巴戟天含药血清对成骨-破骨细胞共育体系CAⅡ、NFAT2mRNA表达的影响

目的探讨不同浓度巴戟天含药血清对体外培养成骨-破骨细胞共育体系中碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)、活化T细胞核因子(NFAT2)mRNA表达的影响。方法取24 h内新生SD乳鼠头盖骨分离培养成骨细胞,取5周龄SD大鼠四肢长骨骨髓基质细胞,加入集落细胞刺激因子(M-CSF)和细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导培养破骨细胞。采用ALP染色鉴定成骨细胞,TRAP染色、骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色、电镜等扫描鉴定破骨细胞,体外建立成骨-破骨细胞共育体系,设置高、中、低3种浓度巴戟天含药血清组和对照组,干预3d后提取各组总RNA,应用Real Time PCR(RT-PCR)方法测定各组CAⅡ、NFAT2mRNA表达并进行统计学分析。结果不同浓度巴戟天含药大鼠血清对成骨-破骨细胞共育体系CAⅡ、NFAT2 mRNA的表达均有抑制作用,且其抑制作用表现出一定的浓度依赖性;各组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论巴戟天含药血清可抑制成骨-破骨细胞共育体系CAⅡ、NFAT2mRNA表达,从而达到降低破骨细胞分化成熟及骨吸收活性。

巴戟天含药血清对成骨-破骨细胞共育体系OPGmRNA、RANKLmRNA表达的影响

目的探讨不同浓度巴戟天含药血清对体外成骨-破骨细胞共育体系OPG、RANKLmRNA表达的影响方法取健康5周龄SD大鼠12只,体重165-172 g。随机分4组,分别予生理盐水及低中高三种浓度巴戟天溶液灌胃,分离血清。取健康5周龄SD大鼠6只,体重165-172 g,取四肢长骨骨髓基质细胞,诱导培养破骨细胞;用24 h内新生SD乳鼠4只,体重5~6 g,头盖骨分离体外培养成骨细胞。将成骨细胞加入含有培养5 d的破骨细胞中,共育2 d后分别改用不同浓度巴戟天含药血清与不含药血清的培养基培养,设低、中、高浓度组及对照组,培养3d后提取各组总RNA,应用RT-PCR检测各组OPGmRNA、RANKLmRNA表达。结果 RT-PCR结果示,中、高浓度组RANKLmRNA表达量均低于对照组（P〈0.05）,而OPGmRNA表达量显著高于对照组（P〈0.001）。结论巴戟天含药血清可上调共育体系中OPGmRNA表达,并下调RANKLmRNA表达,从而降低破骨细胞分化成熟及骨吸收活性。

巴戟天含药血清对成骨-破骨细胞共育体系原癌基因、核心结合因子1mRNA表达的影响

目的观察不同浓度巴戟天含药血清对体外培养成骨-破骨细胞共育体系中原癌基因(C-FOS)、核心结合因子(Cbfa)1 mRNA表达的影响。方法提取24 h内新生SD乳鼠颅盖骨分离培养成骨细胞,采用5周龄SD大鼠双侧股骨、胫骨的骨髓基质细胞,加入集落细胞刺激因子(M-CSF)和细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导培养破骨细胞。采用碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定成骨细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色、电镜扫描等鉴定破骨细胞,体外建立成骨-破骨细胞共育体系,设置低、中、高三种浓度巴戟天含药血清组和不含药血清组,干预3 d后提取各组总RNA,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定各组C-FOS、Cbfa1 mRNA表达量。结果不同浓度巴戟天含药大鼠血清对成骨-破骨细胞共育体系C-FOS有抑制作用,对Cbfa1 mRNA的表达有促进作用。高浓度含药血清组两者的表达差异显著(P<0.05,P<0.000 1)。结论巴戟天含药血清可抑制成骨-破骨细胞共育体系C-FOS的表达,促进Cbfa1 mRNA的表达,从而达到降低破骨细胞分化成熟及骨吸收活性,促进骨形成。

加味三根汤含药血清对成骨-破骨细胞共育体系中破骨细胞功能及IL-1β、TNF-α表达的影响

目的检测成骨-破骨细胞共育体系中应用加味三根汤含药血清后抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)以及白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的变化,探讨加味三根汤的作用机制。方法建立成骨-破骨细胞共育体系,制作SD大鼠含药血清,分为空白对照组,加味三根汤低、中、高剂量组,每组设6个复孔,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测共培养体系上清液中TRACP及IL-1β、TNF-α的含量。结果经鉴定成功培养成骨细胞和破骨细胞,并建立成骨-破骨细胞共育体系。加味三根汤含药血清中、高剂量组TRACP活性低于空白血清对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。与空白血清对照组比较,加味三根汤中、高剂量组IL-1β含量有所下降,加味三根汤高剂量组TNF-α含量降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论加味三根汤能够抑制共育体系中破骨细胞的功能,此作用可能是通过抑制IL-1β、TNF-α的分泌而达到。

淫羊藿苷对SD大鼠成骨-破骨细胞共育体系的影响

目的:检测成骨-破骨细胞共育体系中应用淫羊藿苷后碱性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)的变化,探讨淫羊藿苷的作用机理。方法:建立成骨-破骨细胞共育体系,分为淫羊藿组、空白对照组和阳性对照三组,每组于同一培养板重复6孔,分别检测上清液中ALP和TRACP的含量,并进行组内和组间的统计学分析。结果:经鉴定成功培养成骨细胞和破骨细胞,并建立成骨-破骨细胞共育体系,测定结果显示,在ALP活性中,三组间比较差异显著(P<0.01),LSD法组内比较淫羊藿苷组与空白对照组差异显著(P<0.01);淫羊藿苷组与阳性对照组无显著性差异(P=0.546);在TRACP活性中:三组间比较差异显著(P<0.01),LSD法比较淫羊藿苷组与空白对照组比较差异显著(P<0.01);淫羊藿苷组与阳性对照组无显著性差异(P=0.10)。结论:淫羊藿苷可以增强共育体系中成骨细胞的活性,抑制破骨细胞的功能。

加味阳和汤含药血清对MC3T3-E1与RAW264.7细胞共育体系的影响

目的 观察加味阳和汤含药血清对MC3T3-E1与RAW264.7细胞共育体系的影响,探究其防治骨质疏松症(OP)肾阳虚证的可能作用机制。方法 制备加味阳和汤含药血清,于Transwell共培养板建立MC3T3-E1与RAW264.7细胞共育体系,设置肾阳虚血清组、空白组、含药血清+肾阳虚血清组及含药血清组。干预48 h后,通过碱性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察成骨、破骨分化;运用TRAP和ALP试剂盒分别检测细胞上清液中TRAP、ALP活性;通过Western blot检测各组OPG、RANKL、RANK蛋白表达。结果 与肾阳虚血清组比较,含药血清+肾阳虚血清组ALP活性增加(P<0.05),TRAP活性及OC数目减低(P<0.05,P<0.05),OPG蛋白表达上调(P<0.05),RANKL、RANK蛋白表达下调(P<0.05,P<0.05)。结论 加味阳和汤对OP肾阳虚证有相应治疗作用,其机制可能与增加OPG及降低RANKL、RANK蛋白表达有关。

麦胚源活性肽对H_(2)O_(2)诱导的成骨细胞-破骨细胞 共育体系中细胞氧化损伤的保护作用

目的:为促进麦胚的高值化利用,建立H_(2)O_(2)诱导的成骨细胞(osteoblast,OB)-破骨细胞(osteoclast,OC)共育体系氧化应激模型,探究麦胚源活性肽ADWGGPLPH对OB和OC活性的影响。方法:利用流式细胞术、噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide,MTT)增殖实验、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染等方法,明确麦胚源活性肽对氧化应激环境中OB增殖和凋亡的作用。利用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活力检测、酶联免疫吸附测定以及抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色等方法研究麦胚源活性肽对氧化应激共育体系中OB和OC分化活性的影响。结果:麦胚源活性肽能够有效抑制氧化应激共育体系中OB内活性氧的增加,并通过抑制丙二醛生成,增强谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶活力,提高OB免受自由基攻击以及清除自由基的能力。麦胚源活性肽可显著抑制氧化应激共育体系中OB凋亡(FITC/PI双染结果显示OB凋亡率由12.4%下调至5.3%,OB细胞活力由60.4%提高至92.8%(P<0.01)),改善了OB增殖水平。此外,麦胚源活性肽对OB早期分化活性指标ALP活力、蛋白I型胶原以及晚期分化活性指标骨钙素水平的下降具有良好改善作用,OB矿化率从21.3%提高至84.3%(P<0.01),从而使OB发挥良好的分化活性和矿化功能。TRAP染色结果显示麦胚源活性肽也能有效抑制氧化应激造成的OC过度分化(OC相对阳性面积从376.4%减小至128.1%(P<0.01))。结论:麦胚源活性肽对H_(2)O_(2)诱导的OB-OC共育体系中细胞氧化损伤具有保护作用,从而维持良好的细胞稳态,本实验可为麦胚蛋白的开发利用提供一定的理论参考。

PGN激活BV2内吞Aβ寡聚体后对PC12的影响

目的探讨前炎性介质肽聚糖(peptidoglycan,PGN)激活BV2细胞内吞β淀粉样蛋白(amyloid proteinβ,Aβ)1～42寡聚体后对PC12的影响。方法采用细胞株传代法培养PC12细胞及BV2细胞,分别替代神经元细胞和小胶质细胞;用转移筛网进行PC12、BV2细胞共育培养;制备Aβ1～42寡聚体;分别采用MTT方法检测PC12细胞抑制率、Western blotting方法检测各组PC12细胞tau(pS396)蛋白表达情况、流式细胞仪检测PC12细胞凋亡。结果 Aβ寡聚体、Aβ寡聚体作用BV2细胞后及PGN作用BV2细胞后均能抑制PC12细胞增殖、增加PC12细胞tau(pS396)表达量、增加PC12细胞凋亡率;而PGN激活BV2细胞内吞Aβ寡聚体后对PC12细胞增殖抑制、tau(pS396)表达量、PC12细胞凋亡率与前面三种情况比较明显增加。结论 Aβ寡聚体可引起PC12细胞的细胞抑制率,tau蛋白异常磷酸化水平,细胞凋亡的增多;PGN激活BV2细胞内吞Aβ后,加重Aβ寡聚体引起PC12细胞的细胞抑制率,tau蛋白异常磷酸化水平,细胞凋亡的增多。

肾阳虚大鼠血清对OB-OC共育体系中β-catenin/OPG/RANKL表达的影响及淫羊藿苷的调控作用

目的:观察肾阳虚大鼠血清对共育体系中骨保护素(OPG),胞质蛋白(β-catenin)及核转录因子-κB受体活化因子配体(RANKL)蛋白表达的影响及淫羊藿苷对其的调控,进一步探究其诱导骨质疏松发生的可能机制。方法:取16只雄性SD大鼠,随机分为空白组和模型组,每组8只,模型组以10 mL·kg^-1腺嘌呤灌胃建立肾阳虚模型,造模成功后收集血清。体外分离培养成骨细胞(OB)和破骨细胞(OC),采用茜素红、碱性磷酸酶(ALP)及姬姆萨染色观察并鉴定OB,OC用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定,transwell小室建立OB-OC共育体系,设置淫羊藿苷组(100μmol·L^-1),空白组,淫羊藿苷(100μmol·L^-1)+血清组(10%肾阳虚血清),血清组(10%肾阳虚血清)及Dickkopf1(DKK-1)药物组(100μg·L^-1),干预共育体系2 d后,对OC进行计数,微板酶标法检测培养液中TRAP及ALP的含量,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组OPG,β-catenin及RANKL蛋白的表达。结果:与空白组比较,血清组ALP活性,β-catenin及OPG蛋白表达均明显降低(P<0.05),而OC数量,TRAP活性及RANKL蛋白的表达明显升高(P<0.05);与血清组比较,淫羊藿苷组ALP活性显著降低(P<0.01),与淫羊藿苷组比较,淫羊藿苷+血清组ALP活性及OPG蛋白表达明显降低(P<0.05),TRAP活性及RANKL表达明显升高(P<0.05)。结论:肾阳虚大鼠血清能诱导骨质疏松的发病,其作用机制可能是通过降低ALP活性,下调OPG及β-catenin蛋白的表达,同时提高TRAP活性,上调RANKL蛋白的表达来实现的。