细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及鉴定

目的:构建细粒棘球绦虫(E.g.)成虫全长cDNA质粒文库,并检测文库质量。方法:提取E.g.成虫mRNA,应用SMART方法构建pBluescript II SK全长cDNA质粒文库,检测文库的重组率及容量;用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增,检测插入片段大小。随机挑选阳性重组克隆5′端测序,归并unigene,计算unigene得率,全长性判定主要根据同源全长基因5'末端进行比较判定并计算全长率。结果:成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库。文库的重组率为95.04%,库容量1.13×106;平均插入片段长度约为1.2 kb。24个随机阳性克隆测序,unigene比例为69.57%,全长性比率为64.71%。结论:成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库,文库质量良好。

细粒棘球绦虫cDNA克隆EgA31在大肠埃希氏菌M15中的表达及重组蛋白的纯化和复性

为了获得细粒棘球绦虫 66ku抗原的重组蛋白和抗血清 ,用该抗原的cDNA克隆EgA3 1构建了pQE3 0EgA3 1重组质粒 ,在大肠埃希氏菌M15中表达 ,经亲和层析获得纯度较高的EgA3 1重组蛋白 ;用经复性处理的重组蛋白免疫动物 ,获得EgA3 1重组蛋白抗血清。本文就重组蛋白的稳定性和在复性处理中遇到的问题进行了讨论。

细粒棘球蚴全长cDNA文库的构建及初步鉴定

目的 分离目的基因构建cDNA文库的经典方法繁琐且不易得到全长cDNA(3’和 5’端 ,尤其是基因的 5’非翻译区 )。本研究通过构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,筛选全长目的基因 ,研究其结构和功能。方法 采用TRIZOL试剂提取E .granulosus总RNA ,用ClonTech公司的SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建E .granulosus原头节全长cDNA文库 ,文库的包装使用EICENTERTECHNOLOGIES公司提供的包装蛋白。结果与结论 成功构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,文库滴度为 1.4× 10 7pfu/ml。文库的重组效率达到 99%以上 ,插入片段长度约为 1.1kb。

粪抗原检测法诊断犬细粒棘球绦虫感染的研究 Ⅰ.用细粒棘球绦虫成虫虫体抗原—抗体系统检测粪抗原方法的建立

用细粒棘球绦虫成虫虫体抗原及其免疫家兔血清ＩｇＧ建立了用于检测家犬粪抗原诊断细粒棘球绦虫成虫感染的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ方法。对用离子交换层析、ＳＰＡ亲和层析、抗兔ＩｇＧ抗体亲和层析和细粒棘球绦虫成虫虫体抗原亲和层析等四种方法纯化的抗体进行了比较，以抗原亲和层析法纯化的抗体免疫活性最高，用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测抗原的终点在标本缓冲液中为２．５ｎｇ／ｍｌ，在健康家犬粪便悬液的上清中为５ｎｇ／ｍｌ。检测１１只人工感染细粒棘球绦虫成虫的家犬粪便标本，粪抗原阳性率达１００％。

新疆不同地区自然感染犬中细粒棘球绦虫成虫形态学观察

对新疆东部天山的伊吾、西部天山的特克斯、阿尔泰山的福海、南天山的阿图什和昆仑山的策勒共五个地区牧场中,从自然感染的家犬中获得的细粒棘球绦虫成虫标本,进行了形态学的研究,证明五个地区成虫标本在某些形态上有显著不同,描述了其形态特征。认为这些成虫标本可能代表不同的虫株。为虫株问题的研究提供了重要的线索。

青海高原不同源原头节感染犬后细粒棘球绦虫成虫的形态学观察

本文对青海高原藏羊、牦牛体内棘球蚴和原头节实验感染犬后获得的细粒棘球绦虫成虫进行了形态学观察和测量。结果表明二者在某些形态学上有显著差异,很可能是不同的虫株。牦牛-犬型细粒棘球绦虫的形态与世界各地报道过的虫株相比,有其独特之处,很可能是存在于我国的独立株系。

青海不同株细粒棘球绦虫成虫的超微结构研究

运用透射电镜和扫描电镜分别观察了青海高原牦牛和藏羊源原头蚴感染犬后细粒棘球绦虫成虫的超微结构。结果表明两源细粒棘球绦虫成虫的表面结构和皮层结构相似。颈部及幼节皮层显示典型的皮层细胞的合胞体带，表面显示短柱状微毛；成节皮层显示由外膜、纤维层、肌层和皮层细胞体区构成，合胞体带消失，表面散布有短柱状微毛和颗粒状突出。皮层内侧的实质细胞区含多种细胞。两源虫体实质细胞核、线粒体结构不完全相同。扫描电镜表明细粒棘球绦虫生殖孔边缘及外侧体表存在大量神经乳突，伸出的阳茎上有稀少的细长微毛。这些形态结构特点与文献报道明显不同，提示青海高原存在不同株的细粒棘球绦虫。

不同株细粒棘球绦虫成虫和幼虫的观测结果比较

本文将青海高原藏羊／犬和耗牛／犬两循环链型细粒棘球绦虫成虫和幼虫的形态特征与世界上报道的其它不同地理区域或不同宿主的细粒棘球绦虫虫株形态特征相比较，结果表明该两型细粒林球绦虫成虫和幼虫的顶突钩（大、小钩）较其它株的小，但大、小钩刃长占全虫长的比例则较其它株的大；睾丸数目多于其它株，形状和分布上各有特征；二者卵巢和子宫形状各不相同。从而揭示青海高原存在不同于世界上其它虫株的、且二者之间义有差别的藏羊株和托牛株。

新疆北部骆驼源细粒棘球绦虫成虫扫描电镜观察

从新疆北部地区感染囊型包虫病的骆驼肝、肺包囊中收取细粒棘球蚴原头节，实验感染家犬后，分别于第３５天和第４５天收集成虫进行扫描电镜观察。骆驼源细粒棘球绦虫成虫的外部形态特点：整个虫体表面被覆着微毛，与其他来源的成虫相比，其微毛相对浓密柔细，成熟体节的生殖孔有两种不同的形态：有雄茎伸出的生殖孔凹陷不明显，孔周区没有感觉乳头出现。在雄茎表面密布丝状微绒毛；没有雄茎伸出的生殖孔凹陷明显，孔周区有许多大小不等的感觉乳头，其形态特殊，可作为虫株鉴定的依据。成虫之间的异体交配可能是细粒棘球绦虫常见的生殖方式。

细粒棘球绦虫成虫表膜抗原特异性基因的筛选及克隆

为筛选细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,Eg）表膜抗原基因或具有诊断性的特异性基因,提取Eg成虫表膜抗原,经ELISA、Western blot对该抗原的免疫学特性进行初步研究。以Eg成虫表膜抗原高免鼠血清为探针,筛选Eg成虫cDNA文库,将阳性噬菌斑的PCR产物和pGEM-T载体连接,转染到DH5α,对得到的重组子进行测序,并进行同源性分析。ELISA检测显示,表膜抗原免疫鼠诱导产生了特异性抗体,Western blot鉴定该抗体能识别Eg成虫表膜抗原、原头蚴、Eg发育不成熟、Eg发育成熟抗原。筛选出6个阳性克隆,DNA片段大小在1~2kb之间。对阳性克隆进行同源性分析,结果与EgP-29mRNA同源性为99%,与Eg14-3-3蛋白mRNA同源性80%-99%。筛选Eg成虫cDNA文库所获得的基因,证明了Eg虫体表膜抗原的存在,有望成为犬细粒棘球绦虫的诊断抗原以及犬抗细粒棘球绦虫的候选基因。

细粒棘球绦虫原头蚴、包囊壁和成虫circRNA差异表达分析

旨在解析circRNA在细粒棘球绦虫原头蚴、包囊壁和成虫的表达谱特性,为进一步阐明circRNA分子在细粒棘球绦虫生长发育中的作用提供理论依据。采集细粒棘球绦虫的原头蚴、包囊壁和成虫,提取总RNA,构建circRNA、miRNA以及mRNA文库,采用全转录组测序方法进行测序分析。通过生物信息学分析和功能预测筛选出差异表达的circRNA,并进行GO、KEGG以及ceRNA调控网络分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对其进行验证。结果在细粒棘球绦虫原头蚴、包囊壁和成虫共鉴定得到636个circRNA分子,其中差异表达的circRNA分子有140个,在原头蚴、包囊壁和成虫特异性表达的circRNA分子分别为44、2和0个。GO分析结果显示,成虫和原头蚴以及包囊壁相比,差异表达的circRNA分子主要富集于生物学过程的有性生殖、精子发生、雄性配子产生、轴系发生以及神经生成、分化等。KEGG分析结果显示,原头蚴和成虫相比,差异表达的circRNA的显著富集于Notch、三羧酸循环、磷脂酰肌醇、核黄素代谢通路以及脂肪酸合成和降解等信号通路。原头蚴和包囊壁相比,差异表达的circRNA显著富集于背腹轴形成、Notch、wnt以及FoxO信号通路等。成虫和包囊壁相比,差异表达的circRNA的显著富集于Notch、碳代谢、三羧酸循环以及糖酵解/糖异生通路。靶向预测circRNA-miRNA-mRNA调控网络结果显示,有24个差异表达circRNAs与14个miRNAs和54个mRNAs形成164个up-down-up的circRNA-miRNA-mRNA调控网路,有13个差异表达的circRNAs与7个miRNAs以及16个mRNAs构成36个down-up-down的circRNA-miRNA-mRNA调控网络。对部分circRNA分子的qRT-PCR验证结果表明,其mRNA转录水平与测序结果一致。综上所述,本研究首次系统解析了circRNA分子在细粒棘球绦虫原头蚴、包囊壁和成虫的差异表达谱特性,筛选了在原头蚴、包囊壁和成虫各阶段高表达及特异表达的circRNA分子,预测了差异表达circRNA潜在的circRNA-miRNA-mRNA调控网络,为进一步研究circRNA分子在细粒棘球绦虫生长发育中的作用于调控机制奠定了基础。

细粒棘球绦虫表膜糖抗原HSP70基因的克隆、表达及免疫特性分析

【目的】克隆细粒棘球绦虫(Eg)表膜糖抗原的热休克蛋白70(HSP70)基因,构建原核表达载体,鉴定EgHSP70蛋白的免疫学特性。【方法】以Eg表膜糖抗原高免鼠血清为探针,从Eg成虫cDNA文库中筛选得到阳性克隆EgHSP70。构建EgHSP70基因的原核表达载体pET28a-EgHSP70,诱导表达重组蛋白,纯化,免疫鼠,ELISA、Western-blot和IFA法分别检测血清抗体效价、特异性及抗原在虫体组织中的位置。【结果】从Eg成虫cDNA文库中筛选获得特异性EgHSP70基因,酶切和测序结果均表明该基因已克隆到pET28a。EgHSP70融合蛋白在A600=0.6,0.4 mmol IPTG,37℃表达5 h为最佳表达。经His亲和层析法纯化获得了HSP70融合蛋白相对分子质量约为33 kDa。免疫小鼠可产生高滴度(最高1:640 000)特异性抗体。Westernblot分析结果表明,制备的抗血清与EgHSP70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、Eg虫体蛋白和Eg虫体表面蛋白均能特异性结合,其他带科绦虫有此蛋白表达IFA检测结果证实EgHSP70在细粒棘球绦虫成虫体表膜及体表内有表达。【结论】实验得到的EgHSP7O融合蛋白具有较好的免疫原性和抗原性,可用于研制包虫病疫苗及相关诊断试剂为包虫病的防控提供技术支持。

胰蛋白酶和胆汁对细粒棘球绦虫原头蚴外翻和成虫发育的影响

目的探讨胰蛋白酶和犬胆汁对细粒棘球绦虫原头蚴外翻和体外成虫培养发育的影响。方法无菌条件下采集羊源细粒棘球绦虫原头蚴,用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗,经胃蛋白酶处理后,用0.1%亚甲基蓝染色,检测虫体活率>98%的原头蚴用不同浓度的犬胆汁(0.005%～5%)和胰蛋白酶(0.01%～5%)及纯水刺激处理,在不同的培养条件及时间点采集样品,观察原头蚴的死亡率及头节外翻情况。结果当胆汁终浓度为0.02%时,培养48 h头节外翻率最高,可达62.7%;原头蚴可以耐受0.25%的胰蛋白酶,但其浓度为0.5%,原头蚴培养48 h时,死亡率为13.7%。研究发现,原头蚴培养的前3 d,其培养基中添加0.25%的胰蛋白酶和0.02%的犬胆汁,培养3 d后去除胰蛋白酶,仅在培养基中加入0.02%的犬胆汁原头蚴可以保持高的成虫发育率,达60%以上。原头蚴经两次在室温下30 s的刺激,原头蚴外翻率达到100%,但培养24 h后外翻的原头蚴回翻,外翻率与对照无差别(t=0.27,P=0.79)。结论犬胆汁对细粒棘球绦虫原头蚴的外翻和成虫的维持和发育是必须的。适量(0.25%)胰蛋白酶有利于已外翻原头蚴成虫性状发育。仅纯水刺激原头蚴,可以使原头蚴外翻,但不能提高后成虫的发育率。

用抗虫体表膜抗原抗体测定犬细粒棘球绦虫粪抗原

利用Echinococcus granulosus(Eg)成虫表膜抗原抗体夹心ELISA方法检测犬细粒棘球绦虫感染的粪抗原。首先提取E g成虫表膜抗原,制备抗E g成虫表膜抗原的血清,然后用间接ELISA和Western blotting方法检测其抗原抗体反应及免疫原性,用间接免疫组化方法对E g成虫表膜蛋白进行组织定位。利用双抗体夹心ELISA方法检测感染E g的犬粪抗原。ELISA结果表明E g成虫表膜抗原具有良好的抗原性并能产生高效价抗体,抗体不与多头绦虫和泡状带绦虫抗原反应;Western blotting结果表明E g成虫表膜抗原与原头蚴、不成熟E g有共同蛋白成分。免疫组化结果证实虫体表膜蛋白分布在虫体表皮。该抗原抗体系统能检测到感染后13d的犬细粒棘球绦虫。结果表明该E g成虫表膜抗原抗体系统可用于诊断犬细粒棘球绦虫感染。

细粒棘球绦虫成虫的单克隆抗体制备

为建立抗细粒棘球绦虫成虫的单克隆抗体细胞株 ,采用经口感染狗肠壁上寄生的成虫制备抗原免疫BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤sp2 / 0进行细胞融合。结果显示经筛选克隆后建立了一株分泌抗成虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,命名为 2G5E8F4E4。腹水的抗体效价为 1∶12 80 0。初步建立了分泌抗细粒棘球绦虫成虫的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

将细粒棘球绦虫成虫的形态学特征作为确定传播类型的一种方式

在澳大利亚大陆,细粒棘球绦虫(E.g)保持着2种传播循环,一种循环主要涉及家养绵羊作为主要中间宿主,而另一种主要牵涉到多种有袋类动物做为中问宿主。这2种循环问相互作用的态势通过种种肉食性终宿主,包括家犬、未驯养犬、澳洲野狗和赤狐。

细粒棘球绦虫免疫相关抗原基因的筛选及原核表达

为了筛选获得细粒棘球绦虫的免疫相关抗原基因,试验采用SEREX技术对细粒棘球绦虫cDNA文库进行相关抗原筛选,并对获得的细粒棘球绦虫特异性基因进行原核表达与鉴定。结果表明:共获得149个阳性噬菌斑,对其进行PCR扩增和序列分析得到与棘球绦虫属相关的基因序列10个,其中有864 bp的开放性阅读框序列;编码288个氨基酸;经NCBI BLAST氨基酸同源性分析,与多房棘球绦虫诊断抗原gp50的氨基酸序列的同源性为92%,是一个未知的新基因,命名为Ediag A864;经原核表达得到大小约为51 ku的重组蛋白,经Western-blot分析具有良好的反应原性。

细粒棘球蚴线粒体rRNA的序列测定

通过ＥＳＴ方法对细粒棘球蚴ｃＤＮＡ文库进行筛选，将得到的ＥＳＴ序列送入ＧｅｎＢａｎｋ和ＥＢＩ进行同源性分析及登陆，对有意义的ＥＳＴ进行通测，得到了完整的细胞线粒体ｒＲＮＡ序列，并进行了同源性比较及质粒转化。为细粒棘球蚴的系统分类、鉴定及进化研究提供了新的有用依据。