复方葛根汤诱导结肠癌HCT116细胞铁死亡分子机制研究

为探究复方葛根汤对结肠癌HCT116细胞增长作用及其分子机制,通过MTT法检测、克隆形成、形态学分析探讨复方葛根汤对HCT116细胞增长作用,以活性氧试剂盒检测、荧光显微成像及蛋白免疫印迹法探究其分子机制。研究结果显示,与溶媒对照组相比,复方葛根汤能显著抑制HCT116细胞增长能力,并呈浓度和时间依赖性,机制上能显著增加细胞内活性氧,显著上调铁死亡相关蛋白PTGS2、ACSL4蛋白的表达,及明显下调铁死亡相关蛋白GPX4表达,表明复方葛根汤可能通过诱导铁死亡机制抑制HCT116细胞增长。

siRNA干扰沉默Slug基因表达抑制结肠癌细胞HCT116生长和侵袭的研究

目的:研究RNA干扰Slug表达对结肠癌细胞HCT 116生长和侵袭的影响,并探讨Slug对E-钙黏素(E-cadherin)的调控作用。方法:将表达Slug siRNA的3个载体pGenesi-l/Slug siRNA1-3和阴性对照pGenesi-INC分别转染HCT 116细胞,反转录PCR(RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)检测SlugmRNA和蛋白的表达。选取干扰效果最强的质粒转染细胞,采用噻唑蓝(MTT)染色检测细胞的增殖活性,细胞划痕和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。RT-PCR和Western blot检测抑制Slug表达后,E-cadherinmRNA和蛋白的表达水平变化。结果:3条Slug siRNA干扰序列均能有效抑制Slug表达,其中Slug siRNA3干扰效果最强:与阴性对照相比,mRNA和蛋白水平分别下降了85%和80%。Slug siRNA3组HCT 116细胞生长速度显著低于对照组(P<0.05),划痕愈合的速度以及侵袭至Matrigel胶上的平均细胞数量明显低于对照组(P<0.05)。干扰Slug的表达能够显著上调E-cadherin的表达。结论:RNA干扰Slug基因能够抑制结肠癌细胞生长及侵袭,其机制可能与上调E-cadherin有关。

有毒中药对人结肠癌HCT116和SW480细胞的生长抑制作用

目的从已知具有抗肿瘤作用的有毒中药或中药化合物中筛选出具有抑制不同发生途径人结肠癌细胞作用的药物。方法应用MTT法检测白花蛇舌草、雷公藤、重楼、龙葵、藤黄、天南星、黄药子、华蟾素、斑蝥酸钠及亚砷酸氯化钠对不同发生途径的人结肠癌细胞HCT116(hMLH1缺失结肠癌细胞株)和SW480(错配修复基因正常的结肠癌细胞株)生长抑制作用。结果斑蝥酸钠、华蟾素、亚砷酸氯化钠及藤黄提取物对人结肠癌细胞HCT116及SW480的生长有抑制作用。斑蝥酸钠、华蟾素及藤黄提取物干预HCT116细胞的IC50值和干预SW480细胞的IC50值比较有统计学差异(P<0.05),亚砷酸氯化钠干预两细胞株的IC50值无统计学差异(P>0.05)。白花蛇舌草、雷公藤、重楼、龙葵、天南星、黄药子这6种中药的提取物在本实验条件下无效。结论藤黄提取物、斑蝥酸钠、亚砷酸氯化钠及华蟾素可有效抑制不同途径的人结肠癌细胞的生长,其中斑蝥酸钠、华蟾素、藤黄提取物可能具有特异性抗错配修复基因缺失所致结、直肠癌的作用。

槲寄生通过抑制NF-κB活性来诱导人大肠癌HCT116细胞凋亡

目的:探讨槲寄生诱导人大肠癌HCT116细胞凋亡所涉及的信号转导途径。方法:采用MTT法测定细胞的增殖活力,琼脂糖凝胶电泳观察细胞调亡,流式细胞仪进行细胞周期分析,Western blotting和DIG-EMSA研究细胞调亡途径。结果:槲寄生对HCT116细胞有明显的生长抑制作用,琼脂糖凝胶电泳检测到典型的DNA梯状条带;槲寄生可通过抑制IκBα蛋白磷酸化进而抑制NF-κB;槲寄生可增强羟基喜树碱对HCT116细胞诱导的凋亡作用。结论:槲寄生对HCT116细胞有明显的生长抑制和诱导调亡作用,并且通过抑制NF-κB活性来诱导人大肠癌HCT116细胞凋亡。

人HCT116结肠癌细胞系中CD133^+结肠癌干细胞分离及鉴定

目的从人结肠癌细胞系(HCT116)中分离鉴定结肠癌干细胞,并观察其体外生物学特性。方法利用RT-PCR、免疫荧光、流式细胞等技术检测HCT116细胞中CD133的表达情况;利用免疫磁珠分选技术分选CD133+细胞;采用无血清培养基培养分选后的CD133+细胞鉴定其体外增殖特性;采用含血清培养基诱导干细胞克隆球分化并采用免疫组化检测CK20表达情况鉴定其分化特性。结果HCT116细胞系中存在CD133+细胞,免疫磁珠能有效的分选CD133+细胞,分选后的阳性含量为91.92%,分选后的阳性细胞具有典型干细胞的体外增殖、分化特性。结论CD133+结肠癌干细胞在体外具有和普通干细胞类似的无限增殖、自我更新和分化能力,同时它们也表达ABCG2等耐药相关蛋白。

sTie2通过阻抑血管生成拟态抑制结肠癌HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:探讨可溶性Tie2(soluble Tie 2,sTie2)对结肠癌HCT116细胞血管生成拟态(vascular mimicry,VM)形成、增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法:将重组质粒pBLAST49-hsTie2及对照质粒pBLAST49通过脂质体转染至HCT116细胞,分别形成hsTie2-HCT116细胞和Ctrl-HCT116细胞。通过3D模型培养、SRB法、细胞划痕实验及Transwell法分别检测HCT116细胞的VM形成、增殖、迁移及侵袭能力,采用Western blotting法检测HCT116细胞中VE-cadherin蛋白的表达。结果:pBLAST49-hsTie2重组质粒成功转染至结肠癌HCT116细胞。与Ctrl-HCT116细胞相比,hsTie2-HCT116细胞中VM的形成[(0.75±0.45)vs(7.50±0.52)个/视野,P<0.01]及VE-cadherin蛋白的表达[(1.23±0.08)vs(1.73±0.02),P<0.05]显著降低;细胞增殖率也显著降低[(32.57±4.57)%vs(88.24±21.94)%,P<0.01];细胞迁移能力[(0.37±0.07)vs(0.80±0.03)mm,P<0.01]及侵袭能力[(57.25±3.17)vs(127.25±6.25)个/视野,P<0.01]均显著减弱。结论:sTie2通过阻抑VM形成抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,有望成为既抗血管生成又抗VM形成的双靶向治疗结肠癌的药物。

槲寄生凝集素抑制人大肠癌HCT116细胞环氧化酶-2表达的研究

目的:探讨槲寄生凝集素对人大肠癌HCT116细胞环氧化酶(COX-2)表达的影响。方法:采用RT-PCR、Western blotting和ELISA等方法检测不同浓度(0.1～1mg/L)槲寄生凝集素对细胞COX-2及其产物前列腺素E2(PGE2)表达的影响。结果:槲寄生凝集素可抑制HCT116细胞的COX-2mRNA、蛋白表达及PGE2的水平,其抑制COX-2蛋白的表达与PGE2的水平相一致,只在大剂量(1mg/L)时对COX-1mRNA有抑制作用。结论:槲寄生凝集素具有抑制HCT116细胞的COX-2基因转录、蛋白表达和功能活性等作用,在一定浓度(0.1～1mg/L)和时间范围(3～24h)内,表现出时效与量效关系。

三叶青乙酸乙酯提取物通过miR-515-5p/CDCA5调控结直肠癌细胞HCT116增殖、迁移及侵袭

结直肠癌是临床常见的一种消化系统恶性肿瘤,中药提取物具有抗氧化、抗肿瘤等作用,并可抑制结直肠癌等肿瘤细胞的增殖等生物学行为[1-3]。三叶青属于葡萄科崖爬藤属多年生藤本植物,可抑制肝癌细胞增殖并可促进细胞凋亡[4]。miR-515-5p在肿瘤细胞中表达下调,上调其表达可抑制肿瘤细胞迁移[5]。starbase预测显示CDCA5可能是miR-515-5p的靶基因,CDCA5在结直肠癌细胞中表达水平升高,并可通过激活ERK信号通路从而促进结直肠癌发展进程[6]。因此,本研究主要探究三叶青乙酸乙酯提取物对结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响,探讨其对miR-515-5p/CDCA5分子轴的调控作用。

咖啡酸苯乙酯对大肠癌HCT116细胞增生的抑制作用

目的:探讨咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester, CAPE)对体外培养的大肠癌细胞HCT116细胞增生、细胞周期和凋亡的影响. 方法:不同浓度CAPE处理体外培养的HCT116细胞后,采用MTT法检测处理后24、48、72、96 h HCT116细胞的增生活性;PI染色、流式细胞仪检测处理后24 h细胞周期分布;Annexin V-FITC/PI双染色、流式细胞仪检测处理后24 h细胞凋亡率. 结果:80,40,20,10,5.0,2.5 mg/L CAPE处理HCT116细胞24,48,72,96 h后,细胞增生明显受到抑制,呈时间和剂量依赖性特点.流式细胞仪细胞周期分析表明,10,5.0,2.5 mg/L CAPE处理HCT116细胞24 h后,G0/G1期细胞百分率上升,S期细胞百分率下降,呈剂量依赖性.流式细胞仪细胞凋亡率分析表明: 10,5.0,2.5 mg/L CAPE处理HCT116细胞24 h后, 细胞凋亡率上升,呈剂量依赖性. 结论:CAPE对HCT116细胞具有明显的增生抑制作用,其机制与其阻滞细胞周期和诱导凋亡有关.

高菜硫代葡萄糖苷提取物对人结肠癌细胞HCT116的抑制作用

为了探讨高菜(Brassica juncea var.integlifolia)中硫代葡萄糖苷(简称硫苷)的含量、种类及其对人结肠癌细胞株HCT116细胞增殖和凋亡的影响,采用紫外分光光度法检测新鲜高菜中总硫苷含量,高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术鉴定硫苷化合物结构,流式细胞仪、蛋白质印迹法和实时定量聚合酶链式反应检测高菜硫苷提取物对人结肠癌细胞株HCT116细胞增殖和凋亡的影响。结果表明:新鲜高菜中总硫苷含量为15.45 mg/g;从高菜硫苷提取物(总硫苷质量分数为73.7%)中鉴定出2-丙烯基硫苷、4-甲基硫代丁基硫苷、4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷3种主要的硫苷化合物;高菜硫苷提取物对正常人结肠成肌纤维细胞CCD-18Co没有抑制作用,但通过诱导细胞周期基因及相关信号蛋白(Cyclin B、CyclinD1、CyclinE)下调使HCT116细胞的细胞周期停滞,通过诱导细胞凋亡基因及相关信号蛋白(Caspase-3、Cleaved caspase-3)的上调使人结肠癌细胞株HCT116细胞凋亡,从而抑制人结肠癌细胞株HCT116细胞增殖。

As_2O_3对体外肠癌细胞HCT116生长和增殖周期的影响

目的:研究三氧化二砷(As2O3)对人体外肠癌细胞HCT116的生长抑制作用和增殖周期的影响.方法:肠癌细胞HCT116进行体外培养后,分成对照组,0.5μmol/L As2O3组、1.5μmol/L As2O3组、2.5μmol/L As2O3组,在不同时间段内,MTT法观察不同浓度As2O3对肠癌细胞的生长抑制情况,绘制细胞生长曲线;流式细胞技术分析细胞增殖的周期变化.结果:MTT结果显示0.5μmol/L的低剂量A s2O3抑制率与对照组无明显差别(P>0.05),1.5μmol/L As2O3组抑制率和2.5μmol/L As2O3组抑制率与对照组相比较,组间均有差异(P<0.05),且As2O3对肿瘤细胞的抑制作用均随时间延长而增强,并在第3天时抑制作用最明显(1.5μmol/L As2O3组抑制率为38.64%±0.16%,2.5μmol/L As2O3组抑制率为51.42%±0.53%,对照组是8.35%±0.76%),然后第4天有下降的趋势,但2.5μmol/L As2O3的抑制作用第4天未见明显下降趋势(抑制率为52.93%±1.53%);流式细胞术分析表明,As2O3为0.5μmol/L时,S期细胞分布35.58%±0.63%(对照组25.69%±1.46%),G2/M期细胞分布33.41%±0.73%(对照组30.44%±1.51%)两者比较没有统计学差异(P>0.05),当As2O3浓度为1.5μmol/L时,S期细胞占42.69%±2.64%,G2/M期细胞占22.46%±0.59%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);药物提高到2.5μmol/L时,S期细胞占45.71%±1.53%,G2/M期细胞占14.66%±0.92%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论:As2O3对人肠癌细胞HCT116具有明显的抑制作用,主要抑制肿瘤细胞DNA合成的增殖期,且至少1.5μmol/L以上的As2O3浓度才能达到抑制肿瘤增长繁殖的效果,所以临床应用As2O3进行肠癌化疗时应掌握好有效的剂量浓度和化疗时间窗,从而提高化疗效果的同时最大减轻不良反应,延缓耐药性的发生.

吲哚美辛对人结肠癌HCT116和SW480细胞的影响

目的 :探讨吲哚美辛对人结肠癌HCT116和SW4 80细胞的影响。方法 :体外培养细胞 ,采用MTT法分别检测吲哚美辛作用后两系细胞的生长情况 ,计算半抑浓度 (IC50 ) ;体内建立裸鼠皮下移植瘤模型 ,喂服吲哚美辛 3mg/ (kg·d)共 4周 ,隔日测瘤结节体积及鼠重 ,评价吲哚美辛的抑瘤效果。结果 :吲哚美辛作用于结肠癌HCT116和SW4 80细胞 4 8h后 ,细胞的生长均受到明显抑制 ,呈剂量依赖效应 ,IC50 分别为 (318.2± 12 .7) μmol/L和 (70 1.4± 2 9.5 ) μmol/L ;吲哚美辛显著减慢裸鼠皮下移植瘤的生长 ,用药 4周后抑瘤率达 4 4 .6 % ,未见明显毒性反应。结论 :吲哚美辛能抑制不表达环氧合酶的人结肠癌细胞 (HCT116和SW4 80 )生长 ,间接说明其抗癌作用不完全依赖环氧合酶途径 。

藤黄酸诱导人结肠癌细胞HCT116及SW480凋亡的研究

目的:探讨藤黄酸对不同发生途径的人结直肠癌细胞凋亡的影响。方法:采用Annexin V-FITC/PI双染法,检测藤黄酸给药后对HCT116及SW480细胞凋亡的影响。结果:0.25、0.5、1.0μg/m L浓度的藤黄酸对HCT116细胞的总凋亡率分别为25.98%、31.08%、37.94%,各浓度的藤黄酸对HCT116细胞的总凋亡率与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),并且呈浓度依赖性;0.25、0.5、1.0μg/m L浓度的藤黄酸对SW480细胞的总凋亡率分别为8.36%、35.05%、38.93%,各浓度的藤黄酸对SW480细胞的总凋亡率与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),并且呈浓度依赖性。结论:藤黄酸对人结肠癌细胞有较好的促凋亡作用。

十味有毒中药对人结直肠癌HCT116细胞株的作用研究

目的:研究大肠癌HCT116细胞对10味有毒中药的敏感性。方法:采用MTT法测定药物对细胞增殖的抑制率。结果:中华蟾酥注射液、斑蟊酸钠注射液、亚砷酸氯化钠注射液及藤黄对大肠癌HCT116细胞的增殖有抑制作用,且随着药物浓度的增加抑制效果明显增强,有明显的量效关系;黄药子、龙葵、重楼、白花蛇舌草、天南星、雷公藤在相同浓度下未表现出抑制作用。斑蝥酸钠及藤黄IC50优于亚砷酸氯化钠(P<0.05),华蟾素注射液由于采用的原药未提供原液浓度,未能得出具体的IC50值。结论:通过实验筛选证明华蟾酥注射液、斑蟊酸钠注射液、亚砷酸氯化钠注射液及藤黄可抑制HCT116细胞增殖,为进一步的体内动物研究提供实验数据,其机制还待进一步研究。

ACL的构建及其对结直肠癌HCT116细胞增殖和迁移的作用

目的制备阿托伐他汀钙脂质体(ACL),探究其对结直肠癌HCT116细胞增殖、迁移的影响。方法采用乳化-溶剂挥发法制备ACL并进行相关参数的测定。以香豆素6为荧光探针探究HCT116细胞摄取的变化;MTT实验和细胞平板克隆实验检测ACL和阿托伐他汀钙(AC)对HCT116细胞增殖的影响;Transwell实验检测ACL和AC对HCT116细胞迁移的影响。结果成功制备ACL,其平均粒径为(87.24±0.485)nm,分散系数为0.240~0.250,Zeta电位为(-12.19±3.642)mV。脂质体形态似球形或圆形结构,外观完整,且大小均匀。脂质体组细胞内荧光强度显著增强,细胞摄取增加。AC和ACL作用后,细胞增殖率和克隆形成率显著降低,迁移细胞数减少,且ACL的抑制作用均显著强于AC。结论ACL可以显著增加HCT116细胞的摄取,增强AC对HCT116细胞的抑制作用。

糖化终末产物对人结肠癌HCT116细胞中ChREBP表达的影响

目的研究糖化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)对人结肠癌HCT116细胞中碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate responsive element binding protein,ChREBP)表达的影响。方法采用RTPCR检测AGEs处理的人结肠癌HCT116细胞中ChREBP及其下游基因的表达;使用N-乙酰半胱氨酸(NAC)干预氧化应激状态;运用Western印迹法观察在HCT116细胞中AGEs诱导对ChREBP表达的影响;运用MTS比色法观察AGEs诱导对HCT116细胞增殖的影响。结果 AGEs刺激后人结肠癌HCT116细胞中转录因子ChREBP表达增加(P<0.05);细胞经抗氧化剂NAC处理后,AGEs刺激所致ChREBP表达增加和HCT116细胞增殖均被明显抑制(P<0.05)。结论 AGEs通过激活氧化应激反应来上调人结肠癌HCT116细胞中的ChREBP表达。

苦豆子提取物抗人结肠癌HCT116细胞株鸡胚尿囊膜移植瘤血管生成的研究

目的:通过观察苦豆子提取物抗人结肠癌HCT116细胞株鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)移植瘤的血管生成现象,探讨其抗肿瘤血管生成作用及机制。方法:采用人结肠癌HCT116细胞培养并建立鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤模型,观察苦豆子提取物作用下CAM移植瘤血管生成的变化。结果:苦豆子提取物作用于鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤具有明显的抗血管生成现象,用药组血管面积比(VA/CAM)均明显小于模型对照组,其中大剂量及中剂量组(1000μg/胚、500μg/胚)能达到重组人血管内皮生长因子抑制素组的抗血管生成效果(P值分别为0.899及0.362,差异无统计学意义)。结论:苦豆子提取物具有抑制人结肠癌HCT116鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤血管生成的作用,其作用效果同剂量呈相关性。

龙胆苦苷对人结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡的影响

目的研究龙胆苦苷对人结肠癌细胞HCT116增殖、凋亡的影响,并初步探讨其可能作用机制。方法体外培养人结肠癌HCT116细胞,采用不同浓度的龙胆苦苷(0、12.5、25、50 mg/L)作用于细胞,并同时应用5-氟尿嘧啶作用于相同的细胞,对比不同处理方法对细胞生长的抑制及对细胞形态及凋亡的影响,并检测不同浓度龙胆苦苷对细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平的影响。结果与阴性对照组相比,5-氟尿嘧啶组和龙胆苦苷组均显著能够抑制HCT116细胞增殖,且龙胆苦苷组对HCT116细胞的抑制增殖作用呈剂量和时间依赖性,差异有统计学意义(P<0.05)。5-FU组凋亡细胞百分率最高,其次是龙胆苦苷50、25、12.5 mg/L组,与阴性对照组比较,龙胆苦苷组(50、25、12.5 mg/L)细胞凋亡率显著提高,差异有统计学意义(P<0.05)。与阴性对照组比较,龙胆苦苷(12.5、25、50 mg/L)组Bax、Caspase-3 mRNA表达水平显著升高,而Bcl-2 mRNA表达在25、50 mg/L龙胆苦苷处理后明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与阴性对照组比较,龙胆苦苷(12.5、25、50 mg/L)组促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达水平明显上调,而抑凋亡蛋白Bcl-2的表达明显下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论龙胆苦苷可抑制HCT116细胞增殖并促进细胞凋亡,且对肿瘤细胞的抑制增殖作用呈剂量和时间依赖性,可能与激活Bax表达、抑制Bcl-2表达进而活化Caspase-3信号通路有关。

siRNA沉默Survivin抑制结肠癌细胞株HCT116增殖并增强其对奥沙利铂的敏感性

目的研究Survivin特异性siRNA对人结肠癌细胞株HCT116增殖和对化疗药物奥沙利铂敏感性的影响。方法体外将Survivin特异性siRNA表达载体pgsiRNA-Survivin转染HCT116细胞,通过Western blot和Real time-PCR方法检测细胞Survivin的表达,采用流式细胞术分析细胞周期分布,MTT法检测干扰Survivin后HCT116细胞对奥沙利铂的敏感性。结果 pgsiRNA-Survivin转染HCT116细胞48 h后,细胞的Survivin基因表达明显降低,导致了HCT116细胞G2/M期阻滞;pgsiRNA-Survivin转染组细胞对奥沙利铂的敏感性显著性增强。结论 Survivin特异性siRNA能显著沉默HCT116细胞Survivin基因,抑制细胞增殖,并增强HCT116细胞对奥沙利铂的敏感性。

缺氧对HCT116肠癌细胞成纤维细胞生长因子21的调节作用

目的观察缺氧模拟物二氯化钴(CoCl2)对人源HCT116肠癌细胞成纤维细胞生长因子21(FGF21)表达的影响。方法分别用0、50、100和200μmol/L的CoCl2处理HCT116细胞24 h,同时用200μmol/L的CoCl2处理HCT116细胞12、48 h,RT-PCR法和Western blot法分别检测细胞中的FGF21 mRNA和蛋白的表达水平;分别用缺氧诱导因子抑制剂2ME2和YC-1,同时加入CoCl2处理HCT116肠癌细胞24 h,RT-PCR法检测细胞中的FGF21 mRNA;用抗氧化剂NAC和CoCl2同时处理HCT116肠癌细胞24 h,RT-PCR法和Western blot法分别检测细胞中的FGF21 mRNA和蛋白的表达量。结果随CoCl2浓度增加和作用时间延长,HCT116细胞FGF21mRNA相对表达量逐渐降低(P<0.05)。Western blot结果显示,与对照组相比,CoCl2组FGF21蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。缺氧诱导因子抑制剂处理后,HCT116细胞FGF21 mRNA相对表达量依然降低(P<0.05)。抗氧化剂处理后,HCT116细胞FGF21 mRNA和蛋白相对表达量未出现明显降低(P>0.05)。结论CoCl2对HCT116肠癌细胞FGF21的表达有抑制作用,该作用与缺氧诱导因子无关,而与氧化应激有关。