细胞内钾离子稳态测量技术及其调控机制研究进展

钾离子在细胞内液、细胞外液及亚细胞结构中的分布处于动态平衡,它是细胞内液含量最丰富的阳离子,在细胞外液含量却很少;在亚细胞结构中,钾离子在胞核的浓度最高,细胞基质、线粒体、内质网、溶酶体次之。细胞内钾离子参与细胞形态维持、酶活性调控及能量代谢、遗传物质的生物合成、细胞增殖与死亡、修复和迁移、免疫等多种生命活动的调控;同时细胞内钾离子稳态失衡和肿瘤、急性缺血损伤、自身免疫病、内分泌、神经退行性等疾病发生发展密切相关,因此维持细胞内钾离子稳态具有非常重要的意义,纠正细胞内钾离子稳态失衡为疾病治疗提供了新的方向。本文综述近年细胞内钾离子稳态的基本情况和测量技术的研究进展,并探讨其调控机制及生理和病理意义。

高钾离子引起PC12细胞内游离Ca^(2+)浓度升高的机制

目的：分析高钾离子（Ｋ＋）引起ＰＣ１２细胞内游离钙离子浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）升高的可能机制。方法：利用ＭｉｒａＣａｌＩｍａｇｅＳｙｓｔｅｍ检测［Ｃａ２＋］ｉ，Ｃａ２＋荧光探针为Ｆｕｒａ－２／ＡＭ。结果：（１）ＫＣｌ浓度为３０～１００ｍｍｏｌ／Ｌ时，可剂量依赖性地诱导ＰＣ１２细胞［Ｃａ２＋］ｉ升高；（２）在细胞外无Ｃａ２＋时，高Ｋ＋对ＰＣ１２细胞［Ｃａ２＋］ｉ无影响；（３）Ｌ－型电压门控钙通道阻滞剂维拉帕米、地尔硫和硝苯地平的浓度分别为５×１０－５，１×１０－４和５×１０－３ｍｏｌ／Ｌ时，可完全阻断高Ｋ＋诱导的ＰＣ１２细胞［Ｃａ２＋］ｉ升高，但Ｎ－型电压门控钙通道阻滞剂ω－ｃｏｎｏｔｏｘｉｎＧＶＩＡ在浓度为１×１０－６ｍｏｌ／Ｌ时，对高Ｋ＋诱导的ＰＣ１２细胞［Ｃａ２＋］ｉ升高没有影响；（４）５×１０－５ｍｏｌ／Ｌ维拉帕米对细胞外由无Ｃａ２＋到有Ｃａ２＋过程引起的［Ｃａ２＋］ｉ升高无抑制作用。结论：高Ｋ＋引起ＰＣ１２细胞［Ｃａ２＋］ｉ升高以细胞质膜上Ｌ－型电压门控Ｃａ２＋通道开放为基础。

中性粒细胞与钾离子浓度联合诊断急性ST段抬高型心肌梗死的应用价值

目的评价中性粒细胞与血钾水平联合检测诊断早期ST段抬高型心肌梗死的应用价值。方法将河北省沧州市人民医院自2012年8月至2013年12月收治的急性心肌梗死(AMI)患者93例按心电图特征分成ST段抬高型心肌梗死组(抬高组)49例与非ST段抬高型心肌梗死组(非抬高组)44例,将同期健康体检者45例作为对照组,进行中性粒细胞检测及血钾水平测定。结果抬高组血钾水平显著低于对照组及非抬高组[(3.4±1.0)nmol/L比(4.2±1.2)nmol/L,(4.2±1.1)nmol/L,P<0.05];抬高组中性粒细胞计数显著高于对照组及非抬高组[(10.6±2.2)×109/L比(4.8±3.1)×109/L和(8.7±1.5)×109/L,P<0.05];高血钾组中性粒细胞计数低于低血钾组[(8.6±1.3)×109/L比(10.9±1.2)×109/L,P<0.01],高血钾组发病至入院时间长于低血钾组[(13.6±5.1)h比(6.3±2.2)h,P<0.01];抬高组患者血钾水平与发病时间呈正相关(r=0.415,P<0.05),而与中性粒细胞计数呈负相关(r=-0.378,P<0.05)。结论早期ST段抬高型心肌梗死患者易出现低血钾症,监测患者中性粒细胞计数及血钾水平有利于早期诊断。

高浓度钾离子对嵌合抗原受体CAR-T细胞扩增及功能的影响

目的探索高浓度钾离子条件对嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的体外培养及杀伤能力的影响。方法体外使用间皮素特异靶向的嵌合抗原受体Meso-CAR改造T细胞,在激活或扩增阶段使用高浓度钾离子培养基,通过细胞计数、流式细胞术分析CD4^(+)和CD8^(+)T细胞扩增及PD-1细胞表面表达等情况,并通过荧光素酶检测细胞杀伤能力。结果高浓度钾离子不影响Meso-CAR CD4^(+)和CD8^(+)T细胞体外扩增,但可显著提升CAR-T细胞激活后表面PD-1的表达,并显著提高T细胞体外的杀伤能力。结论高浓度钾离子可以优化CAR-T细胞的体外改造并提高其杀伤能力。

培养的主动脉平滑肌细胞的钙离子依赖性钾通道开放状态检测及其门控模型的初步研究

对培养的主动脉平滑肌细胞的钙离子依赖性钾通道 (Ca2 + -dependent k+ channels in cultural aortic smooth musclescells)单通道记录进行了分析 ,检测其开放 (关闭 )状态个数 ,并提出相应的备择马尔科夫门控动力学模式 。

悬浮红细胞储存时间对制备的洗涤红细胞钾离子和游离血红蛋白含量的影响

目的了解不同储存时间的悬浮红细胞(悬红)制备的洗涤红细胞中钾离子浓度([K+])和游离血红蛋白含量(FHb)。方法将储存3 d(3 d组,n=6)、16 d(16 d组,n=6)及31～35 d(31～35 d组,n=7)的悬红,手工制备成洗涤红细胞,分别于制备前、制备后0、16和24 h取样测定其[K+]和FHb。结果 3 d组、16 d组和31～35d组悬红制备的洗涤红细胞24 h时[K+]分别为(3.26±0.57)、(3.39±1.12)及(2.97±0.95)mmol/L(P>0.05),且均低于人体正常[K+]上限;3组制备的洗涤红细胞24 h时的FHb分别为(0.29±0.18)、(0.63±0.40)及(1.06±0.55)g/L,其中31～35 d组制备的洗涤红细胞的FHb明显高于3 d组(P<0.01)。结论悬红储存时间对制备的洗涤红细胞的[K+]影响不大,制备的洗涤红细胞24 h保存期内的[K+]均低于人体正常参考值上限,但对FHb含量有较大影响。建议尽量避免使用接近储存期末的悬红制备洗涤红细胞。

铁离子对Caco-2细胞内钙离子转运的影响及钙离子浓度变化与细胞凋亡关系的研究

目的 研究细胞外铁离子(Fe3+)浓度变化对钙离子(Caco 2)细胞内Ca2+转运的影响及细胞内钙离子 浓度升高与Caco 2细胞凋亡的关系。 方法 采用激光共聚焦扫描显微镜和流式细胞技术进行观察与检测。 结果 (1)利用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察发现,随着Caco 2细胞外Fe3+浓度的减少(DFO终浓度为100～ 300μmol L),Ca2+向细胞内的转运量增加;而随着细胞外Fe3+浓度的增加(FAC终浓度为10～100μmol L),Ca2+向细 胞内的转运呈降低趋势;(2)经A23187和Fluo 3 AM处理后Caco 2细胞的存活率较高,达90%以上(用荧光素二醋酸 酯检测);(3)A23187升高Caco 2细胞的胞内Ca2+浓度,呈剂量依赖性;经流式细胞技术(FCM)检测发现胞内Ca2+浓度 增加具有诱导Caco 2细胞凋亡的作用。 结论 Caco 2细胞外Fe3+浓度的减少有促进Ca2+向细胞内转运的作用, 但胞外Fe3+浓度增加时有抑制Ca2+向胞内转运的作用;胞内Ca2+浓度增加对Caco 2细胞凋亡具有诱导作用。

糖尿病视网膜病变大鼠视网膜动脉平滑肌细胞中钙离子浓度的变化

目的探讨糖尿病视网膜病变SD大鼠视网膜动脉平滑肌细胞中钙离子浓度的变化。方法取40只正常雄性SD大鼠,采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)100 mg·kg-1腹腔内注射建立糖尿病大鼠模型,持续6个月后经眼底荧光血管造影证实各大鼠出现糖尿病视网膜病变,作为糖尿病视网膜病变组。同时选择正常SD大鼠40只及单纯形成糖尿病的大鼠40只分别用作正常对照组及单纯糖尿病组。酶消化法分离出视网膜动脉平滑肌细胞,荧光测定仪测定三组大鼠视网膜动脉平滑肌细胞内钙离子浓度,SPSS17.0软件进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果造模8周后,测得正常对照组和单纯糖尿病组大鼠血糖水平分别为(6.77±0.18)mmol·L-1和(31.14±0.75)mmol·L-1,符合成模条件,6个月后糖尿病视网膜病变组大鼠眼底荧光血管造影确定为糖尿病视网膜病变SD大鼠模型。糖尿病视网膜病变大鼠视网膜动脉平滑肌细胞内钙离子浓度(255±10)nmol·L-1较正常对照组(123±11)nmol·L-1和单纯糖尿病组(152±23)nmol·L-1明显增高,三组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论糖尿病视网膜病变视网膜动脉平滑肌细胞内钙离子浓度升高可能成为糖尿病视网膜动脉异常收缩及功能异常的重要原因。

钾离子浓度影响血管张力的作用机制

细胞外钾离子浓度轻度升高是一种局部的生理性血流调节因素，可能通过Na^+/K^+-ATP酶和/或内向整流钾通道（KIR)发挥血管扩张作用，近年来，随着分子生物学的进一步发展人们又发现了一些Na^+/K^+-ATP酶的异构体，特别是“钾云”理论的提出为解释某些血管收缩药使用时出现的血管现象提供了新观点。

基于微流控芯片的钙离子浓度检测系统的实现

在细胞内物质定量分析中引入微流控芯片。利用微流控芯片完成细胞的培养、染色、试剂的进给等生物实验功能。设计了用于细胞内钙离子浓度检测的微流控荧光检测系统。通过双波长激发,利用荧光检测系统完成荧光强度和图像的采集。同时研究比值荧光法,计算出定量检测的钙离子浓度。实验结果表明,此检测装置可靠性高,检测结果准确。这一研究,提供了一种细胞检测新手段,为细胞研究提供更加便捷的细胞培养、检测、试剂进给一体化检测装置。

湿阻中焦大鼠红细胞内外电解质浓度变化的实验研究

目的 通过湿阻中焦大鼠血浆及红细胞内钠 ,钾离子浓度的变化情况 ,从电解质角度来揭示湿阻中焦证的部分病理机制。方法 复制湿阻中焦证大鼠模型 ,按空白对照组、模型组、自然恢复组、中药组分为 4组 ,分别检测每组大鼠血浆及红细胞内钠 ,钾离子浓度。结果 模型大鼠血浆中Na+ 无明显变化 ,而K+ 明显下降 (P <0 .0 1 ) ,经中药治疗后与自然恢复组比较 ,K+ 明显升高 (P <0 .0 1 ) ,恢复正常水平 ;模型大鼠红细胞中Na+ 显著增高 (P <0 .0 5 )、K+ 明显下降 (P <0 .0 1 ) ,经治疗后 ,与自然恢复组比较Na+ 可较快恢复正常 (P <0 .0 1 ) ,而K+ 也可明显延缓其下降趋势。结论 细胞内、外Na+ 、K+

bFGF对人晶状体上皮细胞系内钙离子及IP3R、RyR的作用

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人晶状体上皮细胞系LEC-B3内静息Ca2+浓度及三磷酸肌醇受体(IP3R)、ryanodine受体(RyR)表达的影响。方法:LEC-B3细胞系传代培养,分别以1,10,100μg/L bFGF诱导第3代细胞的增殖,MTT法检测其增殖度,激光扫描共聚焦显微镜测细胞内静息钙浓度;RT-PCR(reverse-transcriptase,PCR)方法检测10μg/L bFGF作用后细胞内IP3R和RyRmRNA的表达。结果:与对照组相比,3个浓度的bFGF对LEC-B3都有促增殖作用(P<0.01),其中10μg/L作用最强;bFGF作用后细胞内Ca2+浓度呈bFGF浓度依赖性增高,10μg/L,100μg/LP<0.01,1μg/L<0.05;10μg/L bFGF作用后的细胞IP3RI mRNA表达无明显变化,III型表达明显减弱(P<0.01),ryan-odineRI,IIImRNA表达升高(P<0.05,0.01)。结论:bFGF诱导LEC-B3细胞增殖引起细胞内钙离子浓度增加。Ca2+升高呈bFGF浓度依赖性,并不与细胞增殖度平行。bFGF对IP3R和RyR亚型的mRNA表达有一定影响,并且细胞内Ca2+浓度升高与bFGF刺激RyRmRNA表达升高有关。

严重烧伤对豚鼠心肌细胞内K+浓度的影响

目的：探讨严重烧伤早期心泵功能降低的机理。方法：用自制Ｋ＋－ＩＳＭＥ检测正常及３５％体表Ⅲ度烧伤后１、３、８、２４ｈ豚鼠心肌细胞内Ｋ＋浓度的变化。结果：严重烧伤早期心肌细胞内Ｋ＋浓度降低。结论：烧伤后心肌细胞内Ｋ＋浓度降低是静息电位和动作电位幅值降低的直接原因，也是导致心脏收缩及舒张功能降低的主要因素之一。

皮质酮对高钾诱导PC12细胞内钙升高的非基因组调节作用

目的 :分析皮质酮快速抑制高钾诱导PC12细胞内钙升高的机制。方法 :使用荧光影像系统 ,实时检测细胞内钙变化。结果 :①在预处理PC12细胞 5min后 ,皮质酮可呈量 -效关系抑制高钾诱导的PC12细胞内钙升高。②牛血清白蛋白耦联的皮质酮 (B BSA)可模拟皮质酮快速抑制高钾诱导PC12细胞内钙升高的作用 ,并呈现量 -效关系。③糖皮质激素的细胞内受体拮抗剂RU38486对皮质酮快速抑制效应无明显拮抗作用。④蛋白合成抑制剂放线菌酮预处理细胞 3h后 ,皮质酮对高钾诱导PC12内钙升高仍有较强抑制作用。结论 :①皮质酮的作用点位于细胞膜上。②皮质酮的快速作用不直接依赖细胞内蛋白合成和不依赖细胞内糖皮质激素受体。

gp96肽复合物免疫脾巨噬细胞对细胞内钙离子动态变化及形态学观察

目的:通过研究gp96 -肽复合物免疫小鼠脾巨噬细胞细胞内Ca2 + 的变化及其形态学的改变,进一步探讨肿瘤细胞中提纯的热休克蛋白gp96 -肽复合物的抗肿瘤免疫作用和机制。方法:以gp96 -肽复合物免疫的小鼠脾巨噬细胞作为研究对象,用Fluo- 3/AM负载细胞,激光扫描共聚焦显微镜检测其细胞内的Ca2 + 浓度及观察ConA刺激对细胞内Ca2 + 影响;扫描电镜观察细胞的形态学变化。结果:与对照组相比,经gp96 -肽复合物致敏的小鼠脾巨噬细胞内的Ca2 +浓度显著增加;其细胞内的Ca2 +变化对Con A刺激更加敏感;免疫后的小鼠脾巨噬细胞呈典型的激活状态。结论:gp96 -肽复合物可在体内激活脾巨噬细胞;活化的脾巨噬细胞在Con A刺激时Ca2 + 浓度的变化敏感。gp96 -肽复合物的抗肿瘤免疫过程中促进小鼠脾巨噬细胞活化起着重要的作用。

青海白唇鹿公鹿血钾指标和红细胞钾型的研究

采用火焰光度法对青海省大通种牛场18头白唇鹿公鹿三项血钾指标和红细胞钾型进行了研究。结果发现:①被检青海白唇鹿公鹿的血清钾离子浓度为3.7±0.8mmol/L,全血钾离子浓度为27.4±3.0mmol/L,红细胞钾离子浓度为75.4±10.1mmol/L;②按红细胞钾离子浓度判定,全部被检青海白唇鹿公鹿的红细胞钾型为高血钾型。

AngⅡ对心肌细胞Kv4.2钾通道蛋白表达的影响及机制

【目的】体外培养新生大鼠心肌细胞,观察AngⅡ在诱导细胞肥厚过程中对Kv4.2蛋白表达的影响,及钙离子在其细胞内信号传导通路中的作用。【方法】建立AngⅡ致心肌细胞肥大模型,用激光共聚焦显微镜检测AngⅡ对心肌细胞胞浆钙离子浓度的影响,用流式细胞仪检测AngⅡ在诱导心肌细胞肥厚过程中细胞Kv4.2表达的变化。【结果】AngⅡ明显增加细胞的蛋白总量,诱导心肌细胞肥大,AngⅡ能增加心肌细胞胞浆钙离子浓度,下调Kv4.2编码的通道蛋白的表达含量。【结论】AngⅡ在诱导心肌细胞肥大过程中,可能通过细胞内钙离子以外的信号通路下调Ito通道蛋白Kv4.2。