哮喘患者全血在尘螨主要过敏原刺激下辅助性T淋巴细胞1/辅助性T淋巴细胞2细胞内细胞因子的表达与偏移

目的对尘螨过敏的哮喘儿童外周全血体外持续给予尘螨主要过敏原Der p和Der f刺激,观察辅助性T淋巴细胞(Th)内细胞因子的表达,探讨过敏原暴露对Th1/Th2偏移的影响。方法选择尘螨皮试阳性的哮喘患者23例,采集全血,体外与尘螨主要过敏原Der p、Der f共同孵育培养8h,以单克隆抗体对T淋巴细胞表面抗原、细胞内白介素(IL)-4,干扰素(IFN)-γ进行标记,应用流式细胞技术检测Th细胞内细胞因子的表达。结果哮喘患者全血体外Der p、Der f持续暴露后(过敏原暴露组),Th0、Th1、Th2表达率分别为(0.83±0.45)%、(10.70±4.42)%、(2.16±1.17)%,非过敏原暴露组Th0、Th1、Th2表达率分别为(0.93±0.52)%、(9.19±3.75)%、(1.67±0.82)%。过敏原暴露组Th2表达率显著高于非过敏原暴露组(P<0.05),而两组Th0、Th1表达率的差异无显著性(P>0.05)。过敏原暴露组因Th2增高,Th1/Th2比例降低,Th1/Th2平衡向Th2偏移,与非过敏原暴露组的差异有显著性(P<0.01)。结论Der p、Der f对Th细胞有明显的选择性,过敏原的持续暴露促进Th2优势表达,Th1/Th2平衡向Th2转化,可能是引起哮喘症状反复和加重的机制之一。因此,过敏原的回避和特异性的脱敏治疗也是哮喘治疗的措施之一,应予以必要的重视。

流式细胞术检测单个淋巴细胞内细胞因子表达及其临床应用

目的 寻找一种准确、敏感的检测 T淋巴细胞内细胞因子水平的方法 ,为研究 T细胞极化状态在疾病发生发展过程中的作用提供可靠的手段。 方法 用 PMA、 ionomycin作刺激剂 ,刺激全血中淋巴细胞表达细胞因子 ,以 mon-ensin阻断细胞因子分泌至胞外 ,应用两种免疫荧光抗体同时标记淋巴细胞的膜表面特异的分子和表达并被阻滞在胞内的细胞因子 ,然后用流式细胞仪进行检测和分析。 结果 本方法检测 1 8例正常人淋巴细胞的分泌细胞因子水平 ,其中CD4 + T淋巴细胞中 Th1占 1 9.5 1 %± 4 .96% ,Th2占 1 5 .66%± 3.95 % ;CD8+ T淋巴细胞中 Tc1占 1 6.2 2 %± 1 .78% ,Tc2占 9.2 0 %± 1 .96% ;而 1 2例妊高征孕妇的 Th1、Tc1百分比例明显高于正常人 ( P<0 .0 1 ) ,Th2的比例显著低于正常人( P<0 .0 1 )。 结论 双抗体标记流式细胞仪检测法可以客观、准确地检测淋巴细胞表达细胞因子的水平 ,判断 T淋巴细胞的极化状态。妊高征患者与正常人相比存在 T淋巴细胞的极化水平异常 。

检测细胞内细胞因子的生物素-链霉亲和素免疫细胞化学法的建立及初步应用

目的 建立检测细胞内细胞因子的生物素-链霉亲和素免疫细胞化学法（BSA—ICC）并作临床初步应用。方法 从健康人外周血单个核细胞（PBMC）中富集CD4细胞，加入莫能霉素，用不同浓度的佛波醇酯（PMA）和钙离子载体（A23817）诱导CD4细胞不同时间，比较其胞内表达白细胞介素-2（IL-2）／白细胞介素-4（IL-4）的细胞百分率，确定最适诱生条件；用不同稀释度的IL-2McAb、IL-4McAb、不同浓度的生物素化羊抗鼠IgG（bio-SAMIgG）和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（HRP-SA）作棋盘配比试验，确认McAb、bio-SAMIgG和HRP—SA的最适浓度，根据上述结果建立了检测细胞内细胞因子的BSA—ICC法。用所建方法检测20名健康献血员、16例妇科良性疾病和18例妇科恶性肿瘤患者CD4细胞中表达IL-2／IL-4细胞的百分率。结果 诱导CD4细胞胞内表达IL-2和IL-4的细胞最高百分率的PMA和A23817浓度分别为100μg/L和2．0μmol／L，诱导高峰时间分别为5和7h，BSA-ICC法中所用IL-2McAb、IL-4McAb最适稀释度分别为1：20和1：40，bio—SAMIgG和HRP-SA浓度分别为10～15μg/ml和15μg/ml。20名健康献血员、16例妇科良性疾病和18例妇科恶性肿瘤患者CD4细胞中分泌IL-2的细胞百分率分别为（45．90±4．39）％、（37．28±2．67）％和（25．19±3．49）％，分泌IL-4的细胞百分率分别为（10．5±1．50）％、（9．94±1．06）％和（16．13±2．50）％，IL-2^＋CD4^＋／IL-4^＋CD4^＋比值分别为3．65±0．94、3．55±0．76和1．27±0．26。结论 所建方法可用于T辅助（Th）细胞亚型的测定，从而判断Th细胞的极化状态。妇科恶性肿瘤患者Th细胞功能失衡极化，呈Th2反应，可能与恶性肿瘤的发生有关。

视神经脊髓炎的CD4^+和CD8^+T细胞内细胞因子的分析

目的:探讨视神经脊髓炎(NMO)的免疫反应类型以及在疾病的复发期和缓解期其免疫反应类型的变化情况。方法:利用流式细胞仪并采用细胞内抗原染色的方法对22名临床诊断为NMO的患者(复发期患者8名;缓解期患者14名)进行CD4+和CD8+T细胞内细胞因子白介素(IL)-13I、L-5测定并加以分析。20名健康人为对照组。结果:与健康对照组比较,NMO组的CD4+IL-13+T细胞和CD8+IL-13+T细胞显著增加(P<0.05),但将复发期和缓解期分开来分析时发现仅仅在复发期显著增加,在缓解期无明显变化(P>0.05)。CD4+IL-5+T细胞和CD8+IL-5+T细胞在复发期和缓解期均无显著变化(P>0.05)。结论:NMO的发病及发病阶段与II型辅助性T细胞(Th2)和II型细胞毒性T细胞(Tc2)所分泌的IL-13有关,而与IL-5无关。同时也说明对T细胞内细胞因子进行测定在分析神经系统自身免疫性疾病的发病过程有一定的意义。

慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病脑脊液中T细胞内细胞因子的分析

目的探讨慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)患者的脑脊液(CSF)中CD4+T细胞内部分细胞因子的变化特点。方法对10位CIDP患者和12位非炎症性神经疾病(OND)患者用流式细胞仪测定其CSF中和周围血(PB)中CD4+T细胞内细胞因子IFN-γ和IL-4。结果与OND相比较,在CIDP的CSF中CD4+IFN-γ+IL4﹣T细胞的百分比显著地提高,CD4+T细胞的细胞内IFN-γ/IL4比例也明显增加。同时CSF中T细胞内细胞因子的比率较PB中要高。结论CIDP是以I型辅助性T细胞的反应占优势,同时也说明利用流式细胞仪测定CIDP的CSF中CD4+T细胞的IFN-γ、IL-4标记是有意义的。

视神经脊髓炎的CD4^+T细胞内细胞因子的分析

目的探讨CD4+T细胞内细胞因子在视神经脊髓炎及其临床分期中的特点及变化。方法对视神经脊髓炎和健康对照的末梢血中CD4+T细胞内的细胞因子染色并利用流式细胞仪进行测定和分析。结果与健康对照比较视神经脊髓炎CD4+IFNγ+IL4-细胞在复发期和缓解期均显著增加。结论视神经脊髓炎是以I型辅助性T细胞的反应占优势,在其复发期和缓解期这种反应的优势均明显提高。同时也说明利用流式细胞仪对T细胞亚型进行测定在神经系统自身免疫性疾病的分析过程中有一定的参考价值。

口腔癌患者手术前后T细胞亚群、T细胞内细胞因子及免疫球蛋白的检测分析

目的:探讨口腔癌患者手术前后T细胞亚群、T细胞内细胞因子及免疫球蛋白的水平变化。方法:选取2017年1~12月我院收治的40例口腔癌患者作为观察组,选取同期于我院体检的40例健康志愿者作为对照组,检测观察组手术前后T细胞亚群、T细胞内细胞因子及免疫球蛋白的水平变化,并与对照组做比较分析。结果:观察组手术前CD3^+、CD4^+、CD4^+/CD8^+低于对照组,CD8^+高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);观察组手术后CD3^+、CD4^+、CD4^+/CD8^+分别为(64.98±3.88)%、(42.40±3.53)%、(1.56±0.41),均较手术前升高(P<0.05),但仍低于对照组(P<0.05);观察组手术后CD8^+为(27.25±3.54)%,较手术前降低(P<0.05),但仍高于对照组(P<0.05)。观察组手术前INF-γ^+、CD4^+/INF-γ^+、IL-2^+、CD4^+/IL-2^+均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);观察组手术后INF-γ^+、CD4^+/INF-γ^+、IL-2^+、CD4^+/IL-2^+分别为(0.15±0.06)%、(0.07±0.03)%、(0.47±0.13)%、(0.16±0.11)%,均较手术前升高(P<0.05),但仍低于对照组(P<0.05)。观察组手术前、手术后IgA、IgG分别为(2.01±0.13)、(1.81±0.12)、(10.53±3.12)、(8.41±2.01)g/L,均较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05);观察组手术前后IgA、IgG、IgM均无显著变化(P>0.05)。结论:手术可有效改善口腔癌患者T淋巴细胞亚群及T细胞内细胞因子水平,对提高免疫功能具有积极的促进作用。

应用四聚体酶联免疫斑点法和细胞内细胞因子染色法检测HIV-1感染者体内特异性细胞毒性T淋巴细胞的研究

目的应用四聚体(tetramer)、酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞内细胞因子染色(ICCS)方法研究HIV-1感染者细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的数量和功能。方法应用三种tetramer检测14例HLA-A2阳性的HIV-1感染者外周血中特异性CTLs的频率,同时采用SL9(SLYNTVATL)体外冲击HIV-1感染者的外周血单核细胞(PBMCs)。通过ELISPOT和ICCS方法检测产生γ-干扰素(IFN-γ)的CTLs,初步分析特异性CTLs在HIV-1感染中的作用。结果Tetramer SL9、IV9和YI9检测出的特异性CTLs占CD8+T细胞的百分比范围分别为0.06%-3.27%,0.05%-0.57%和0.09%-0.66%;其检出阳性率分别为11/14、10/14和5/7。ELISPOT和ICCS检测的产生IFN-γ的细胞近似,但远低于tetramer检测出的病毒特异性CTLs的数量。结论Tetramer可以敏感地检测出特异性CTLs。ELISPOT和ICCS则是研究CTLs功能的重要手段。联合使用三种方法可以更准确地评价HIV-1感染者体内CTLs的特征及其临床意义。

再生障碍性贫血患者Th及NKT细胞IFN-γ和IL-4的表达及意义

目的:探讨Th及NKT细胞内细胞因子(Intracellular cytokine,ICK)在再生障碍性贫血(Aplastic anemia,AA)发病中所起的作用。方法:流式细胞术(FCM)检测Th细胞表面CD3+CD4+分子、NKT细胞表面CD3+CD16+56+分子,细胞内染色技术检测Th、NKT细胞内IFN-γ和IL-4水平。结果:AA患者外周血Th细胞减少(P<0.01),细胞内CD3+CD4+IFN-γ+、CD3+CD4+IL-4+均增高,Th1/Th2增高(P<0.01);NKT细胞增多(P<0.05),NKT细胞内IL-4+水平升高(P<0.05),IFN-γ+水平无统计学差异。结论:AA的发病与T淋巴细胞异常密切相关,是一种Th1型反应。NKT细胞可代偿调节AA患者IFN-γ和IL-4比例。

类风湿性关节炎患者外周血细胞内IFN-γ和IL-4的三色流式分析

目的 用全血在单个细胞水平上研究类风湿性关节炎 (RA)患者TH1 TH2 细胞因子分泌模式及其与疾病活动程度的关系。方法 用三色流式细胞术检测RA患者外周血细胞内细胞因子IFN γ和IL 4的表达情况。结果 RA患者外周血IFN γ+ 细胞百分率及IFN γ+ /IL 4 + 细胞比值比健康人明显增高 ,IFN γ+ /IL 4 + 比值与患者Stoke指数呈正相关 (r=0 .86 10 ,P <0 .0 1)。结论 RA患者外周血中细胞因子分泌模式朝TH1 偏移 ,IFN γ+ /IL 4 + 比值与疾病活动性相关 ,TH1 TH2

人类巨细胞病毒特异性CD8^+T细胞IFN-γ和穿孔素水平的检测

目的研究人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽(pp65495503,NLV)特异性CD8+T细胞的功能特性。方法将HLAA2NLV四聚体染色与细胞内细胞因子或穿孔素染色相结合,以流式细胞仪直接分析NLV特异性CD8+T细胞内穿孔素的表达水平,或者在NLV抗原肽刺激6h后分析γ干扰素(IFNγ)的表达水平。结果NLV抗原肽能诱导hCMV特异性CD8+T细胞分泌IFNγ,不同供者特异性CD8+T细胞产生IFNγ的比率存在较大差异(55.69±17.64)%,当NLV抗原肽质量浓度为10μgmL时IFNγ阳性细胞百分率最高;未经刺激的特异性CD8+T细胞内表达较高水平的穿孔素(53.90±16.41)%。结论识别单一表位的hCMV特异性CD8+T细胞合成IFNγ和穿孔素的能力存在多样性。

类风湿关节炎患者外周血Th0/Th1/Th2细胞亚群失衡的研究

目的研究类风湿关节炎(RA)患者外周血辅助性T细胞(T-helpercell,Th)亚群的状态,以探讨Th细胞亚群(Th0/Th1/Th2)在RA发病机制中的作用。方法利用流式细胞仪检测技术,采用三色标记法,在外周血单个细胞水平上同时进行细胞膜表面(CD4)和细胞内细胞因子[白细胞介素(IL)-4、干扰素(IFN)-γ]的测定,检测33例活动期RA患者和16名正常对照者外周血中T细胞亚群(CD3+/CD4+/CD8+T细胞)及Th细胞亚群的比例;并分析早期RA组(病程≤2年,17例)与非早期RA组(病程>2年,16例),骨侵蚀组(19例)与无骨侵蚀组(14例),类风湿因子(RF)阳性组(23例)与RF阴性组(10例)Th细胞亚群的比例。结果①与正常对照组相比,RA组外周血CD3+CD4+T淋巴细胞升高(P<0.05);Th0、Th1细胞的比例降低(P<0.05);T细胞亚群、Th细胞亚群变化与RA疾病活动相关;②与非早期RA组相比,早期RATh1细胞、Th1/Th2比值升高,Th2降低(P<0.05),早期RA患者Th1细胞比例与血沉、C-反应蛋白、晨僵时间呈正相关;非早期RA患者Th2细胞比例与血沉、晨僵时间呈正相关;③与无骨侵蚀组比较,有骨侵蚀组Th1细胞、Th1/Th2明显降低,Th2细胞升高(P<0.05);④RF阳性组与阴性组间Th细胞亚群及Th1/Th2比值差异均无统计学意义。结论CD4+T细胞在RA的发病机制中起着重要的作用,RA外周血中存在着Th细胞亚群的不平衡,Th细胞失衡的模式在RA的病程中并不是固定的,早期RA外周血以Th1细胞为主,慢性RA则以Th2细胞相对占优势,并与疾病的活动性、骨侵蚀有密切关系。

细胞内细胞因子——自身免疫性疾病的新视野

自身免疫是机体免疫系统对自身抗原发生免疫应答，产生自身抗体和（或）自身致敏淋巴细胞的一种现象，其对一定条件下机体免疫系统的正常自稳性调节具重要意义。当自身免疫异常时，自身抗体和（或）自身反应性淋巴细胞会攻击表达靶抗原的组织或器官，引起自身免疫性疾病（AID）。至今已有30余种疾病被列为AID，但对AID的病因和发病机制尚不清楚，一般认为，主要是各种内外因素打破机体免疫系统的自身耐受，通过自身过度免疫应答引起组织或器官损伤。这些因素可能包括机体内在因素（如遗传背景、自身抗原发生改变等）和外在因素（如发生各种病原微生物感染；超抗原或非特异性T、B细胞多克隆刺激剂作用等）。随着分子生物学和免疫学技术的飞速发展，对AID研究日益深入。特别是近年新技术的应用、新的特异性标志物的发现、发病免疫机理的深入探讨、新的靶分子或位点的寻找都为AID研究带来了新契机，同时也有利于改进和提高AID临床诊断和治疗。对AID的临床特征、实验室诊断技术和诊断指标进展见参考文献，在此仅重点阐述近几年与AID密切相关的细胞内细胞因子（Intracellular cytokine，ICK）的研究。

缺氧诱导的上皮间质转化通过诱导肝细胞癌免疫抑制微环境促进肿瘤转移

【据《Cancer Res》2016年2月报道】题：缺氧诱导的上皮间质转化通过诱导肝细胞癌免疫抑制微环境促进肿瘤转移（作者Ye LY等）门静脉癌栓是肝细胞癌（HCC）发生转移的重要危险因素之一,与患者预后密切相关。门静脉癌栓的存在经常伴有肿瘤微环境的缺氧,进而加速肿瘤转移,但目前其发生机制仍不清楚。最近的证据表明,缺氧诱导因子-（-1）α诱导上皮间质转化进而促进肿瘤细胞转移。来自浙江大学医学院的Ye等做了相关研究,探讨是否缺氧诱导的上皮间质转化可影响肿瘤微环境中的免疫细胞,进而促进肿瘤免疫抑制。

脑胶质瘤患者TH_1/TH_2细胞的平衡偏移及意义

目的 :探讨脑胶质瘤患者外周血中T辅助淋巴细胞 (TH )亚群TH1/TH2 细胞的平衡变化及其在胶质瘤发病机制中的作用。方法 :采用单细胞内细胞因子染色酶联免疫斑点法从单个细胞水平测定 2 6例脑胶质瘤患者外周血TH1、TH2 细胞的数目 ,并设健康对照组。结果 :与正常对照组比较 ,胶质瘤患者TH1、TH1/TH2 比值均明显降低 (P <0 0 1) ,而TH2 则明显升高 (P <0 0 1) ,且恶性程度愈高 ,上述指标变化愈明显。结论 :脑胶质瘤患者存在TH2 占优势的平衡偏移 ,这种偏移在胶质瘤发生、发展过程中起着重要的作用。纠正TH1/TH2 细胞的平衡偏移 。

二肽酰肽酶-4抑制剂通过PKA/NF-κB信号通路调节LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的实验研究

目的探讨二肽酰肽酶-4(DPP-4)竞争性抑制剂沙格列汀对LPS诱导的小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)炎症反应的调节作用及相关的分子机制。方法将RAW264.7细胞分为4组,分别为对照组(Control组)、LPS组、LPS+沙格列汀(LPS+SAX组)和LPS+沙格列汀+PKA抑制剂H-89组(LPS+SAX+H-89组)。在干预6小时后使用qPCR法和western blot法对细胞ICAM-1mRNA和蛋白的表达水平进行检测;并采用western blot法对细胞PKA和NF-κB p65活化水平进行分析。结果与Control组相比较,在LPS干预6小时后RAW264.7细胞ICAM-1mRNA和蛋白的表达水平及NF-κB p65活化水平均明显上升,而PKA活化水平明显降低,差异均有统计学意义(P均<0.05);但LPS组较LPS+SAX组ICAM-1表达和NF-κB p65活化水平的增加更明显,而PKA活化下降更加明显,差异均有统计学意义(P均<0.05)。同时发现在LPS诱导状态下沙格列汀对于ICAM-1表达和NF-κB p65活化水平的抑制作用和PKA活化水平的促进作用可被PKA抑制剂H-89显著拮抗,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论本研究显示DPP-4抑制剂可以通过调控PKA/NF-κB信号通路下调LPS诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞的炎症反应,为DPP-4抑制剂应用于炎症性疾病的治疗奠定了初步的理论基础。

囊胚滋养层细胞评分与移植后第7日血β-HCG和妊娠结局的关系

目的分析囊胚滋养层细胞的分级与移植后第7日血β-HCG值和妊娠结局的关系,为将来的单囊胚移植提供理论依据。方法回顾性分析2005年1月至2014年12月在北京协和医院生殖中心进行复苏囊胚移植的患者资料,按照滋养层细胞的级别(A、B、C)分为三组,分析滋养层细胞级别与移植后第7日血β-HCG值的关系,并比较三组的极早期妊娠(生化妊娠而非临床妊娠)丢失率、流产率和继续妊娠率。结果三组患者复苏时年龄、胚胎冻存时间、内膜准备方案和移植日内膜厚度均无显著性统计学差异。移植后第7日的血清HCG值随滋养层细胞级别的降低呈明显的递减趋势,三组分别为(288.0±433.1)、(90.8±172.1)和(60.0±102.9)U/L。C组的极早期妊娠丢失率为30.2%,明显高于A组和B组(分别为11.4%和9.6%)(P<0.05)。三组的流产率无显著的统计学差异,但是A组和B组的继续妊娠率显著高于C组(P均<0.05),而A和B组之间无统计学差异(P>0.05)。进行Logistic回归分析时,发现滋养层细胞质量对极早期妊娠丢失率和继续妊娠率有最好的预测价值。结论囊胚的Gardner评分系统中滋养层细胞质量与移植后第7日血β-HCG值呈正相关,挑选高质量滋养层细胞的囊胚能够避免极早期妊娠丢失,能够提高继续妊娠率。