细胞内氯离子通道蛋白1与肿瘤

细胞内氯离子通道蛋白1（CLIC1），又称核氯离子通道蛋白27（NCC27），具有重要的生理功能。CLIC1的异常表达则可以引发各种疾病，尤其是肿瘤的发生。近年来研究表明，CLIC1参与肿瘤的发生、发展及治疗等诸多过程。

细胞内氯离子通道蛋白1蛋白表达与结直肠癌发生、发展及预后的关系

目的探讨细胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)蛋白在结直肠正常黏膜、腺瘤及癌组织中的差异性表达及其与结直肠癌发生、发展和预后的关系。方法采用免疫组化组织芯片方法检测150例结直肠正常黏膜组织、62例结直肠腺瘤组织以及187例结直肠癌组织中的CLIC1蛋白表达情况,并分析CLIC1蛋白表达与结直肠癌临床病理因素及预后的关系。结果 CLIC1蛋白在结直肠正常黏膜组织(26.00%,39/150)、腺瘤组织(66.13%,41/62)和癌组织(82.89%,155/187)中的表达阳性率依次升高,之间的差异均有统计学意义(P<0.001)。CLIC1蛋白表达与结直肠癌的TNM分期有关(P=0.007),而与患者性别(P=0.553)、年龄(P=0.206)、肿瘤直径(P=0.185)、肿瘤分化程度(P=0.062)及肿瘤部位(P=0.598)均无关。CLIC1蛋白阳性表达者术后中位生存时间为80个月,CLIC1阴性表达者术后中位生存时间为111个月。log-rank检验表明,CLIC1蛋白阳性表达患者生存率(66.40%)明显低于阴性表达者(80.00%),P=0.031。结论 CLIC1蛋白表达与结直肠癌的发生、发展及预后有关,CLIC1可能是一个潜在的肿瘤标志物。

细胞外基质刚度调控压电型机械敏感离子通道组件1对神经干细胞分化的影响

目的 本研究旨在探讨细胞外基质刚度变化对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化的影响及其作用机制。方法 本研究基于成功构建脊髓损伤大鼠模型,并制备不同刚度(0.7 k Pa、40 k Pa)的聚丙烯酰胺凝胶基底,将大鼠原代NSCs于不同刚度基底上培养。压电型机械敏感离子通道组件1 (piezo type mechanosensitive ion channel component 1,Piezo1) sh RNA质粒转染NSCs细胞。免疫荧光染色检测神经元标志物双皮质醇(doublecortion,DCX)和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)阳性细胞百分比。免疫组织化学及蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测损伤组织及NSCs细胞中Piezo1蛋白的表达水平。结果 与0.7 k Pa基质刚度组相比,40 k Pa基质刚度组中DCX阳性细胞数增加,而GFAP阳性细胞数减少,Piezo1蛋白表达量上升。脊髓损伤大鼠损伤组织Piezo1蛋白表达显著高于空白对照(sham)组。40 k Pa基质刚度条件下沉默Piezo1后,DCX阳性细胞数减少,而GFAP阳性细胞数增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。机制研究发现,沉默Piezo1导致IV型胶原及纤连蛋白表达下降。重组纤连蛋白逆转了Piezo1 sh RNA对NSCs分化的影响,即DCX阳性细胞数增加,而GFAP阳性细胞数减少。结论 综上可见,硬基底刚度通过促进Piezo1蛋白表达,上调IV型胶原及纤连蛋白表达,从而调控NSCs细胞分化。本研究为基于生物材料治疗脊髓损伤提供了新的视角。

氯离子通道蛋白1调控放射抵抗食管鳞癌细胞放射敏感性的机制

目的:探讨氯离子通道蛋白1(chloride intracellular ion channel 1,CLIC1)对食管鳞癌细胞获得性放射抵抗特性的影响及作用机制。方法:采用蛋白印记法及逆转录聚合酶链式反应法检测Eca109R50Gy细胞中CLIC1的表达水平。采用CLIC1小分子特异抑制剂IAA-94(indanyloxyacetic acid-94,IAA-94)抑制Eca109R50Gy细胞中CLIC1功能,通过克隆形成试验、流式细胞仪分析对比CLIC1功能抑制前后的细胞存活分数(SF)、细胞凋亡比率及细胞周期分布。结果:Eca109R50Gy细胞中CLIC1在转录水平及蛋白水平均呈现显著高表达(P<0.001);CLIC1功能抑制组Eca109R50Gy细胞克隆形成能力明显受抑(SF_(IAA-94vs) SF_(Control),P<0.001),而细胞凋亡比率显著增高(P<0.01)。CLIC1功能抑制组Eca109R50Gy细胞G2/M期细胞比例显著增加(P<0.01)。结论:CLIC1在放射抵抗的食管鳞癌细胞中高表达并与其获得性放射抵抗特性有关,抑制CLIC1功能可增强放射抵抗的食管癌细胞对放射线的敏感性,其增敏机制与影响细胞周期分布有关。

氯离子通道蛋白1的细胞转染定位

目的 利用重组的胞内氯离子通道蛋白CLIC 1蛋白的过表达来了解该蛋白质在细胞中的定位。方法 用免疫荧光的方法观察CLIC 1蛋白在细胞中的定位。结果 荧光显微镜观察表明CLIC 1蛋白虽然在细胞核中分布较为集中 ,在细胞质中也有相当的分布。结论 实验结果为进一步的了解CLIC

细胞内氯离子通道蛋白-1表达与胃癌侵袭转移的相关性研究

【目的】探讨胃癌组织细胞内氯离子通道蛋白-1(CLIC1)蛋白表达与胃癌侵袭转移的关系。【方法】检测94例胃癌和相应癌旁组织中CLIC1 mRNA及蛋白的表达并分析其差异性和胃癌组织CLIC1蛋白表达与临床病例特征的相关性。采用多因素Cox比例模型分析胃癌预后不良的影响因素。【结果】CLIC1蛋白在胃癌组织中的阳性表达率为86.17%(81/94),显著高于癌旁组织的24.47%(23/94)(P<0.01)。胃癌组织CLIC1蛋白表达与患者年龄、性别、远处转移和肿瘤部位无关,而与组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.05)。CLIC1mRNA在胃癌组织中的表达水平较癌旁正常组织明显升高(P<0.05)。CLIC1低表达的胃癌患者的中位生存时间为29个月,显著高于高表达患者的25个月(P<0.01),且低表达者的五年生存率显著长于高表达者(P<0.05)。浸润深度、淋巴结转移、部位(胃窦)、TNM分期与CLIC1表达均是胃癌的预后不良的独立影响因素(均P<0.01)。【结论】CLIC1可能在胃癌的发生发展过程中发挥重要作用,CLIC1蛋白的高表达与胃癌的侵袭转移密切相关。

TMEM16A钙激活氯离子通道在Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞的表达及其电生理特性研究

目的:探讨跨膜蛋白16A(TMEM16A)钙激活氯离子通道在Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮(FRT)细胞的表达及其电生理特性。方法:构建pUB6/V5-TMEM16A真核表达载体。脂质体方法转染TMEM16A至FRT细胞,同时优化脂质体和载体的量和比例,获得最佳转染效率和表达效果,杀稻瘟菌素(blasticidin)进行抗生素筛选,获取稳定表达TMEM16A的FRT细胞株。RT-PCR和免疫荧光检测TMEM16A于FRT细胞的表达情况;倒置荧光显微镜下观察TMEM16A在FRT细胞中的表达和定位;应用全细胞膜片钳技术和卤族元素敏感的荧光蛋白YFPH148Q/I152L检测TMEM16A钙激活氯离子通道的功能。结果:BamHⅠ和XbaⅠ双酶切的琼脂糖凝胶电泳和测序结果表明目的基因TMEM16A成功克隆到真核表达载体pUB6/V5中;RT-PCR和免疫荧光实验结果表明经杀稻瘟菌素筛选后的FRT细胞在mRNA和蛋白水平表达TMEM16A,倒置显微镜下观察结果表明TMEM16A在FRT细胞膜上有表达;应用全细胞膜片钳技术和卤族元素敏感的荧光蛋白YFP-H148Q/I152L证实稳定表达于FRT细胞的TMEM16A具有经典的钙激活氯离子通道特性。结论:FRT细胞可高效表达TMEM16A。TMEM16A是钙激活氯离子通道的分子基础。

氯离子通道-3反义寡核苷酸对内皮素-1促增殖体外培养的牛角膜内皮细胞的抑制作用

目的观察氯离子通道-3(chloride channel3,ClC-3)反义寡核苷酸(antisense oli-gonucleotides,AS-ODN)对内皮素1(endothelin-1,ET-1)促增殖体外培养的牛角膜内皮细胞(bovine corneal endothelial cells,BCECs)的抑制作用。方法 BCECs细胞悬液接种培养12h后,通过脂质体介导转染不同浓度的ClC-3寡核苷酸。体外培养BCECs24h后加入200pmol.L-1ET-1,继续培养48h。通过倒置荧光显微镜观察BCECs寡核苷酸的摄取。采用逆转录聚合酶链反应、免疫印迹法检测ClC-3mRNA和蛋白的表达。采用MTT法观察BCECs增殖状况,计算细胞存活率,同时应用流式细胞仪检测细胞周期时相的变化,计算细胞增殖指数。结果寡核苷酸可被培养的BCECs摄取。ClC-3mRNA与蛋白的表达变化呈平行关系。与不加时相比,ClC-3AS-ODN浓度依赖性地减少BCECsClC-3mRNA和蛋白的表达,同样也浓度依赖性地降低BCECs MTT吸光度值(OD值)和细胞存活率。经100mg·mL-1ClC-3AS-ODN处理后,与对照组相比,细胞G0/G1期细胞比例明显增高,S期及G2期细胞比例则明显降低,出现明显的凋亡峰,增殖指数明显下降。结论 ClC-3AS-ODN可能通过减少ClC-3mRNA和蛋白的表达,浓度依赖性抑制ET-1对体外培养BCECs的增殖作用,并使细胞周期停滞在G1期。

MicroRNA-7-5p通过mTORC2/SGK-1信号通路负向调控人肺泡上皮细胞钠离子通道

目的:探讨microRNA-7-5p通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)/血清糖皮质激素诱导激酶-1(SGK-1)信号通路负向调控人肺泡上皮细胞钠离子通道(ENaC)的机制。方法:对人类非小细胞肺癌肺泡上皮细胞系A549细胞转染microRNA-7-5p模拟剂,设为microRNA-7-5p组,阴性对照组A549细胞转染与目的基因序列无同源性的不表达microRNA-7-5p的阴性对照剂。雷帕霉素组在A549细胞培养基中加入雷帕霉素。PP242组在A549细胞培养基中加入PP242。空白对照组仅加入lipo fectamineTM 2000试剂。采用RT-qPCR检测各组SGK-1 mRNA;免疫印迹法检测SGK-1蛋白、ENaC蛋白的表达量。比较各组的microRNA-7-5p表达水平、SGK-1 mRNA及蛋白表达量、ENaC蛋白表达量。结果:microRNA-7-5p组的microRNA-7-5p表达水平高于空白对照组、阴性对照组、雷帕霉素组和PP242组,A549细胞转染成功上调microRNA-7-5p表达水平(P<0.05)。microRNA-7-5p组中,SGK-1 mRNA水平、SGK-1及ENaC-α、ENaC-β、ENaC-γ蛋白表达量均低于空白对照组、阴性对照组、雷帕霉素组(P<0.05)。结论:microRNA-7-5p可能通过mTORC2/SGK-1信号通路负向调控ENaC。

ClC-1氯离子通道的非均衡性门控及其对细胞外氯离子浓度的依赖性

Cl C- 1是一种具有电压依赖门控特性的氯离子通道。但这种通道的门控机制与其他电压门控的阳离子通道有很大的差别。为探讨 Cl C- 1离子通道的门控机制 ,本文应用爪蟾卵母细胞异源性表达野生型 Cl C- 1氯离子通道 ,并通过改变细胞外氯离子浓度 ,对其门控机制进行了研究。结果表明 ,Cl C- 1氯离子通道的门控具有对电压和氯离子浓度的双重依赖性。这提示一种非均衡性的门控机制。

氯离子通道蛋白1在心肌纤维化进程中的表达特征

目的探讨氯离子通道蛋白1(ANO1)在心肌纤维化进程中的表达特征,为抑制心肌纤维化寻找新的靶点。方法采用冠状动脉结扎法制作大鼠心肌梗死模型,1周后取心肌梗死组和假手术组大鼠左心室组织,采用免疫组织化学染色、免疫荧光双标记检测梗死区和正常组织ANO1表达的变化;体外分离培养心肌成纤维细胞,采用免疫荧光标记、Real-time PCR和Western blotting检测心肌成纤维细胞中ANO1表达情况。结果制造模型1周后心肌梗死区ANO1表达明显增强,并与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)共表达; ANO1蛋白明显表达于心肌成纤维细胞的核膜和胞质中,且表达强度和α-SMA具有相同的趋势;与刚分离贴壁心肌纤维细胞相比,ANO1在培养和48h后的心肌成纤维细胞中表达量明显增强。结论 ANO1在心肌成纤维细胞转化为成肌纤维细胞过程中表达量增加,提示ANO1可能在心肌纤维化进程中发挥重要调控作用。

细胞内氯离子通道蛋白4与恶性肿瘤发生发展的研究进展

细胞内氯离子通道蛋白4(chloride intracellular channel 4,CLIC4)是细胞内氯离子通道家族成员之一,广泛分布于细胞内,定位于多种细胞器如线粒体、内质网及细胞核和细胞质中,在多种肿瘤组织中表达异常,与肿瘤细胞的黏附、分化、凋亡等生物学行为密切相关,研究其在肿瘤发生、发展过程中的具体作用,将为多种肿瘤的诊断、治疗及预后提供新的依据。

细胞内氯离子通道蛋白2的定位与表达

目的研究细胞内氯离子通道蛋白2(CLIC2)在细胞中的定位与表达。方法以含人CLIC2全长cDNA序列的菌液为模板,PCR法构建CLIC2真核表达载体,利用免疫荧光和Western blot法检测其在细胞株中的定位与表达。结果细胞免疫荧光结果显示CLIC2在细胞质、细胞核中均有分布;Western blot的结果证明其在细胞中能有效地表达。结论 CLIC2蛋白在细胞质和细胞核中均大量分布,为进一步了解CLIC2的功能奠定了基础。

细胞外氯离子浓度对大鼠ClC-1通道去激活动力学特性的影响

为探讨ClC 1通道的门控机制 ,实验应用爪蟾卵母细胞异源性表达大鼠野生型ClC 1(WTrClC 1)通道基因 ,并使用双电极电压钳法记录通道电流。通过改变细胞外氯离子浓度 ,采用双指数拟合的方法分析通道去激活电流 ,对其去激活门控动力学特性进行了研究。结果表明 ,降低细胞外氯离子浓度可增加快速去激活电流成分 ,减少慢速去激活成分 ;同时 ,慢速去激活和快速去激活电流的时间常数都显著减小 ,说明细胞外氯离子浓度的改变可影响通道去激活动力学参数 ,从而改变通道的门控过程。

地尔硫卓通过下调钙激活氯离子通道抑制肝癌细胞增殖和运动

目的观察钙离子通道抑制剂地尔硫卓对肝癌MHCC97H、7402细胞增殖和运动侵袭能力的作用,探讨其相应机制。方法采用不同浓度地尔硫卓(0、25、50、100、200、400μmol/L)干预肝癌MHCC97H、7402细胞不同时间(12、24、48 h)后,用MTT法测定地尔硫卓对肝癌细胞增殖的影响,体外细胞划痕实验检测处理后肝癌细胞运动侵袭能力;通过RT-PCR和免疫细胞化学检测地尔硫卓对肝癌细胞中TMEM16A mRNA和蛋白表达水平的影响。结果地尔硫卓能够有效抑制肝癌MHCC97H、7402细胞的增殖和运动侵袭能力,且具有一定的时间和浓度依赖性特点(P<0.05)。其中,100μmol/L浓度的地尔硫卓作用24 h对MHCC97H肝癌细胞抑制较明显,TMEM16A mRNA和蛋白表达减少(P<0.05),而50μmol/L浓度的地尔硫卓作用48 h对7402肝癌细胞抑制较明显,TMEM16A mRNA和蛋白表达减少(P<0.05)。结论地尔硫卓能一过性抑制MHCC97H、7402肝癌细胞侵袭,这种作用可能与其通过调节钙离子通道TMEM16A的mRNA和蛋白表达而发挥肿瘤抑制作用有关。

氯离子/钾离子通道阻滞剂对成骨细胞增殖的影响

目的观察氯离子和钾离子转运体阻滞剂及氯离子/钾离子通道阻滞剂是否影响MC3T3-E1成骨细胞的增殖。方法采用体外培养MC3T3-E1成骨细胞,分别加入D IOA(氯离子和钾离子转运体阻滞剂,100和500μM)、NPPB(10和300μM,氯离子通道阻滞剂)和喹啉(10和500μM,钾离子通道阻滞剂),检测细胞增殖情况。结果 D IOA抑制MC3T3-E1成骨细胞的增殖,不同浓度的NPPB和喹啉同样也能够减少MC3T3-E1成骨细胞的增殖。结论细胞内氯离子的浓度升高或降低都会抑制MC3T3-E1成骨细胞的增殖。

钙激活氯通道蛋白ANO1在小鼠主动脉平滑肌细胞的表达及其功能鉴定

探讨钙激活氯通道蛋白ANO1在C57BL/6小鼠主动脉平滑肌细胞中的表达及其功能特性。运用胶原酶消化法获得原代培养的小鼠主动脉平滑肌细胞,流式细胞术检测平滑肌细胞纯度;应用RT-PCR检测主动脉平滑肌细胞ANO1 mRNA的表达;免疫印迹检测ANO1蛋白在主动脉平滑肌细胞的表达情况;应用荧光淬灭动力学实验检测ANO1钙激活氯通道的功能特性。原代培养成功获得主动脉平滑肌细胞;RT-PCR结果分析表明,主动脉平滑肌细胞在mRNA水平有ANO1表达;免疫印迹显示主动脉平滑肌细胞蛋白水平有ANO1表达;荧光淬灭动力学实验证实表达在主动脉平滑肌细胞的ANO1具有阴离子转运功能,即钙激活氯通道典型特性。小鼠主动脉平滑肌细胞表达的ANO1是钙激活氯通道的分子基础。

人乳头瘤病毒E6蛋白通过上调氯离子蛋白通道5的表达促进宫颈癌细胞迁移

目的:探讨人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)E6蛋白与氯离子通道蛋白5(chloride voltage-gated channel 5,CLCN5)之间的关系以及CLCN5对宫颈癌细胞迁移的影响。方法:采用RNA干扰技术敲低HPV E6基因,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹法检测敲低HPV E6后宫颈癌HeLa细胞中CLCN5 mRNA及蛋白的表达水平。通过PCR扩增CLCN5基因片段,并将其克隆至表达载体pCDNA3.1-3×Flag(简称pCDNA3.1)质粒中,构建重组质粒pCDNA3.1-CLCN5。将目的质粒pCDNA3.1-CLCN5及其对照pCDNA3.1质粒分别转染宫颈癌HeLa细胞,蛋白质印迹法检测CLCN5蛋白的表达。Transwell迁移实验检测过表达CLCN5对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响。同时,将CLCN5的小干扰RNA及其阴性对照分别转染宫颈癌HeLa细胞,Transwell迁移实验检测敲低CLCN5对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响。结果:RT-qPCR和蛋白质印迹检测结果显示,敲低HPV E6可显著降低CLCN5的mRNA和蛋白表达水平。质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒pCDNA3.1-CLCN5构建成功。蛋白质印迹检测结果显示CLCN5蛋白在宫颈癌HeLa细胞中被有效过表达或敲低。Transwell迁移实验结果表明,过表达CLCN5可促进宫颈癌细胞的迁移,敲低CLCN5可抑制宫颈癌细胞的迁移。结论:HPV E6蛋白通过上调CLCN5的表达促进宫颈癌细胞迁移。

基于嘌呤配体P2X门控离子通道型受体7的资生肾气丸镇痛机制研究

目的:探索资生肾气丸对醋酸致小鼠扭体模型的镇痛作用。方法:将42只小鼠随机分为7组,分别给予相应药液灌胃,末次灌胃1 h后造模,建立醋酸致小鼠扭体模型。观察小鼠扭体次数,计算其扭体抑制率,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组小鼠血清白细胞介素-1β(IL-1β)、前列腺素E 2(PGE 2)、神经生长因子(NGF)含量,采用实时PCR(RT-PCR)检测嘌呤配体P2X门控离子通道型受体7(P2X7R)mRNA、Nod样受体蛋白3(NLRP3)mRNA、NIMA相关激酶7(NEK7)mRNA的表达情况。结果:与模型组比较,随着时间的增加,资生肾气丸低剂量、中剂量、高剂量均可抑制小鼠扭体反应,降低扭体次数,增加小鼠扭体抑制率,降低小鼠血清中IL-1β、PGE_(2)、NGF的含量,降低P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表达以抑制疼痛反应,以高剂量效果最优(P<0.05),与吲哚美辛、痛风舒片疗效相近。结论:资生肾气丸高剂量对小鼠血清疼痛因子的降低效果显著,其机制可能与嘌呤配体P2X门控离子通道型受体7信号通路有关。

钙激活氯通道ANO1在小鼠心肌细胞的表达及其功能鉴定

目的:探讨钙激活氯通道蛋白anoctamin 1(ANO1)在小鼠原代培养心肌细胞中的表达及其功能特性。方法:采用胰酶与胶原酶共同消化,联合2次差速贴壁法获得C57BL/6小鼠原代心肌细胞;并用免疫荧光染色法检测α-横纹肌肌动蛋白,以鉴定心肌细胞纯度;应用RT-PCR检测小鼠心肌细胞ANO1 mRNA的表达;免疫印迹检测ANO1蛋白在小鼠心肌细胞的表达情况;应用荧光淬灭动力学实验检测ANO1钙激活氯通道的功能特性。结果:RT-PCR结果表明原代培养的小鼠心肌细胞表达ANO1 mRNA。免疫印迹实验结果显示原代培养的小鼠心肌细胞表达ANO1蛋白。荧光淬灭动力学实验证实表达于小鼠心肌细胞的ANO1具有钙激活氯通道典型的阴离子转运功能特性。结论:ANO1在小鼠心肌细胞中有明确表达,并具有钙激活氯离子通道特性,提示ANO1是钙激活氯通道的分子基础。