UHRF2通过其PHD结构域与组蛋白H3K9乙酰化相互作用

目的:探讨UHRF2蛋白与组蛋白组蛋白H3第9位赖氨酸残基乙酰化(Histone H3 Lys9 acetylation,H3K9ac)的相互作用及两者相互作用结合区域的测定。方法:在LO2和Hep G2细胞中转染p CMV-FLAG-UHRF2,激光共聚焦分别检测UHRF2与组蛋白H3、H3K9ac和H3K14ac在细胞内的共定位。采用免疫沉淀技术分别检测UHRF2与组蛋白H3、H3K9ac和组蛋白H3第14位赖氨酸基乙酰化(Histone H3 Lys14 acetylation,H3K14ac)在细胞中的相互作用,以及用UHRF2的不同缺失体层粒分别与组蛋白H3K9ac相结合方法来检测UHRF2与之相互作用的功能性结合区域。结果:(1)UHRF2与组蛋白H3、H3K9ac和H3K14ac在LO2和Hep G2细胞中存在共定位现象。(2)在LO2和Hep G2细胞中,UHRF2与H3K9ac相互结合。(3)在正常肝细胞LO2中,UHRF2与H3K9ac相互作用的结合区域为PHD结构域。而在肝癌细胞Hep G2中,除了PHD结构域以外,YDG/SRA结构域也是UHRF2与H3K9ac的关键结构域。结论:UHRF2通过其PHD结构域与H3K9ac相互作用。

温肾生精饮对生精细胞凋亡和组蛋白H3K9二甲基化的影响

目的研究温肾生精饮对环磷酰胺致小鼠睾丸生精细胞凋亡和组蛋白H3K9二甲基化(H3K9me2)的影响。方法将8周龄的60只昆明种雄性小鼠随机分为对照组、模型组、西药组和中药组,每组15只。对照组腹腔注射0.9%Na Cl溶液,模型组、西药组和中药组连续5天腹腔注射环磷酰胺(80μg·g-1·d-1的)然后将对照组和模型组小鼠灌胃0.9%Na Cl溶液,西药组、中药组小鼠分别灌胃克罗米芬、温肾生精饮。各组均干预30天,检测小鼠的体质量、睾丸重和附性腺重;观察睾丸生精上皮的发育且进行Johnsen评分;TUNEL法检测睾丸生精细胞的凋亡;免疫荧光法检测睾丸生精小管中H3K9me2蛋白的表达。结果与模型组和西药组比较,中药组显著提高了生精障碍小鼠的体质量、附性腺指数和小鼠睾丸组织的Johnsen评分(P<0.05),促进了生精上皮的发育,显著减少了小鼠睾丸组织中凋亡的生精小管数和生精小管内凋亡的阳性细胞数(P<0.05),上调了精子细胞中H3K9me2的表达水平。结论温肾生精饮能显著修复环磷酰胺致小鼠睾丸生精功能损伤,其修复机制可能与减少睾丸生精细胞凋亡,稳定精子细胞中H3K9me2的表达水平有关。

小鼠癫痫持续状态时组蛋白H3K9二甲基化水平的变化及其调控作用

目的研究癫痫持续状态对组蛋白H3K9二甲基化修饰的作用。方法用Western blot比较研究小鼠癫痫持续状态后大脑皮层和海马的组蛋白H3K9二甲基化水平及相关蛋白表达水平的变化。利用特异性抑制剂BIX01294处理原代培养的小鼠大脑皮层神经元,观察组蛋白H3K9二甲基化水平对谷氨酸脱羧酶GAD67表达水平的影响。用染色体免疫沉淀技术验证组蛋白H3K9甲基化酶G9a与GAD67的启动子区的相互作用。结果癫痫持续状态能够下调组蛋白H3K9甲基转移酶G9a的表达和组蛋白H3K9的二甲基化水平,同时上调GAD67的表达水平。在培养神经元中,用BIX01294抑制组蛋白H3K9二甲基化水平可以上调GAD67的表达水平。染色体免疫沉淀实验发现G9a能和GAD67启动子区域相互作用。结论癫痫持续状态下调组蛋白H3K9二甲基化水平及组蛋白H3K9甲基转移酶G9a的表达水平,并能引起GAD67表达水平上调。

组蛋白H3K9me3在胆管癌发生机制中的作用

目的 观察组蛋白H3K9me3修饰在胆管癌发病机制中的作用.方法 收集9例病理确诊的胆管腺癌组织和5例正常的肝外胆管组织,采用染色质免疫共沉淀联合芯片技术（ChIP-chip）检测两种组织细胞全基因组的蛋白H3K9me3修饰水平,进行基因验证,并检测mRNA的表达水平.结果 与胆管组织细胞比较,胆管癌细胞全基因组范围共筛选出67个基因存在H3K9me3修饰显著差异,其中35个基因升高,32个基因降低.在癌细胞中,6个挑选基因[钙结合蛋白A2（S100A2）、GTP酶激活蛋白基因2亚型（ANAPC2）、CBFA2T3、GTP酶激活蛋白4（ARHGAP）、鸟嘌呤核苷酸交换因子3（RAPGEF3）、α型蛋白激酶C基因（PRKCA）]的H3K9me3修饰水平分别为：（3.51±0.21）％、（8.45±0.16）％、（0.89±0.27）％、（0.66±0.22）％、（0.04±0.01）％、（5.21±1.53）％,与正常胆管细胞比较差异有统计学意义,并且其修饰水平与基因表达呈负直线相关（r=-0.539,P＜0.05）.结论 与正常胆管细胞比较,胆管癌细胞中多个基因的组蛋白H3 Kme3修饰水平存在显著改变;并导致了多个相关的癌基因及抑癌基因转录表达的改变.

局灶性脑缺血再灌注损伤对小鼠脑组织SUV39H1、H3K9及GFAP表达的影响

目的探讨局灶性脑缺血再灌注损伤中病变区域组蛋白3赖氨酸9(H3K9)及其甲基化转移酶(SUV39H1)与星形胶质细胞活化标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的变化特点。方法选用C57BL/6小鼠作为实验对象,运用Koizumi法建立左侧大脑中动脉局灶性缺血再灌注小鼠模型(MCAO model),采用行为学、切片染色、qRT-PCR、相关分析、Western blot等方法,对比观察空白对照组、假手术组、脑缺血2 h再灌注24 h(实验组)小鼠大脑组织SUV39H1、H3K9及GFAP的表达情况。结果氯化三苯四氮唑(TTC)染色结果显示,与假手术组和空白对照组相比,实验组小鼠脑梗死面积明显增加、脑水肿明显。qRT-PCR及Western blot结果显示,与假手术组和空白对照组相比,实验组小鼠脑组织SUV39H1、H3K9及GFAP的表达明显增加(P<0.05)。结论局灶性脑缺血再灌注损伤的小鼠脑组织SUV39H1和H3K9的表达增加,同时GFAP的表达也显著增加,提示星形胶质细胞活化对局灶性缺血再灌注损伤的小鼠脑组织中SUV39H1和H3K9表达增加可能具有重要作用。

组蛋白乙酰化修饰调控NF-κB驱动的PNPLA3基因表达的机制初探

目的探讨禁食/再喂食后小鼠肝脏Patatin样磷脂酶域蛋白3(PNPLA3)基因启动子核因子-κB(NF-κB)结合区域组蛋白H3K9乙酰化(H3K9ac)水平以及相关去乙酰化酶(HDAC)和乙酰化转移酶(HAT)的变化特点。方法根据体质量将18只C57BL/6小鼠随机分为3组各6只,分别为自由饮食组、禁食组(夜间饥饿24 h)和再喂食组(饥饿24 h后再自由摄食高蔗糖含量饲料12 h),分别予自由饮食、禁食和禁食后再喂食干预,检测并比较各组肝脏PNPLA3、NF-κB、HDAC(SIRT1、SIRT6)和HAT(GCN5、Elp3)基因表达情况,用染色质免疫共沉淀-定量PCR检测H3K9ac富集水平,并分析H3K9ac与PNPLA3表达的相关性。结果 3组比较,C57BL/6小鼠肝脏PNPLA3、NF-κB基因表达在禁食时下调,再喂食后又上调(P均<0.001)。H3K9ac水平变化与PNPLA3变化趋势一致(P均<0.05),相关分析提示两者具有相关性(rs=0.958, P <0.001);禁食组SIRT1和SIRT6表达水平较自由饮食组高,再喂食组两者水平均下降(P均<0.05),与H3K9ac变化趋势相反;GCN5、Elp3表达变化与SIRT1及SIRT6类似(P均<0.05)。结论 SIRT1和SIRT6相关H3K9去乙酰化涉及饮食调节NF-κB驱动的PNPLA3的表达。

小鼠生发泡期卵母细胞成熟过程中转录沉默机制的探讨

目的:探讨小鼠生发泡卵母细胞成熟过程中发生大规模转录沉默的机制。方法:选用4～6周龄ICR雌性小鼠,分离生发泡(germinal vesicle,GV)期卵母细胞,运用RNA聚合酶Ⅱ抗体(anti-RNA PolⅡCTD,clone 4H8)及其羧基末端结构域(CTD)基团第2位丝氨酸磷酸化的抗体(anti-RNA PolⅡCTD Ser2-P,clone H5)、组蛋白H3K4/H3K9三甲基化的抗体(anti-H3K4me3、anti-H3K9me3)进行免疫荧光染色。观察伴随GV期小鼠卵母细胞染色质构型由非包围核仁(non-surround nucleolus,NSN)型转变为包围核仁(surround nucleolus,SN)型的过程,这两对标记物的表达及分布变化。结果:在NSN型的GV期卵母细胞中,RNA PolⅡCTD Ser2-P于核浆中呈特征性斑块状分布,同时H3K4me3在核浆中也显示强阳性信号;但在SN型卵母细胞中,RNA PolⅡCTD Ser2-P失去特征性分布,转变为核浆中弥漫性分布,H3K4me3的核浆中阳性信号也消失。结论:RNA聚合酶Ⅱ的活性降低及组蛋白修饰状态的改变在小鼠GV期卵母细胞成熟过程的大规模转录沉默中发挥了重要作用。

乌司他丁对50％总体表面积烫伤大鼠心肌保护作用的研究

目的：研究乌司他丁（ ulinastatin， UTI）对50％总体表面积烫伤大鼠心肌的保护作用及其与保护性蛋白表达的关系。方法40只雄性SD大鼠随机分为烫伤组（ n＝20）和乌司他丁组（ n＝20），两组动物均造成50％总体表面积Ⅲ度烫伤，烫伤后即刻静脉分别注射生理盐水和乌司他丁40000 U／kg。于烫伤后6 h和24 h取大鼠腹主动脉血，测定血浆肌酸激酶同工酶（ CK－MB）活性，采用干／湿质量法测定心肌组织含水量，用酶联免疫吸附法（ ELISA）检测心肌组织热休克蛋白70（HSP70）的含量，用蛋白质免疫印迹法（Western blot）测定心肌细胞中乙酰化组蛋白H3赖氨酸9（Ac－H3K9）表达。结果烫伤后6 h乌司他丁组CK－MB和心肌组织含水量分别为[（1638．3＆#177;339．2）U／L和（68．14＆#177;1．93）％]，显著低于烫伤组[（2271．8＆#177;350．9）U／L和（83．02＆#177;2．12）％]（P＜0．05）；伤后24 h上述指标两组比较差异无统计学意义（P＞0．05）。伤后6 h乌司他丁组心肌HSP70和Ac－H3K9表达水平均显著高于烫伤组（P＜0．05或P＜0．01）。伤后24 h上述指标两组比较差异无统计学意义（P＞0．05）。结论乌司他丁能减轻致死性烫伤大鼠早期的心肌损害，减轻组织水肿，其机制可能与乌司他丁能增加大鼠心肌保护性蛋白表达，提高对烧伤的耐受力有关。