细粒棘球蚴egG1Y162疫苗对小鼠免疫应答的研究

目的观察细粒棘球蚴egG1Y162疫苗免疫小鼠后机体的免疫应答状况。方法实验组、GST对照组、佐剂组和正常组小鼠分别注射egG1Y162疫苗、谷胱甘肽巯基转移酶(GSTs)、佐剂(FCA)和生理盐水(NS),在免疫第0、2、4、6、8和10周,收集各组血清用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测抗体滴度,并检测各组血清抗体IgG的动态变化。第10周用四甲基偶氮唑蓝实验(MTT法)检测免疫小鼠脾淋巴细胞体外刺激后的增殖反应,用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)双染色法检测脾细胞凋亡率。结果 egG1Y162疫苗免疫组小鼠在第2周免疫后检测到抗体,在免疫第10周,抗体滴度可达到1∶25 600。血清抗体IgG在免疫第2～10周不断升高,并在免疫第10周达到最高水平。MTT法显示egG1Y162疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞在体外能被egG1Y162疫苗特异性刺激增生。疫苗刺激后疫苗组增殖水平显著高于对照组、佐剂组和正常组(P<0.05)。AnnexinV-FITC和PI双染色法结果显示实验组小鼠脾细胞原液和ConA刺激细胞凋亡发生率均显著低于对照组(P<0.01),每组ConA刺激脾细胞凋亡发生率显著高于相应的原液培养(P<0.01)。结论细粒棘球绦虫egG1Y162疫苗可诱导小鼠产生高效价抗体并可刺激脾淋巴细胞增殖活化、抑制脾细胞凋亡,特异性抗体反应和脾淋巴细胞增殖活化促进机体产生体液免疫反应和细胞免疫反应,共同协调诱导机体产生免疫应答反应。

细粒棘球蚴egG1Y162抗原基因的克隆及蛋白质序列分析

目的克隆细粒棘球蚴egG1Y162基因序列并进行蛋白序列对比分析。方法从细粒棘球蚴原头蚴提取mRNA,mRNA反转录为cDNA。设计特异引物,以cDNA为模板扩增egG1Y162基因,构建PUCm-T/egG1Y162重组质粒,经PCR、酶切及测序鉴定后进行序列分析。结果egG1Y162 cDNA为459bp,编码153个氨基酸;同源性比较表明,egG1Y162 cDNA与emY162同源性为95%,与eg95的同源性为30.61%。结论成功克隆egG1Y162抗原基因,egG1Y162蛋白质氨基酸序列与emY162有很高的相似性,但同其他抗原蛋白质序列存在明显差异,所以egG1Y162是一种新的抗原基因。

融合蛋白接头linker在细粒棘球蚴重组疫苗EgG1Y162-2(4)中的选择设计

目的:分析蛋白EgG1Y162-2通过不同长度接头序列连接后形成的肽段四聚体蛋白EgG1Y162-2(4)的氨基酸序列特征,明确其理化性质及三级结构,预测并对比经不同长度柔性接头连接后其优势抗原表位变化,为增强重组疫苗免疫原性选取最理想的linker序列。方法:利用生物信息学方法选择GSGGSG、GGGGSGGG和GSGGSGGGSGGSGGG 3种linker序列进行连接设计EgG1Y162-2(4)重组蛋白疫苗。在线软件ProtParam分析其理化性质;SOPMA在线数据库对设计有不同linker序列的重组蛋白二级结构进行预测分析;I-TASSER在线软件预测所设计重组疫苗的三级结构,并使用SYFPEITHI、IEDB等软件对其T/B细胞抗原表位进行预测。结果:经预测通过GSGGSG、GGGGSGGG、GSGGSGGGSGGSGGG 3种linker序列连接的EgG1Y162-2(4)均是稳定蛋白且具有亲水性并得到其二级结构特点。设计的重组疫苗EgG1Y162-2(4)通过生物信息学方法预测得知通过GSGGSG连接的EgG1Y162-2(4)中α螺旋占8.50%,β-转角占16.67%,无规则卷曲约占40.48%,延伸链约占34.35%,该蛋白有8个T/B联合表位,前后串联的EgG1Y162-2蛋白不仅能够正常折叠,且与EgG1Y162-2蛋白相比T/B抗原表位未发生偏移。三级结构显示通过linker序列GSGGSG串联的4个蛋白EgG1Y162-2均能正常表达,而通过GGGGSGGG、GSGGSGGGSGGSGGG串联的蛋白EgG1Y162-2(4)表位发生了一定程度右移。结论:利用GSGGSG 6个氨基酸连接EgG1Y162-2蛋白构成的EgG1Y162-2(4)的T/B联合表位高度重合,表位未发生迁移说明蛋白EgG1Y162-2(4)通过这种方式连接后几乎未对EgG1Y162-2蛋白优势表位造成影响,并通过重复蛋白表位数增强疫苗免疫应答效果,制备有效的棘球蚴病表位疫苗。

重组BCG-EgG1Y162蛋白免疫小鼠对细粒棘球蚴感染中Tim-3因子表达的影响

目的探讨重组BCG-EgG1Y162蛋白免疫小鼠后,感染包虫病的小鼠免疫细胞Tim-3因子的动态改变和表达。方法采用实验小鼠30只,随机分为2组,实验组用BCG-EgG1Y162疫苗免疫小鼠,对照组注射生理盐水,各免疫1次。免疫第10周后,用细粒棘球蚴进行小鼠腹腔内注射,在免疫后的第24周采血,用实时荧光定量PCR法分别检测15例正常对照组小鼠和15例实验组小鼠外周血中Tim-3、Galectin-9的表达,同时用酶联免疫吸附(ELISA)法检测2组血清中可溶性Tim-3、Galectin-9及IFN-γ、IL-12和IL-4的水平。流式细胞仪检测小鼠脾细胞悬液中Tim-3、CD4^+T、CD8^+T、CD4^+T/CD8^+T细胞的表达。结果经实时荧光定量PCR检测结果显示:正常对照组的小鼠在感染包虫后体内的Tim-3和Galectin-9mRNA水平显著升高,实验组小鼠在经过BCG-EgG1Y162疫苗免疫后,体内的Tim-3和Galectin-9水平显著降低与正常对照组相比差异有统计学意义(P <0.05)。ELISA实验检测显示:实验组小鼠血清中存在的可溶性Tim-3和Galectin-9水平,与正常对照组相比,水平显著降低;流式细胞仪检测也发现免疫组存在Tim-3降低。结论小鼠在经过BCG-EgG1Y162疫苗免疫后,在细粒棘球蚴持续性感染中能够明显纠正Tim-3、Galectin-9的高表达,进一步影响Th1/Th2的相关转录因子T-bet/GATA-3和细胞因子IFN-γ、IL-12和IL-4的水平的改变,从而纠正Th1/Th2免疫细胞失衡的现象,抑制感染的进一步发展。

细粒棘球蚴重组抗原蛋白BCG-egG1Y162免疫原性的初步研究

目的初步研究细粒棘球蚴重组抗原蛋白BCG-egG1Y162的免疫原性。方法选取60只小鼠分别分为3组实验组、重组卡介苗组和正常组小鼠分别注射重组抗原蛋白BCG-egG1Y162、重组卡介苗(BCG)和生理盐水(NS)。在免疫的第0、2、4、6、8周收集各组小鼠的血清,通过酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清中抗体IgG的动态变化水平。在第8周随机处死各组一半数量的小鼠提取脾淋巴细胞,分别通过四甲基偶氮咗蓝实验(MTT法)以及ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞体外增殖反应和细胞上清中IFN-γ、IL-4的水平变化。在免疫后第8周用活棘球蚴原头蚴感染各组存活的小鼠,感染后第24周处死各组小鼠,检测血清中IgG水平、包囊个数及其直径。结果 (1)免疫后的第2～8周,BCG-egG1Y162免疫组小鼠血清中IgG持续升高,与正常组和BCG组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。BCG组和正常组的IgG水平之间的差异不具有统计学意义(P>0.05)。(2)BCG-egG1Y162免疫组小鼠的脾淋巴细胞在体外能被BCG-egG1Y162特异性的刺激增生,增殖水平显著高于BCG组和正常组(P<0.05),其上清中IFN-γ、IL-4的水平以及IFN-γ/IL-4的比值同样显著高于正常组和BCG组(P<0.05)。这些指标在BCG组和正常组之间的差异不具有统计学意义(P>0.05)。(3)在各组小鼠感染活棘球蚴原头蚴后的第24周,BCG-egG1Y162免疫组具有87.3%的免疫保护力,并且血清中的IgG水平显著高于BCG组和正常组(P<0.05)。结论细粒棘球蚴重组抗原蛋白BCG-egG1Y162免疫小鼠后可上调小鼠血清中抗体IgG的水平,刺激脾淋巴细胞增殖活化,特异性地增强脾淋巴细胞的Th1免疫反应和机体抵抗细粒棘球蚴感染的能力,说明BCG-egG1Y162是具有研究价值的细粒棘球蚴病候选疫苗分子。

细粒棘球绦虫egG1Y162抗原基因的克隆及序列分析

根据多房棘球绦虫emY162基因序列设计引物,利用PCR以细粒棘球绦虫原头蚴和成虫的基因组DNA和cDNA为模板扩增egG1Y162基因,构建PUCm-T/egG1Y162和PUCm-T/egG1Y162cDNA重组质粒,经PCR、酶切及测序后,进行序列分析。细粒棘球绦虫2个不同发育阶段均克隆出egG1Y162基因,从基因组DNA和cDNA克隆得到的片段长度分别为1680bp和459bp,登录号分别为AB458258和AB458259。

细粒棘球绦虫重组BCG-EgG1Y162菌株的构建和表达

目的构建和表达细粒棘球绦虫重组卡介苗(BCG)菌株rBCG-EgG1Y162。方法通过基因工程技术将细粒棘球绦虫抗原EgG1Y162的编码基因与大肠埃希菌(E.coli)-分枝杆菌穿梭表达质粒载体pMV361重组,并转化E.coli后进行扩增。重组质粒pMV-EgG1Y162经PCR和双酶切鉴定后,进行测序。将鉴定正确的rpMV-EgG1Y162通过电穿孔技术转化至感受态BCG菌株中,构建rBCG-EgG1Y162。经PCR和双酶切鉴定正确后,扩增培养2周,并于45℃放置30 min,诱导目的蛋白表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达情况,并以兔抗原核表达重组蛋白EgG1Y162血清为一抗进行蛋白质印迹(Western blotting)分析。结果重组质粒rpMV-EgG1Y162经PCR扩增和双酶切后,均获得约360 bp的EgG1Y162目的基因片段,与预期片段长度一致,测序结果表明插入序列正确。将其通过电穿孔转化BCG菌株后,rBCG-EgG1Y162生长良好,经酶切和PCR鉴定正确。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的表达产物的相对分子质量(Mr)约为71 000。结论构建和表达了细粒棘球绦虫rBCG-EgG1Y162菌株。

细粒棘球绦虫EgG1Y162-1/2重组蛋白诱导小鼠免疫应答特点的比较

目的研究和对比经生物信息学分析后重组构建的EgG1Y162-1/2蛋白诱导小鼠产生免疫应答反应的特点。方法随机将60只小鼠分5组,根据所注射抗原的不同分为EgG1Y162-1组、EgG1Y162-2组、GST对照组、佐剂组和正常对照组。每2周免疫1次,共免疫4次。采集免疫前后的小鼠血清进行Elisa检测抗体效价;流式细胞术检测不同时间点淋巴细胞亚群(CD4^+T细胞和CD8^+T细胞)的动态变化;免疫10周后用细粒棘球蚴感染攻击小鼠,对比小鼠脾淋巴细胞体外刺激后的增殖反应、脾细胞凋亡率和小鼠囊重抑制率的检测结果。结果免疫后第10周,EgG1Y162-2组抗体滴度为1∶20 480高于EgG1Y162-1组抗体滴度1∶5 120。经原头蚴感染攻击的EgG1Y162-2组的淋巴细胞亚群(CD4^+T细胞、CD8^+T细胞)百分比均高于EgG1Y162-1组,且差异有统计学意义(P <0.05),但CD4^+T/CD8^+T细胞比值差异无统计学意义(P>0.05)。免疫后的EgG1Y162-2组小鼠脾淋巴细胞在体外被特异性刺激后增殖水平高于EgG1Y162-1组,差异有统计学意义(P <0.05)。检测显示EgG1Y162-2组的脾细胞凋亡率低于EgG1Y162-1,差异有统计学意义(P <0.05)。疫苗保护实验中发现EgG1Y162-1组的小鼠囊重抑制率比EgG1Y162-2组低,差异有统计学意义(P <0.05)。结论EgG1Y162-2抗原比EgG1Y162-1抗原具有更强的免疫优势作用,本研究不仅证明了生物信息学分析表位的准确性,也提示该表位信息丰富的抗原值得作为疫苗的保护性抗原进行深入研究。

细粒棘球绦虫蛋白egG1y162-1、egG1y162-2的抗原表位比较

目的分析蛋白egG1y162-1、egG1y162-2的氨基酸序列,了解其理化性质及二级结构特点,预测比较其抗原表位,为包虫病的免疫学诊断及表位疫苗的研制提供理论依据。方法采用生物信息学技术,利用在线软件ProtParam分析egG1y162-1和egG1y162-2的理化性质,使用DNAstar软件的protean等程序分析egG1y162-1和egG1y162-2蛋白的二级结构特点,运用在线软件IEDB等对egG1y162-1和egG1y162-2蛋白各参数进行综合分析并预测其抗原表位。结果综合分析各参数预测egG1y162-1的优势B细胞表位为9～28位氨基酸残基(LTKELKTTLPEHFRWIHVGS),egG1y162-1上29～36位氨基酸残基(RSLELGWN)区域可能存在人鼠共同T细胞抗原表位;egG1y162-2的优势B细胞表位为25～39位氨基酸残基(EGLKPSTFYEVVVQAFKGGS)、41～60位氨基酸残基(KGGSQVFKYTGFIRTLAPGE),egG1y162-2上26～41位氨基酸残基(GLKPSTFYEVVVQAFK)区域可能存在人鼠共同T细胞抗原表位。结论通过对细粒棘球绦虫蛋白egG1y162-1、egG1y162-2进行抗原表位分析,发现二者均存在评分较高的优势T表位和B表位,且存在人鼠共同T表位,而egG1y162-2的各方面指标要优于egG1y162-1,这对包虫病的诊断和疫苗研究有重要意义。

细粒棘球绦虫多价EgA31-EgG1Y162抗原序列优化分析

目的:将优化的EgA31-EgG1Y162抗原基因构建于pET30a上,诱导蛋白表达,SDS-PAGE鉴定蛋白表达效果,用生物信息学软件分析优化的EgA31-EgG1Y162抗原序列,为构建高效的疫苗奠定理论基础。方法:运用ProtParam,DNAstar,E.coli Codon Usage Analyzer等多种生物信息学软件分析优化后EgA31-EgG1Y162蛋白的理化性质,比较其优化前后序列的异同点及抗原表位分布情况等。结果:EgA31-EgG1Y162蛋白属于不稳定性蛋白且亲水性蛋白,通过网上在线软件分析,优化序列的密码子中不含利用率低的密码子。表位预测分析确定6个T细胞表位的氨基酸区域1~15、86~97、177~193、359~388、305~319、344~358和7个B细胞表位为102~112、172~204、318~334、343~353、394~409、415~431、443~458。结论:多价EgA31-EgG1y162融合抗原蛋白的优化序列中不含利用率低的密码子,且T和B细胞表位未受影响,为重组蛋白体外的有效表达奠定实验基础,对包虫病的多价表位疫苗研究具有重要的指导作用。

基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗EgG1Y162-2(4)的制备及鉴定

目的对细粒棘球蚴病重组多表位疫苗Eg G1Y162-2(4)进行原核表达并初步鉴定。方法利用免疫信息学方法对基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗Eg G1Y162-2(4)进行三维结构建模,分析其结构变化并评估该疫苗抗原性。通过Eco R I和SalⅠ双酶切构建p ET30a-EgG1Y162-2(4)重组质粒,将重组质粒转化入感受态细胞,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导蛋白表达,Western blotting鉴定原核表达蛋白产物,并应用细粒棘球蚴病患者及健康人血清分析重组蛋白抗原性。结果构建的重组疫苗EgG1Y162-2(4)三维结构串联的4个Eg G1Y162-2蛋白均能独立、有效表达且具有良好抗原性。重组质粒pET30a-EgG1Y162-2(4)在0.2 mmol/L IPTG37℃诱导4 h条件下,上清中目的蛋白表达量最高,使用60 mmol/L咪唑洗脱的蛋白成分较纯。Western blotting分析发现,重组多表位蛋白HIS-EgG1Y162-2(4)在约39 k Da位置处出现条带,且该蛋白可被细粒棘球蚴病患者血清识别。结论成功构建了细粒棘球蚴重组疫苗EgG1Y162-2(4),为研究细粒棘球蚴病重组多表位疫苗奠定了基础。

细粒棘球蚴重组蛋白EgG1Y162-2诱导表达条件的优化及其蛋白结构预测

目的优化探索重组质粒pET30a-EgG1Y162-2蛋白表达条件并预测其蛋白结构模型。方法将构建的重组质粒pET30a-EgG1Y162-2转化至E.coli BL21(DE3)菌株中,用不同浓度的IPTG进行不同时间段的蛋白诱导表达,诱导后的菌液超声破碎、离心,分别取上清和沉淀用SDS-PAGE分析重组蛋白EgG1Y162-2的表达情况,Western blot鉴定表达蛋白的反应原性。采用在线SWISS MODEL预测EgG1Y162-2蛋白的三维结构。结果EgG1Y162-2蛋白在37℃,IPTG终浓度为0.5 mmol/L,诱导4 h条件下的表达量较高,蛋白相对分子质量约为15×10~3,与预期相符,且能被鼠抗His-Tag抗体识别。在线Swiss-model预测EgG1Y162-2-2蛋白3D结构模型,与4Ixo.1.A结构的相似度为37.71%。结论优化的重组蛋白EgG1Y162-2表达最优条件预测的该蛋白三维结构,为细粒棘球蚴疫苗EgG1Y162-2抗原的功能研究奠定了基础。

细粒棘球蚴重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2诱导表达条件探索

目的探索细粒棘球蚴重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2的最佳诱导表达条件,并对其蛋白结构进行预测。方法构建p ET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2重组质粒,将其转化至Ecoli.BL21(DE3)细菌中,选择不同的时间段和温度,用不同浓度的IPTG进行诱导蛋白表达。将得到的菌液通过超声破碎,经离心后用SDS-PAGE分别分析上清和沉淀中重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2的表达情况。Western Blot鉴定重组蛋白表达。鉴定成功后进行大量诱导表达。采用生物信息学的方法,使用在线软件SWISS MODEL对HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白三维结构进行预测。结果HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2重组蛋白在28℃条件下,诱导4 h,IPTG的浓度为0.2 mmol/L时可溶性蛋白表达量达到最大。蛋白的相对分子量约为29 kD,结果与预期相符。其蛋白三维结构的预测与2×44.1.A结构的相似程度为78.13%。结论探索出HIS-4IgV-EgG1Y162-2重组蛋白最佳诱导表达条件,并成功预测出其蛋白的三维结构模型,为细粒棘球蚴重组疫苗的进一步研究创造条件。

细粒棘球蚴EgG1Y162-2与CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白结构预测及表位分析比较

目的采用生物信息学的方法,应用相关软件对EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的氨基酸序列进行分析,了解其理化性质及结构特点,预测并比较其抗原表位,为CTLA-4IgV-EgG1Y62-2蛋白作为包虫病表位疫苗的研究奠定基础。方法利用ProtParam在线软件分析EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的理化性质;运用DNAstar中的protean软件与在线SOPMA软件预测EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的二级结构;应用I-TASSER在线软件预测并比较EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的三级结构,并使用BepiPred1.0,IEDB等软件对其T/B细胞抗原表位进行预测与分析。结果预测EgG1Y162-2蛋白由69个氨基酸组成,为稳定蛋白,具有亲水性。二级结构中的α螺旋、β-折叠、β-转角与无规则卷曲分别占7.69%、30.77%、15.38%和46.15%。预测的3条T细胞优势表位分别是1-18、21-43和47-62位氨基酸,2条B细胞优势抗原表位分别是9-28与57-69位氨基酸;CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白由208个氨基酸组成,稳定蛋白,具有亲水性。二级结构中的α螺旋、β-折叠、β-转角与无规则卷曲分别占13.46%、32.21%、7.69%和46.63%。预测的3条优势T细胞表位分别是143-154、165-177和183-199位氨基酸。2条B细胞优势抗原表位分别为151-167和197-205位氨基酸。结论EgG1Y162-2和CTLA-4IgVEgG1Y162-2蛋白均存在优势T抗原表位与B抗原表位,且T/B联合表位存在高度重合。说明CTLA-4IgV与EgG1Y162-2蛋白通过Linker序列连接后几乎未对EgG1Y162-2蛋白的优势表位产生影响。因此,将CTLA-4IgV基因与特异性抗原EgG1Y162-2基因进行融合表达可能会增强疫苗的免疫效果,这对囊型包虫病多价复合疫苗的研究具有重大意义。

细粒棘球蚴EgG1Y162-2基因的克隆、蛋白表达及纯化鉴定

目的构建细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒,诱导表达EgG1Y162-2重组蛋白,为研制细粒棘球蚴疫苗提供研究基础。方法以细粒棘球蚴cDNA为模板,利用PCR法合成EgG1Y162-2目的基因,经限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后连接到原核表达载体pET30a中,构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒;将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达大量蛋白,采用亲和层析方法纯化重组蛋白;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白纯化水平,蛋白免疫印迹(Western blot)法鉴定表达产物。结果成功构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒,诱导表达后菌体上清液和洗脱液均在相对分子质量约15×10^(3)处出现EgG1Y162-2蛋白目的条带,且200 mmol/L咪唑洗脱的蛋白抗原成分较纯。Western blot结果显示,纯化后带有His标签的EgG1Y162-2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别。结论成功构建了细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒,诱导表达了EgG1Y162-2重组蛋白,为进一步开展抗细粒棘球蚴疫苗的研究奠定基础。

细粒棘球蚴重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162的诱导表达及3D结构预测

目的探索重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162最佳的表达条件,大量诱导及鉴定蛋白质,并预测重组蛋白质的三维结构模型。方法将原核重组质粒pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162转化至E.coli.BL21(DE)菌株中,在不同条件下诱导重组蛋白进行表达,SDS-PAGE分析上清及沉淀中重组蛋白表达并用Western blot鉴定。I-TASSER在线预测重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162的三维结构。结果可溶性重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162在异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)(终浓度0.2 mmol/L),28℃4 h诱导条件下表达量较高;包涵体中的重组蛋白在IPTG(终浓度0.8 mmol/L),28℃2 h并37℃2 h诱导条件下表达量最高。Western blot鉴定该蛋白的相对分子量约为32×10^(3),与预期相符。利用I-TASSER在线预测重组蛋白质HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162的3D结构模型,结果显示相邻的蛋白CTLA-4IgV与蛋白EgG1Y162能抵抗空间位阻的影响进行正常折叠。结论探索出重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162的最佳诱导表达条件并对重组蛋白成功鉴定,根据预测的重组蛋白3D结构验证选用linker序列"GTDDDDKAMADIGSEF"能使其前后相邻的两个蛋白独立正常折叠,为进一步深入研究细粒棘球蚴重组疫苗创造了条件。

重组蛋白EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162的原核表达、纯化及鉴定

目的利用pET30a-EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162重组质粒,诱导表达、纯化获得EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162目的蛋白,并对其进行鉴定,为后续研究提供前提条件。方法利用双酶切的方法验证pET30a-EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162质粒,并将其转化至E.coli BL21(DE3)菌株,获得表达菌株。采用不同浓度的IPTG在不同诱导时间及温度下诱导表达重组蛋白,菌液超声破碎后,经SDS-PAGE检测上清及沉淀中蛋白的表达。通过镍柱亲和层析法纯化蛋白并进行Western blot鉴定。结果成功鉴定重组质粒pET30a-EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162;重组蛋白EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162在IPTG终浓度为0.5 mmol/L,28℃条件下诱导6 h,上清中的蛋白表达量最高;300 mmol/L咪唑时洗脱得到的目的蛋白较多,洗脱效果较好;Western blot检测重组蛋白EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162能被相应抗体识别,反应条带在35 ku处,与预期相符。结论成功构建pET30a-EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162重组质粒,表达出相应重组蛋白,为细粒棘球病重组疫苗的研究创造条件。

pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒的构建及表达产物的纯化与鉴定

目的 构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)原核表达质粒,诱导表达后纯化,获得重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4),并对其免疫学特性进行初步鉴定,对其空间结构进行预测。方法 利用DNA重组技术构建重组质粒pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4),将测序正确的质粒转化至E.coli BL21(DE)菌株中,分别采用不同浓度的IPTG在不同诱导时间及温度下诱导表达重组蛋白。取菌液超声破碎,SDS-PAGE分析上清及沉淀中蛋白的表达;通过镍柱亲和层析法纯化蛋白并进行Western blot鉴定。通过生物信息学技术,利用SOPMA、I-TASSER在线数据库预测重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)的空间结构。结果 成功构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒,转化至E.coli BL21(DE)后诱导表达相对分子质量为53×10^(3)的重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)。SDS-PAGE分析CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组蛋白在IPTG浓度为0.7 mmol/L,37℃、4 h条件下上清中表达量较高。镍柱层析纯化用20 mmol/L咪唑浓度洗脱的蛋白浓度及纯度较高。Western blot检测重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)能被相应抗体识别,反应条带位于53×10^(3)处,与预期相符。生物信息学在线软件分析CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)中各蛋白均能正常折叠,未对优势表位产生影响。结论 利用原核表达成功获得CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组蛋白,并预测出该蛋白的三维结构模型,为细粒棘球蚴重组疫苗的研制提供了重要的实验依据。