‘红阳’猕猴桃软腐病病原菌细极链格孢菌的基因组组装与功能分析

以‘红阳’猕猴桃软腐病病原菌细极链格孢菌为材料,利用三代结合二代测序技术对其进行基因组测序。结果表明,组装的细极链格孢菌基因组大小为33.87 Mb,N50长度为6.8 Mb,GC含量为50.87%。基因组的组装共产生10条scaffolds,其中5条scaffolds两端包含端粒重复序列(TTAGGG),而另外5条仅一端有端粒重复序列。预测的11726个基因包括34个ncRNAs、118个tRNAs、25个rRNAs和11549个编码基因。对编码基因进行COG、GO和KEGG功能注释,表明碳水化合物的转运和代谢相关基因发挥重要功能。此外,发现有569个碳水化合物活性酶(CAZymes)基因。这些结果可为解析细极链格孢菌的致病机制提供基础数据。

芍药响应细极链格孢侵染的转录组分析

【目的】芍药在生长发育过程中容易遭受病原菌侵染,感染病害,由细极链格孢(Alternariatenuissima)引起的红斑病是其主要叶部病害,严重影响品质和产量,目前对芍药红斑病的抗病机理尚未清晰。本研究运用生理学和转录组学手段,探究芍药响应细极链格孢侵染的生理变化及分子途径。【方法】以芍药‘大富贵’为试验材料,取A.tenuissima接种后12、24和96 h的芍药叶片,测定其相关生理指标并进行转录组测序分析,以未接种叶片为对照。【结果】病原菌接种后,芍药叶片的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性增强,可溶性糖与可溶性蛋白以及丙二醛(MDA)含量升高,脯氨酸含量降低。在A.tenuissima侵染芍药12、24和96 h后,芍药分别有5045、5961和2748个差异表达基因上调,有4284、5665和3536个差异表达基因下调。GO富集分析发现差异基因主要富集到部分生物合成和代谢过程、光合作用、信号转导和节律相关条目中。KEGG富集分析显示差异基因主要富集到碳代谢、氨基酸的生物合成、植物-病原菌互作、植物激素信号转导、MAPK信号等通路中。3条抗病通路(植物-病原菌互作、MAPK信号和植物激素信号转导)中共同富集到53个差异基因,这些差异基因中包括1个MPK6、2个PR1、4个MKK4/5和46个BAK1。随机选取9个芍药响应细极链格孢侵染的差异表达基因进行qRT-PCR分析,基因表达规律与转录组测序结果一致,证实RNA-seq的准确性。AP2/ERF-ERF、WRKY、bHLH和MYB-related转录因子家族是芍药响应A.tenuissima侵染的关键转录因子家族。【结论】A.tenuissima侵染芍药后,芍药通过提高SOD、POD、CAT和PAL的活性提升抗氧化能力,清除病害胁迫所产生的大量活性氧,通过增加可溶性糖与可溶性蛋白的含量、降低脯氨酸的含量进行渗透调节保持细胞水分。BAK1、PR1、MKK4/5和MPK6在芍药响应A.tenuissima侵染过程中起到重要作用,推测PlERF20、PlERF1b、PlWRKY41、PlMYC4和PlMYB62是芍药响应A.tenuissima侵染的抗病相关转录因子。

以G418为筛选标记的极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)原生质体转化体系的建立

[目的]建立极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）的原生质体遗传转化体系。[方法]采用酶解法制备极细链格孢菌的原生质体，并通过PEG/CaCl2介导的化学方法将含有G418抗性标记的DNA转入极细链格孢菌原生质体。[结果]转化子生长表型及其基因组DNA的PCR检测表明抗性基因已成功整合到极细链格孢菌基因组中。该方法的转化率达3-4个转化子/μg转化DNA。所获得的转化子在无选择压力下连续培养3代，G418抗性仍能稳定遗传。[结论]成功建立了极细链格孢菌的遗传转化系统，为极细链格孢菌的基因功能研究奠定了基础。

除草活性菌株极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)发酵工艺研究

【目的】探索一株防治藜、冬葵等阔叶杂草的生防菌株极细链格孢(Alternaria tenuissima)HZ-1的发酵工艺.【方法】采用液固双相发酵方式,通过单因素和正交设计试验,对该菌株固态发酵基质、最适碳氮源和固-液发酵条件进行研究.【结果】HZ-1最佳产孢的固态基质为麦麸,最适碳源为麦麸(40 mg/g),最适氮源为蛋白胨(50 mg/g).正交优化试验得出该菌最适固-液发酵条件为:培养基初始含水量为300 mg/g,适宜的接种量为0.3 mL/g,初始pH值7.4,最适温度为24.3℃,发酵最适时间为216 h.【结论】研究结果可为该极细链格孢菌菌株除草活性物质的分离及工业化生产提供依据.

加工过程对小麦及其制品中细交链孢菌酮酸含量的影响

细交链孢菌酮酸(Tenuazonic Acid,TeA)是由链格孢霉(Alternaria species)产生的次级代谢产物,是链格孢霉毒素中的一种,主要污染果蔬、谷物、坚果及其制品.在众多的链格孢霉毒素中,TeA毒性最强,且在各类食品中检出率和检出浓度最高.在日常生活中,食用被TeA污染的果蔬和谷类食品可能会对消费者的健康造成威胁.目前,在全世界范围内,加工过程对谷物及其制品中细交链孢菌酮酸含量影响的研究比较少,本研究的目的是探索加工过程对小麦及其制品中细交链孢菌酮酸含量的影响.以天然TeA高污染的小麦为研究对象,将小麦加工制成面粉和麸皮,再将面粉进一步加工成面条、馒头和面包3种面制品,采用建立的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法分析小麦及其制品中TeA的含量.研究结果表明,TeA高污染的小麦经过磨粉后,其面粉中TeA含量比小麦籽粒中降低63.7%,说明磨粉可以降低小麦籽粒中可食用部分的TeA含量.在3种面制品(面条、馒头和面包)中,经过焙烤加工的面包中TeA含量下降的幅度(37.5%)大于面条(4.11%)和蒸制的馒头(3.92%),且TeA含量变化显著(P<0.05).本文研究了小麦及其面制品中TeA在加工过程中的含量变化,以期为谷类食品中TeA限量制定以及风险评估提供技术支撑.

细极链格孢菌蛋白激发子对棉株光合特性的影响

以湘杂棉3号F1为对象,用Li-6400光合作用测定仪测定了细极链格孢菌蛋白激发子(PEAT)诱导下的光合速率、气孔导度、蒸腾速率、外界光合作用有效辐射等指标.结果表明,PEAT诱导可以提高棉花生长功能叶的叶绿素含量、净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、外界光合作用有效辐射等,延缓叶片的衰老和光合功能衰退,延长了叶片的光合功能期,使光合速率维持在一个较高的水平.

一种促进植物根系生长的极细链格孢菌蛋白质分离、纯化和生物功能

通过硫酸铵沉淀、有机溶剂沉淀、离子交换和分子筛连用的方法,从极细链格孢菌JH505菌株中分离纯化到分子量约为35kD的植物激发子。利用固相梯度凝胶双向电泳方法测定了该蛋白的等电点为4.22。将该纯化蛋白稀释液浸泡小麦种子8h,7d后小麦根系琥珀酸脱氢酶活性提高65.27%,经蛋白处理的小麦根长比对照提高13.1%。

细极链格孢菌蛋白激发子诱导棉苗基因表达差减文库的构建及EST分析

利用细极链格孢菌蛋白激发子粗提蛋白液诱导棉花苗期相关基因表达，以清水喷施为对照样本，进行抑制差减杂交，构建棉花苗期基因表达文库。结果显示，插入片段的大小主要集中在200～1000bp。随机选取150个克隆进行菌液PCR检测与测序，并将所测序列与Gen-Bank dbEST库进行比对，共得到104个单一序列。其中，78个EST与其它物种已知基因部分区域的同源性为48．54％～100％，占总EST的75％；6条EST序列能在数据库中检索到同源性序列，但其功能尚不清楚，占5．77％；10个EST能在数据库中发现为推测蛋白，占9．6％；10个EST在GenBank中没有查到对应的同源序列，可能是新基因，占9．6％。同时，将所得到的104条EST序列在WEGO网站上进行功能分类，通过Gene ontology确定具体EST的分子功能。其中，在生物途径分类中，与生理途径和细胞过程相关的EST最多，分别为48个和45个；在细胞组份功能分类中，与细胞相关的EST最多，达到44个；在分子功能分类中，催化功能与分子绑定相关的EST数量最多，分别达到了30个和28个。由此可见，细极链格孢菌蛋白激发子诱导棉苗时涉及到植物的生理生化的多条途径，受到多个基因的调控，可能包括抗病与防御蛋白、信号传导蛋白、转录因子、能量代谢相关蛋白、抗逆相关蛋白、细胞保护机制蛋白、功能未知及其它蛋白等相关蛋白。

细极链格孢菌蛋白激发子对棉花生长相关酶活性的影响

细极链格孢菌蛋白激发子是一种能诱导植物获得系统抗病性的新型蛋白激发子。在湘杂棉3号的主要生育期,用细极链格孢菌蛋白激发子(PEAT)蛋白粗提液进行叶面喷施后,对棉花叶片中酶保护系统的变化进行了研究。结果表明,经细极链格孢菌蛋白激发子诱导后,棉花叶片POD、SOD、NR的活性与C/N比对照显著增加,而MDA含量比对照显著减少。这可能是PEAT影响棉花细胞内微环境的氧化、还原状态激发植株体内酶保护系统,激活植物自身防卫系统与生长系统,从而使棉花产生对病虫害的抗性,促进了植株生长。

细极链格孢菌Hog1 MAPK(酵母)同源基因AtHOG1的克隆与功能分析

为阐明高渗透压甘油激酶在链格孢菌中的功能,通过遗传学手段,构建了细极链格孢菌(Alternaria tenuissi-ma)cDNA酵母表达文库,并对其进行筛选而获得细极链格孢菌高渗透压甘油蛋白激酶AtHOG1基因,该基因全长1 539 bp,编码355个氨基酸。AtHog1p含有MAPK保守的激酶激活区域"TGY",与来源于烟曲霉(Aspergillus fumigatus)AfOsm1p(XP-752664)、稻瘟菌(M.grisea)MG01822(XP-363896)及酿酒酵母(S.cerevisiae)ScHog1p(AAB67558)高度同源,相似性分别为94%,90%和80%。在高渗环境下,AtHOG1基因与ScHOG1基因功能相同。链格孢菌中存在HOG通路信号途径,AtHOG1基因可能与链格孢菌的逆境适应性调节密切相关。

极细链格孢菌HZ-1对阔叶杂草的致病性及对作物的安全性评价

采用形态学结合分子鉴定的方法,对生防潜力菌株HZ-1进行分类学鉴定,通过菌株发酵液致病性测定,评价该菌株对5种阔叶杂草的除草活性,采用盆栽生测法评价其对青海省主栽作物的安全性。结果表明,HZ-1为极细链格孢菌(Alternaria tenuissima),菌株发酵液对猪秧秧(Galium aparine)、刺儿菜[Cephalanoplos setosum(Willd.)Kitam]、藜(Chenopodium album)、冬葵(Malva crispa)、酸模叶蓼(Polygonum lapathifolium L.)表现出不同程度的致病作用,尤其对猪秧秧、藜致病效果最为突出。安全性评价结果显示,该菌株除对春油菜有轻微影响外,对春小麦、蚕豆、豌豆和青稞4种作物相对安全。综上,HZ-1可作为防除猪殃殃、藜等阔叶杂草生物除草剂的候选菌株。

极细链格孢菌剂的初步研制及其除草作用研究

本研究选用一株具有除草活性的生防菌株极细链格孢Alternariatenuissima HZ-1作为研究对象,通过载体和助剂的筛选,初步研制出可湿性粉剂,并对杂草离体叶片、盆栽杂草及田间小区杂草的致病效果进行了测定。结果表明,HZ-1最适载体为高岭土,助剂为羧甲基纤维素、可溶性淀粉和白炭黑,菌株HZ-1可湿性粉剂对不同杂草离体叶片致病性表现为:密花香薷>冬葵>野燕麦>薄蒴草>酸模叶蓼>藜>萹蓄。盆栽致病性结果显示,HZ-1可湿性粉剂对薄蒴草、藜和密花香薷致病效果突出,对冬葵和酸模叶蓼次之,对萹蓄、野燕麦无效。小区试验显示对繁缕、藜和密花香薷有显著除草效果。该菌株可作为防除薄蒴草、藜、密花香薷和繁缕等杂草的生物除草剂进行进一步研究。

一种蛋白激发子产生菌细极链格孢菌的生物学特性研究

[目的]探讨蛋白激发子产生菌链格孢菌的基本生物学特性。[方法]研究不同温度、湿度、pH值、碳源及氮源对该菌菌丝生长及分生孢子萌发的影响。[结果]该菌菌丝生长最适温度28℃,最适pH值7~8 孢子萌发的最适温度28℃,最适相对湿度98%,最适pH值7~8。葡萄糖为最适碳源,最适氮源为蛋白胨,硫酸胺和氯化胺等会抑制菌丝生长。[结论]中温高湿环境利于链格孢菌的生长及孢子萌发,不同营养条件对该菌菌丝生长有显著影响。

海南粗榧内生真菌细极链格孢CH1307产高三尖杉酯碱的发酵条件

以海南粗榧内生真菌细极链格孢CH1307发酵产高三尖杉酯碱的产量为指标,采用响应曲面法分析葡萄糖质量浓度、硫酸镁质量浓度、复合维生素B质量浓度及摇床转速对该菌株液态发酵的影响。结果表明,细极链格孢CH1307液态发酵产高三尖杉酯碱的关键因子值分别为葡萄糖32.0226g·L-1,硫酸镁0.0966g·L-1,复合维生素B0.1239g·L-1,转速146.4742r·min-1时CH1307发酵最好,代入方程的HHRT产量为190.6370μg·L-1。

细极链格孢菌蛋白激发子对棉花种子萌发及幼苗生长的影响

探讨了激活蛋白对棉花种子萌发及幼苗生长的影响。结果表明,蛋白激发子处理棉种能促进棉种萌发,提高发芽率,尤以处理浓度3μg/mL,浸泡6h的处理效果最好。激活蛋白能明显促进根系发育,表现为根重增加、根长增长、茎增粗。

极细链格孢菌66kDa激活蛋白的纯化及诱导烟草抗TMV的功能

激活蛋白是一类来源于真菌、诱导植物获得系统抗性的蛋白激发子。通过加热离心、乙醇沉淀、离子交换层析、超滤等方法,从极细链格孢菌(Alternaria tenuissi ma)JH505菌株的菌丝体中分离纯化出一种激活蛋白,在SDS-PAGE银染图谱显示单一条带,表观分子量约为66 kDa,糖蛋白特异性染色确定其为糖蛋白。该蛋白可以诱导三生烟提高对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的抗性,处理后的三生烟叶片TMV枯斑数显著减少,枯斑抑制率可达到49%。

肉牛源细极链格孢菌的分离鉴定

为鉴定肉牛皮肤病病原及其致病性并筛选其敏感药物,本研究取患皮肤病肉牛病变部位皮屑、毛发和痂皮进行病原菌的分离,并对分离菌株进行了形态学鉴定、ITS序列分析、小鼠致病性试验和药敏试验。结果显示分离到1株形态特征与细极链格孢菌极其相似的菌株(PY2-1-2);经PCR扩增、测序和BLAST序列比对,结果显示分离株(PY2-1-2)的ITS基因序列与细极链格孢菌(MG975630.1)的ITS基因序列的相似性为99%,分离株PY2-1-2的ITS基因序列长度为543 bp,该片段包括ITS1、5.8S rDNA和ITS2的全部基因序列以及18S rDNA和28S rDNA的部分基因序列,提交GenBank(MH656780.1)。根据形态学结合ITS基因序列分析结果确定该分离株为细极链格孢菌。小鼠致病性试验结果显示该菌对小鼠有致病性。药敏试验结果显示:该菌对灰黄霉素、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑的最小抑菌浓度(MIC)值分别为0.5μg/mL、4μg/mL、1μg/mL、1μg/mL。本研究为今后进一步探究细极链格孢菌引起的皮肤病诊治提供科学有效的参考。

细极链格孢菌peaT2基因在毕赤酵母中的表达及蛋白功能确定

从细极链格孢菌表达文库获得阳性克隆子,序列分析表明,克隆的DNA片段中含有完整的开放阅读框架,将该基因命名为peaT2(GenBank登录号为EF212880)。用PCR法扩增peaT2基因的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/peaT2。重组质粒经SacⅠ线性化后用电穿孔法导入到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法筛选Mut+表型,获得了分泌表达的重组毕赤酵母。随机挑取一菌株作为表达菌,用甲醇诱导PeaT2蛋白表达。SDS-PAGE及Western blot检测结果均表明PeaT2在毕赤酵母中成功地分泌表达。用peaT2基因的表达蛋白处理小麦种子,生物测定表明,表达蛋白能明显促进小麦的生长,具有蛋白激发子作用。

芹菜叶斑病病原菌细极链格孢药剂筛选

【目的】研究筛选对芹菜叶斑病(病菌为:细极链格孢Alternaria tenuissima)具有良好防治作用的药剂。【方法】采用菌丝生长速率法和琼脂片法分别用14种杀菌剂对细极链格孢(A.tenuissima)菌丝和孢子萌发做室内毒力测定并进行田间药效试验。【结果】14种杀菌剂中对病原菌菌丝抑制效果最好的分别为3%甲霜恶霉灵、5%香芹酚、10%苯醚甲环唑、其EC_(50)分别为10.8、19.9、26.2μg/mL;对孢子萌发抑制效果最好的分别为3%甲霜恶霉灵、25%嘧菌酯、43%戊唑醇,其EC_(50)分别为15.7、29.5、38.7μg/mL。只有3%甲霜恶霉灵具有最佳的防治效果。防效最好的药剂为3%甲霜恶霉灵和5%香芹酚,其防效分别为96.3%和83.9%。【结论】3%甲霜恶霉灵最适用于田间芹菜叶斑病的防治。

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸的研究进展

链格孢霉(Alternara)是污染食品和饲料最普遍的真菌之一。细交链格孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)是链格孢霉毒素中最为重要的一种,可广泛污染蔬菜、水果及谷物。本文综述TeA毒素的来源及污染情况、理化险质及其毒性、检测方法等,并就未来研究方向进行展望。