高成瘤性前列腺癌细胞亚克隆细胞株的制备及其生物学特性的研究

目的:建立人前列腺癌LNCap细胞高成瘤性亚克隆细胞株并探讨其生物学特性。方法:慢病毒载体PGK-luciferase-GFP转染LNCap细胞,稳转株与Matrigel混合注入SCID小鼠皮下,反复消化法原代培养皮下瘤获得亚克隆细胞株,CCK8及Transwell实验检测细胞增殖及迁移力;用亲代LNCap细胞及亚克隆细胞皮下注射SCID小鼠成瘤,观察两组瘤体生长及大小,并用生物活体发光、病理及免疫组织化学检测瘤体情况。结果:与亲代LNCap细胞相比,亚克隆细胞的生长速度增快,迁移力增强,皮下瘤成瘤率增高,荧光信号强度增加,皮下瘤组织切片HE染色镜下可见核分裂相,免疫组织化学AR染色阳性。结论:制备的人前列腺癌亚克隆细胞株其恶性生物行为增加。

高成瘤性前列腺癌细胞亚克隆细胞株在反基因治疗中的应用

【目的】选用高成瘤性前列腺癌细胞亚克隆细胞株LNCap1-luc构建人类前列腺癌裸鼠移植瘤模型,应用于反基因治疗,探讨该细胞株进行抗肿瘤研究的价值。【方法】采用皮下接种法制备24只荷LNCap1-luc前列腺癌移植瘤裸鼠模型,随机分为3组:三螺旋形成寡核苷酸(TFO)治疗组、序列对照寡核苷酸(SCO)非特异性对照组、生理盐水(NS)阴性对照组。瘤内注射给药6周,测量移植瘤质量和体积,计算抑瘤率。实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测肿瘤组织AR mRNA表达;免疫组化法检测AR,PSA,Ki67蛋白的表达;TUNEL法检测细胞凋亡。【结果】TF0治疗组的抑瘤率为63.16%,AR mRNA的表达水平(39.16±3.21)%,Ki67的阳性表达率(25.43±2.01)%,凋亡指数(35.76±2.35)%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。TFO组AR、PSA蛋白的表达水平低于对照组。【结论】TFO能有效抑制LNCap1-luc移植瘤的生长;LNCap1-luc细胞株为前列腺癌抗肿瘤药物的研究提供了新的细胞模型,具有良好的应用价值。

不同转移潜能的人胰腺癌JF305单克隆细胞亚系的建立

为研究胰腺癌的转移机理，在我校原建立的人胰腺癌ＪＦ３０５ 细胞系基础上，利用细胞克隆，细胞电泳，流式细胞仪及人癌裸小鼠原位移植技术，建立了具有不同转移潜能的人胰腺癌ＪＦ３０５ 单克隆细胞亚系和具有不同转移潜能的人胰腺癌单克隆细胞亚系裸小鼠原位移植模型。结果表明该单克隆细胞亚系及其肿瘤移植模型的建立，为探讨胰腺癌转移机理提供了较理想的研究方法。

人骨髓基质成纤维样细胞克隆亚系分泌产物的实验研究

经过克隆挑选,选出一株能耐受低血清浓度(5%)培养条件的纤维母细胞克隆细胞系(HFCL-1)。这个亚系的条件培养液(HFCL-1CM)能刺激人骨髓和小鼠骨髓中 GM-CFU 形成集落。不同浓度的 HFCL-1CM 与 K_(562)和 HL_(60)白血病细胞系细胞共培后显示对 K_(562)和HL_(60)细胞增殖的抑制,HFCL-1单层也显示同样的效果。HFCL-1要求低血清条件,这为进一步生化分离活性因子,提供了可行的条件。

FAK在不同迁移特性骨肉瘤亚克隆细胞系中的表达及其意义

目的探讨不同迁移特性骨肉瘤亚克隆细胞系粘着斑激酶(FAK)的表达及其对骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响。方法通过有限稀释法获得不同迁移能力的骨肉瘤细胞143B亚克隆细胞系A1、A2、A3、A4、A5,运用Western blottting技术检测不同亚克隆细胞系FAK的表达。小干扰RNA(siRNA)序列研究FAK对骨肉瘤细胞增殖及迁移能力的作用,免疫荧光染色法比较形成板状伪足细胞数的比例。结果骨肉瘤细胞143B亚克隆细胞系A2、A3的迁移能力较A1、A4和A5强(P<0.05),其细胞中FAK表达也明显增高。外源转入FAK siRNA后,骨肉瘤亚克隆细胞系A3的迁移能力明显下降(P<0.05),形成板状伪足细胞数的比例由33.3%降至12.8%(P<0.05),但增殖能力无明显变化。结论迁移能力较强的骨肉瘤细胞143B亚克隆细胞系中FAK呈高表达,FAK可能通过影响板状伪足的形成从而增强骨肉瘤细胞的迁移能力,但是对骨肉瘤细胞的增殖无明显作用。

高、低转移的二株亚克隆细胞系的超微结构比较研究

对来自同一祖先的两株具有不同转移能力的亚克隆细胞系Ｈｃａ－１６Ａ３－Ｆ（Ｆ）和Ｈｃａ－Ａ２－Ｐ（Ｐ）进行了形态学观察，并应用体视学方法进行定量比较分析。结果表明，Ｆ细胞的剖面平均直径、核质比、核仁核比均大于Ｐ（Ｐ＜０．００１）。Ｆ的核畸形、核仁边集多见，胞质中粗面内质网、游离核糖体丰富，细胞表面微绒毛较多。Ｐ中有较多的脂滴。Ｆ和Ｐ中均没有发现Ａ型病毒颗粒。表明同源而具有不同转移能力的瘤细胞在形态上也有一定的差异。

生长特性差别的胃癌MGC803细胞亚系间细胞骨架、细胞通讯与癌基因表达的比较研究

肿瘤细胞表型差异是临床药物敏感性、抗原性、转移性、潜伏性和进展速度等差异的主要原因。为了弄清恶性表型差别的表现、相关性及调节机理、我们从胃癌MGC 803系分离了单细胞亚系,各亚系按克隆过程的时间差别归纳分组,选快组M 17、中组M 6和慢组M 3进行比较。软琼脂生长实验表明三者的恶性程度有显著差别;M17恶性度最高,M3最低,M6居中。与其它表型联系比较,证明细胞生长速度、细胞微丝、微管骨架破坏及细胞通讯功能抑制都与锚着不依赖性生长的恶性特征有平行相关性。同时,M 17和M 3原癌基因表达有明显差别。

WEHI164－C1细胞株检测TNF的MTS／PMS比色法的建立

本文用有限稀释法对ＷＥＨＩ１６４细胞进行了亚克隆，从１２株中筛选出一株对ＴＮＦ高度敏感的亚克隆细胞株ＷＥＨＩ－Ｃｌ。ＭＴｓ的还原产物具有良好的水溶性，ＭＴＳ／ＰＭＳ比色法与ＭＴＴ法相比较具有简便、快速的优点。我们首先将ＭＴＳ引入细胞毒的检测，用ＷＥＨＩ１６４－Ｃｌ亚克隆株建立了检测ＴＮＦ的ＭＴＳ／ＰＭＳ比色法。此方法不仅简便、快速．而且敏感度高（比常规Ｌ９２９细胞检测法敏感１０～１５倍）、特异性强（ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＰＨＡ、ＣｏｎＡ、ＬＰＳ对检测结果均无明显影响）。

3,3',5-碘-L-甲腺原氨酸对成骨细胞前体增殖和成骨分化的作用

目的观察不同浓度的3,3',5-碘-L-甲腺原氨酸(3,3',5-triiodo-L-thyronine,T3)对小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1 subclone 14)细胞增殖及分化水平的作用.方法分别给予不同浓度T3干预细胞,培养1、2、3 d后采用CCK8法检测细胞增殖水平;在成骨分化诱导试剂干预7 d基础上,结合上述T3给药,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测各浓度组成骨细胞分化水平,通过实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹(Western blot)法检测各浓度组的成骨细胞标记性基因及蛋白的表达差异.结果在分别干预1、2、3 d后,T3随着浓度增高,对细胞的增殖水平均呈明显上调;而且相同剂量的T3对于细胞增殖呈时间依赖性增强.此外,MC3T3-E1 Subclone 14细胞诱导7 d后,对比于0对照组,低浓度T3(1 nmol/L)对成骨细胞各分化参数均无明显作用,而10、100、1000 nmol/L的T3对细胞ALP染色,成骨细胞相关基因及蛋白均明显上调,其中以10和100 nmol/L组最为显著.结论T3对于MC3T3-E1 Subclone 14细胞的增殖和成骨细胞分化均有显著的促进作用.

不同转移潜能鼻咽癌细胞钙电流特征与细胞迁徙能力的相关性

背景与目的:肿瘤转移活性与瘤细胞以迁徙运动潜能为代表的生物力学特性有关,而其迁移运动的生物力学机制又受制于细胞内的钙离子活动和钙电流特征。本文探讨不同转移潜能鼻咽癌单克隆亚系细胞钙电流特征,及与细胞迁徙运动潜能的相关性。方法:人鼻咽癌高转移潜能细胞株5-8F及低转移潜能细胞株6-10B分别与10%含药血清(由黄芪、党参、白花蛇舌草等组成)共同培养,MTT法检测含药血清对细胞增殖的影响,Western blot检测nm23-H1蛋白表达水平。利用全细胞膜片钳制方法观察细胞钙电流特征(药物作用20min),划痕实验观察细胞迁移能力(药物作用24h),比较分析其相关性。结果:6-10B细胞的nm23-H1表达水平(2.9±0.4)较5-8F细胞(2.3±0.21)高(P<0.05)。5-8F细胞内钙释放激活的钙电流ICRAC为(-1.39±0.36)nA,与6-10B细胞ICRAC[(-0.66±0.40)nA]相比差异有统计学意义(P<0.05)。通过划痕区的5-8F细胞数(350±3)也显著高于6-10B细胞(246±1)(P<0.05)。应用含药血清干预后,5-8F和6-10B细胞增殖活性差异无统计学意义(P>0.05),5-8F细胞的nm23-H1表达水平(3.9±0.1)明显高于6-10B细胞(1.0±0.1)(P<0.05)。干预后,5-8F细胞ICRAC降至(-1.27±0.35)nA,平均抑制幅度为(1.90±0.47)%;6-10B细胞则降至(-0.37±0.23)nA,平均抑制幅度为(0.46±0.12)%,两者差异有统计学意义(P<0.05),并出现与钙电流变化特点平行的细胞迁移能力变化,通过划痕线的5-8F细胞数明显减少(94±6),而6-10B细胞则受影响甚小(229±6,P<0.05)。干预前后5-8F细胞迁移能力变化具有显著性(P<0.05),6-10B细胞则无显著性差异(P>0.05)。结论:不同转移潜能鼻咽癌细胞钙电流特征及细胞迁移能力以及nm23-H1表达存在明显差异。应用含药血清干预后,高转移潜能细胞5-8F出现了与细胞钙电流ICRAC降低幅度相平行的细胞迁移能力抑制,药物血清可增加5-8F细胞的nm23-H1活性。

T24膀胱癌细胞ARID1A基因的表达与细胞增殖活力相关性研究

目的探讨AT丰富结合域1A(ARID1A)基因的表达与膀胱癌细胞T24增殖活力的关系,为进一步基因功能研究提供基础。方法利用梯度稀释法分离获得膀胱移行癌细胞系T24的高增殖亚克隆细胞株,体外评价细胞株和亲代细胞系增殖活力差异,检测细胞周期调控基因CCND1和膀胱癌肿瘤干细胞标志因子CD44。检测染色质重建复合物SWI/SNF亚基基因ARID1A在亚克隆和亲代细胞系的转录表达水平差异。结果分离得到65个T24的亚克隆细胞株,其中T24-9亚克隆细胞株不同于亲代的梭形形态,呈细小的圆形形态,增殖能力明显强于亲代,CC-ND1、ARID1A和CD44的mRNA表达量均有增加。结论 T24细胞系中的含有高增殖活力的干细胞细胞亚群,染色质重建复合物基因ARID1A转录活跃,可能增加ARID1A突变的风险。

CD8a＋DC新基因的克隆，功能鉴定与药物研发

目的：分离小鼠脾脏CD8α＋树突状免疫细胞（LDC）的特异基因，了解这些基因与抗原递逞功能的哭系。找到LDC的特异表面标志和特异功能基因。利用LDC特异基因产物作为自身免疫疾病、病毒性疾病和肿瘤的免疫治疗手段，从中筛选出有效的候选药物。方法：从60只小鼠脾脏LDC中纯化出10ug左右的总RNA，以对应的MDC细胞RNA为对照，采用减数抑制杂交法（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）建立了特异性针对LDC的减数cDNA文库。从该文库中克隆了100多个序列，从中筛选出LDC特异的14个基因，用半定量PCR证实这些基因在LDC中高表达，而在MDC中则表达较低。体外实验采用DC细胞系DC2．4来验证从LDC文库中分离的基因能够在该细胞系表达。21个序列的RT-PCR结果阳性。为了解基因在DC中的作用，选择了12个基因进行RNA干扰实验。设计出特异的siRNA，插入到载体pSilencer1．0内，转化后酶切鉴定并测序，然后将siRNA质粒分别电转化到DC2．4细胞，经G418持续筛选，再用稀释法挑单克隆培养，每个基因最少挑6个以上的单克隆细胞扩大培养。最后用RT-PCR和实时PCR鉴定6个克隆的基因抑制率。挑选抑制率在80--90％以上的siRNA亚克隆细胞系进行基因功能鉴定。功能鉴定采用的是抗原递逞实验，将siRNA亚克隆细胞，DC2．4细胞和空质粒转化的DC2．4细胞分别与OVA可溶性抗原，吸附在乳胶颗粒表面的OVA抗原，乳胶颗粒和空白对照等培养过夜，用针对OVA抗原的25D1．16等单抗标记细胞，用流式细胞仪检测DC细胞表面的OVA抗原等。体内功能实验方法是，将这些克隆与病毒培养后，输入小鼠体内，用流式细胞仪检测受DC递逞的病毒抗原刺激后小鼠T细胞产生1，干扰素的能力。结果：基因14、79、94等的siRNA亚克隆细胞的25D1．16的表达明显低于对照细胞（P〈0．01）。基因14等的siRNA亚细胞克隆刺激小鼠T细胞产生干扰素的能力显著降低（P〈0．01）。结论：基因14、79、94等和LDC的抗原递逞功能密切有关，使用这些基因的siRNA可以降低LDC的免疫功能，具有免疫治疗功效，是良好的治疗自身免疫耐受，减少移植物免疫排斥的候选药物。相反，运用这些基因和其产物可以提高细胞免疫功能，对肿瘤治疗具有价值。

小鼠肝癌（HCa）两株克隆细胞系转移表型的比较

来自同一祖先的两株不同亚克隆细胞系Ｈｃａ－１６Ａ３－Ｆ（Ｆ）和ＨＣａ－Ａ２－Ｐ（Ｐ），在两种不同小鼠体内经不同途径接种所得的转移率和转移部位显示有差别：Ｃ３／ｈｅ小鼠皮下组，Ｆ呈现高淋巴道转移（８０．０％），而Ｐ未出现转移，Ｃ３Ｈ／ｈｅ小鼠尾静脉组，Ｆ在卵巢（２８．６％）和淋巴结（２８．６％）有较低的转移率，Ｐ权出现一例（１４．３％）卵巢转移，然而，在裸鼠体内却出现了异常的变化，Ｆ呈现高血道（肺脏７１．４％）转移而不出现淋巴道和其他部位转移，但Ｐ却出现高淋巴道转移（８５．７％）兼有低血道（肺脏２８．６％，卵巢１４．３％，肾脏２８．６％）转移。体内实验结果提示：ＨＣａ细胞中含有转移、浸润能力不同的亚群；Ｆ细胞在体内具有较强的浸润力与转移力，且有淋巴道转移的倾向；Ｐ细胞的浸润力和转移力则低于Ｆ细胞，但若给其提供适当的到达器官的通路，完全能形成实验性转移灶。Ｃ３Ｈ／ｈｅ小鼠也是ＨＣａ细胞生长和转移的理想宿主。

MOLECULAR CLONING, EXPRESSION AND SUBCELLULAR LOCALIZATION OF HUMAN OCT-4 PROTEIN

Objective To clone, express, purify human Oct-4 and detect its subcellular localization. Methods Human Oct-4 cDNA was amplified by RT-PCR strategy. Oct-4 protein was induced and expressed in BL21(DE3) strain. Furthermore, the protein was purified with Ni-NTA resin. Subsequently, site-directed mutagen-esis of Oct-4 (aa 236 - 240) was introduced. Finally, the subcellular localization of wide type Oct-4 and mutant Oct-4 was examined by immunofluorescent cytochemistry staining and confocal laser scanning microscope analysis. Results The full length cDNA of human Oct-4 was 1083 bp. Human Oct-4 encoded a 55 kd protein by prokaryotic vector in E coli. Compared with pure nuclear localization of wide type Oct-4, mutant Oct-4 was mostly enriched in the cytoplasm. Conclusion The cloning, expression and investigation of subcellular localization of human Oct-4 are basis of studying its biological function.

高表达Omi/HtrA2对PED/PEA-15表达缺陷前列腺癌细胞凋亡的影响

我们通过载体构建、转染和筛选，建立PED／PEA-15表达缺陷的前列腺癌亚克隆细胞系，探讨Omi／HtrA2与PED／PEA-15间的作用对前列腺癌细胞凋亡的影响，以阐明前列腺癌细胞凋亡机制。