TNF-α与NGAL表达水平均呈正相关关系(r=0.739、0.782、0.713,P<0.05)。结论RTT对IR-AKI小鼠肾功能及肾组织损伤具有预防作用,其机制可能与下调H3K36me3、H3K4me3、TNF-α表达进而抑制炎症反应有关。

微小RNA-153在砷致肝细胞凋亡过程中的表达变化及其调控作用

目的探讨砷诱导内质网应激致肝细胞凋亡过程中微小RNA-153(miR-153)表达变化及调控组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)甲基转移酶(SET7/9)和组蛋白H3K4一甲基化(H3K4me1)水平变化的机制。方法体外培养人正常肝细胞(L-02细胞),根据不同处理方式分为对照、砷处理、砷+阴性转染、砷+miR-153上调和砷+miR-153下调组,其中砷+阴性转染、砷+miR-153上调和砷+miR-153下调组转染质粒与转染试剂均按照3μg∶8μl进行转染。24 h后,砷处理、砷+阴性转染、砷+miR-153上调和砷+miR-153下调组再以100μmol/L亚砷酸钠(NaAsO2)作为终浓度处理24 h;对照组加入与NaAsO2等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)处理24 h。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组细胞miR-153表达水平;流式细胞术检测各组细胞凋亡和周期情况;实时无标记细胞动态分析(RTCA)仪检测细胞增殖情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞内质网标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、SET7/9及H3K4me1蛋白表达水平。结果各组细胞miR-153表达水平比较,差异有统计学意义(F=10.73,P<0.05)。与对照组[(41.10±6.08)%]比较,砷处理组miR-153表达水平[(4.35±0.20)%]明显降低(P<0.05);与砷+阴性转染组[(10.00±2.40)%]比较,砷+miR-153上调组miR-153表达水平[(157.70±42.70)%]明显升高(P<0.05),砷+miR-153下调组miR-153表达水平[(4.20±0.28)%]明显降低(P<0.05)。各组细胞总凋亡率、G1期细胞比例比较,差异有统计学意义(F=29.69、104.32,P均<0.05)。与对照组比较,砷处理、砷+miR-153上调、砷+miR-153下调组细胞总凋亡率、G1期细胞比例明显升高(P均<0.05);与砷+阴性转染组比较,砷+miR-153上调组细胞总凋亡率、G1期细胞比例明显下降(P均<0.05),砷+miR-153下调组细胞总凋亡率、G1期细胞比例明显升高(P均<0.05)。各组细胞增殖率比较差异有统计学意义(F=799.35,P<0.05)。与对照组比较,砷处理、砷+miR-153上调、砷+miR-153下调组细胞增殖率明显下降(P均<0.05);与砷+阴性转染组比较,砷+miR-153上调组细胞增殖率升高(P<0.05),砷+miR-153下调组细胞增殖率下降(P<0.05)。各组细胞SET7/9、GRP78和H3K4me1蛋白表达水平比较,差异有统计学意义(F=78.52、52.13、54.32,P均<0.05)。与对照组比较,砷处理组SET7/9、GRP78和H3K4me1蛋白表达水平明显升高(P均<0.05);与砷+阴性转染组比较,砷+miR-153上调组SET7/9、GRP78和H3K4me1蛋白表达水平明显下降(P均<0.05),砷+miR-153下调组SET7/9、GRP78和H3K4me1蛋白表达水平明显升高(P均<0.05)。结论miR-153在砷诱导内质网应激致肝细胞凋亡过程中具有重要作用,其表达和调控与SET7/9和H3K4me1水平变化有关。