细粒棘球蚴抗原B8/2蛋白单抗的制备及夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种早期诊断动物细粒棘球蚴病的方法,诱导表达含PET-EgAgB8/2载体的原核表达菌,以表达纯化蛋白为抗原,制备单克隆抗体,并以制备的抗体建立检测细粒棘球蚴病夹心ELISA方法。结果显示,原核表达菌在37℃诱导培养,菌体上清中大量表达,经验证为目的蛋白,用纯化蛋白免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选得到9株具有良好特异性、稳定分泌单克隆抗体的细胞株,经两两配对,选择75C86/15作为包被抗体,27E57/32为酶标二抗,当包被抗体浓度为1.42μg/mL,4℃包被过夜、用含50 g/L脱脂奶粉的PBST封闭、抗原作1∶100稀释、酶标二抗1∶1000稀释、反应底物作用15 min时效果最佳,检测方法的特异性为98.8%,敏感性为95.3%。成功制备细粒棘球蚴抗原B8/2蛋白单克隆抗体并建立了ELISA检测方法。

细粒棘球蚴抗原B对1型糖尿病小鼠的保护作用

目的细粒棘球蚴感染存在自发性免疫调节现象,在人体内经历了从Th1向Th2的极化过程。文中探讨细粒棘球蚴抗原B对小鼠实验性自身免疫性1型糖尿病的保护作用及其机制。方法采用随机数字表法将30只雄BALB/c小鼠随机分为3组:肌内注射细粒棘球蚴抗原B+糖尿病成模组(实验组,n=10);肌注等渗盐水+糖尿病成模组(等渗盐水对照组,n=10);糖尿病成模组(阳性对照组,n=10);实验组、等渗盐水对照组、阳性对照组均给予小剂量链脲佐菌素(STZ)诱导1型糖尿病,动态观察血糖变化。至3周末留取小鼠血清后,取胰腺组织切片HE染色,进行胰岛功能评价,免疫组化染色,观察胰岛β细胞总量变化,用ELISA测定血清白介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-10水平,间接放射免法测定血清胰岛素。结果给药后,小鼠血糖逐渐升高,在第3天和成模后1周、2周、3周,等渗盐水对照组[(21.91±3.11)、(24.77±4.29)、(32.47±2.03)、(18.13±2.18)mmol/L]和阳性对照组[(22.63±3.55)、(22.89±5.69)、(29.37±3.37)、(29.57±5.37)mmol/L]血糖水平分别显著高于实验组[(16.19±4.58)、(18.82±2.15)、(21.66±1.63)、(20.76±2.29)mmol/L],差异有统计学意义(P<0.05);实验组胰岛可见淋巴细胞浸润不多,而等渗盐水对照组和阳性对照组胰岛可见较多淋巴细胞浸润;在模型建立3周后,实验组小鼠血清胰岛素水平[(35.10±3.86)mIU/L]高于等渗盐水对照组[(27.16±6.11)mIU/L]和阳性对照组[(25.13±4.16)mIU/L],差异有统计学意义(P<0.05),且实验组小鼠胰岛β细胞总量[(0.62±0.08)mg]高于等渗盐水对照组[(0.27±0.04)mg]和阳性对照组[(0.25±0.02)mg],差异有统计学意义(P<0.05);糖尿病模型建立3周末,实验组小鼠血清IL-10水平[(80.91±11.28)ng/mL]高于等渗盐水对照组[(32.70±6.57)ng/mL]和阳性对照组[(34.32±4.01)ng/mL],差异有统计学意义(P<0.05),实验组小鼠血清IL-2水平[(196.16±11.71)ng/mL]低于等渗盐水对照组[(267.30±69.28)ng/mL]和阳性对照组[(270.27±33.39)ng/mL],差异有统计学意义(P<0.05)。结论细粒棘球蚴抗原B对小鼠实验性1型糖尿病具有拮抗和保护作用,其机制可能与Th1/Th2免疫偏移有关。

细粒棘球蚴抗原B对NOD小鼠1型糖尿病的预防作用

目的探讨细粒棘球蚴抗原B(抗原B)对非肥胖糖尿病(NOD)小鼠1型糖尿病免疫机制的影响。方法将造模成功的20只NOD小鼠依据随机数字表法分为抗原B处理组和生理盐水处理组,各10只。记录并比较两组小鼠初始/成模后/用药后1、2、3周的体质量和血糖变化值。运用酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清中白细胞介素(IL)2/IL-10的水平;运用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测胰腺组织中两种细胞因子的表达量。结果在用药后3周各组小鼠之间体质量比较差异有统计学意义(P<0.05),生理盐水处理组体质量下降明显;生理盐水处理组血糖上升水平较抗原B处理组高(P<0.05)。酶联免疫吸附测定结果显示,抗原B处理组IL-2水平较生理盐水处理组低,血清IL-10水平高于生理盐水处理组(P<0.05)。荧光定量PCR结果:抗原B处理组IL-2 mRNA表达量较生理盐水处理组显著下调,IL-10显著上调(P<0.05)。结论细粒棘球蚴抗原B可以降低IL-2水平,升高IL-10水平,暂可认为使Th1/Th2细胞发生免疫偏移,向着有利于胰岛保护的方向,细粒棘球蚴抗原B可能有预防或治疗1型糖尿病的作用。

细粒棘球蚴重组抗原B诱导小鼠骨髓源树突状细胞表达吲哚胺2,3-双加氧酶的研究

目的观察细粒棘球蚴重组抗原B(rAgB)体外诱导小鼠骨髓源树突状细胞表达吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的情况。方法从小鼠股骨中分离出骨髓细胞,进行小鼠重组巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)的诱导,培养并获得CD11c+树突状细胞。应用倒置显微镜和扫描电镜观察树突状细胞形态,采用流式细胞术检测其表面标志物;用混合淋巴细胞反应(MLR)观察树突状细胞对T淋巴细胞的增殖能力。培养至第6天,收集未成熟树突状细胞进行流式细胞术检测;另向部分未成熟树突状细胞中加脂多糖(LPS)刺激24 h后,收集成熟树突状细胞,进行流式细胞术检测。在获得的未成熟树突状细胞中分别加入RPMI 1640完全培养液(为阴性对照组)、重组小鼠γ干扰素(rmIFN-γ,1 000 U/ml,为IFN-γ组)和rAgB(终浓度15μg/ml,为rAgB组),培养24 h后,通过细胞免疫组织化学和蛋白质印迹(Western blot-ting)检测各组树突状细胞IDO的表达情况。结果获得纯度为80%的CD11c+树突状细胞,在倒置显微镜和扫描电镜下均观察到典型树突状细胞。经LPS刺激的成熟树突状细胞的CD40、CD80和主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子I-A/I-E的阳性表达率与未成熟树突状细胞的相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。MLR结果显示,诱导形成的树突状细胞具有刺激T淋巴细胞增殖的能力。细胞免疫组织化学方法检测结果显示,阴性对照组、阳性对照组和rAgB组的IDO阳性表达率分别为(4.544±1.752)%、(20.464±4.452)%和(11.148±1.966)%,3组间的差异均有统计学意义(均P<0.05)。Western blotting结果表明,3组IDO蛋白与相应甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)蛋白的灰度值之比分别为(0.229±0.085)、(0.794±0.114)和(0.573±0.129),其中rAgB组与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),与IFN-γ组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论细粒棘球蚴重组抗原B在体外具有诱导树突状细胞表达吲哚胺2,3-双加氧酶的功能。

抗细粒棘球蚴B抗原人源单链可变区抗体临床诊断价值的初步研究

目的 评价人源单链可变区抗体(ScFv)诊断细粒棘球蚴病的临床价值。方法 用Western-blot检测ScFv识别的抗原表位,并检测该抗体与包虫病病人囊液、血清中循环抗原的结合,与其它肝占位疾病患者血清、正常人血清的交叉反应。结果 ScFv识别囊液抗原位点单一,特异性优于多克隆抗体,交叉反应低,但检测囊液及血清循环抗原的敏感性低于多克隆抗体。结论 对临床使用ScFv诊断进行了初步尝试,直接ELISA法检出率不高,应改进为双抗体夹心法或多种抗体铺底捕获法来检测循环抗原。

抗细粒棘球蚴人工重组B抗原人源单链可变区抗体的筛选与在原核系统中的表达

目的 筛选并表达抗细粒棘球蚴人工重组 B抗原 (r- Ag B)的人源单链可变区抗体 (Sc Fv) ,为细粒棘球蚴 B抗原蛋白质功能的研究及包虫病的基因治疗开辟新途径。 方法 采用噬菌体表面展示技术 ,以重组纯化的细粒棘球蚴 B抗原为固相抗原 ,经过 5轮“吸附 -洗脱 -扩增”的筛选过程 ,从半合成的噬菌体抗体库中获得了抗原结合活性和特异性较强的含抗 r- Ag B的 Sc Fv基因片段的阳性克隆 ,提取质粒 ,经 Sfi /Not 酶切鉴定后 ,亚克隆到 p CANTAB5 E载体上 ,转化大肠杆菌 XL1 - Blue,经 IPTG诱导 ,表达可溶性 Sc Fv。 结果 筛选得到的 Sc Fv片段基因为 76 8bp,经 SDS- PAGE鉴定 ,在大肠杆菌 XL1 - Blue中表达的 Sc Fv分子质量约 2 8ku,经过 EL ISA和 Western- Blot检测 ,该单链抗体具有较强的抗原结合特性和特异性。 结论 细粒棘球蚴重组 B抗原人源单链可变区抗体筛选和表达成功 。

棘球蚴抗原B对小鼠1型糖尿病拮抗作用研究

目的:探讨细粒棘球蚴抗原B对小鼠1型糖尿病的拮抗作用及其机制。方法:30只雄BALB/c小鼠随机分为三组:肌内注射细粒棘球蚴抗原B加糖尿病成模组(A组,10只);肌内注射生理盐水加糖尿病成模组(B组,10只);对照组(C组,10只)。A组给予细粒棘球蚴抗原B,B组给予相同剂量的生理盐水,均为连续5 d,随后A组、B组均给予小剂量链脲佐菌素诱导1型糖尿病,C组未予任何处理。动态观察血糖变化,至3周末剖杀小鼠,留取血清,取胰腺组织切片HE染色,进行胰岛炎评分,用ELISA测定血清白介素-2(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)水平。结果:给药后,小鼠血糖逐渐升高,分别在第3天、成模后1周、成模后2周及成模后3周,B组血糖水平分别显著高于A组和C组(P<0.05);A组胰岛可见淋巴细胞浸润不多,而B组胰岛可见较多淋巴细胞浸润;糖尿病模型建立3周末,A组小鼠血清IL-4水平高于B组和C组,差异有统计学意义(P<0.05),A组小鼠血清IFN-γ水平低于B组(P<0.05)。结论:细粒棘球蚴抗原B对小鼠实验性1型糖尿病具有拮抗和保护作用,其机制可能与Th1/Th2免疫偏移有关。