虎杖苷调控Janus激酶1/信号传导和转录激活因子3信号通路对小鼠宫颈癌细胞凋亡及裸鼠移植瘤作用实验研究

目的:探讨研究虎杖苷调控Janus激酶1(JAK1)/信号传导和转录激活因子3(STAT3)信号通路对小鼠宫颈癌细胞凋亡及裸鼠移植瘤的作用。方法:选取人宫颈癌HeLa细胞株,分为对照组(未经任何处理的HeLa细胞)、虎杖苷低、中、高剂量组(加入50、100、150μmol/L虎杖苷),继续培养24、48、72 h, Annexin V双染法检测HeLa细胞凋亡,MTT检测HeLa细胞增殖能力,Transwell小室检测HeLa细胞侵袭能力,qRT-PCR检测JAK1、STAT3 mRNA表达,Western blot检测JAK1/STAT3信号通路相关蛋白表达,并进行细胞形态学观察。结果:与对照组比较,虎杖苷低、中、高剂量组HeLa细胞凋亡率升高,高剂量组凋亡率高于中剂量组,中剂量组高于低剂量组(均P<0.05)。虎杖苷低、中、高剂量组HeLa细胞增殖和侵袭能力显著下降,虎杖苷高剂量组增殖率和侵袭细胞数最低(均P<0.05)。虎杖苷低、中、高剂量组HeLa细胞中JAK1、STAT3 mRNA和蛋白表达显著下降,高剂量组JAK1、STAT3 mRNA和蛋白表达低于中剂量组,中剂量组低于低剂量组(均P<0.05)。虎杖苷低、中、高剂量组小鼠肿瘤体积缩小,肿瘤质量降低(均P<0.05)。结论:虎杖苷可诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡,抑制其增殖、迁移、侵袭及裸鼠皮下成瘤,其作用机制可能与调控JAK1/STAT3通路信号通路有关。

异莲心碱通过PI3K/Akt/mTOR信号通路影响结肠癌SW480细胞增殖、凋亡和自噬

目的:探讨异莲心碱(Iso)通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对结肠癌SW480细胞增殖、凋亡和自噬的影响。方法:用10、20和40μmol/L的Iso处理结肠癌SW480细胞,CCK-8法、流式细胞术和WB法分别检测Iso对细胞增殖活力、凋亡和自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62表达的影响。然后,用20μmol/L的Iso和25μmol/L的PI3K激活剂740 Y-P分别处理SW480细胞,将细胞分为对照组、740 Y-P组、Iso组和Iso+740 Y-P组,流式细胞术、WB法检测Iso和740 Y-P对各组细胞凋亡及细胞中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、PI3K、p-PI3K、mTOR和p-mTOR蛋白表达的影响。结果:10、20和40μmol/L的Iso处理后,SW480细胞增殖活力均显著下降(均P<0.05),细胞凋亡率均显著升高(均P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达均显著上调(均P<0.05),p26蛋白表达显著下调(P<0.05)。Iso和740 Y-P处理后,与对照组相比,740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达均显著下降(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著升高(均P<0.05);Iso组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达升高(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著下降(均P<0.05);与740 Y-P组相比,Iso+740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达升高(P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著下降(均P<0.05);与Iso组相比,Iso+740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达下降(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著升高(均P<0.05)。结论:Iso通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制结肠癌SW480细胞增殖并诱导细胞凋亡和自噬。

藏红花素调节Hippo信号通路对病理性瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡的影响

目的:初步探讨藏红花素(Crocin)调节Hippo信号通路对病理性瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡的影响。方法:体外分离培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞(HKF),免疫荧光鉴定成纤维细胞;MTT法计算细胞增殖抑制率,筛选Crocin最佳干预浓度,将HKF细胞分为control组和Crocin低、中、高剂量组(Crocin浓度分别为20、50、100μmol/L);细胞转染实验中将HKF细胞分为control组、Crocin组(100μmol/L)、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1)、pcDNA3.1+Crocin组(转染pcDNA3.1+100μmol/L Crocin干预)、pcDNA3.1-YAP/TAZ组(转染pcDNA3.1-YAP/TAZ)、pcDNA3.1-YAP/TAZ+Crocin组(转染pcDNA3.1-YAP/TAZ+100μmol/L Crocin干预)。qRT-PCR法检测YAPmRNA、TAZ mRNA表达;EdU染色、流式细胞仪分别检测细胞增殖、凋亡情况;Western blot检测细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞抗凋亡因子B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)及Hippo通路蛋白表达。结果:Crocin以浓度依赖性的方式抑制HKF细胞增殖,IC50=111.56μmol/L;与control组比较,Crocin低、中、高剂量组HKF细胞中YAP、TAZ mRNA表达水平EdU阳性细胞率、PCNA、Bcl-2、p-YAP/YAP、TAZ蛋白表达水平显著降低,凋亡率及Bax蛋白表达水平升高(P<0.05);转染YAP/TAZ后,显著减弱了藏红花素对HKF细胞增殖的抑制作用及对HKF细胞凋亡的促进作用。结论:藏红花素可能通过抑制YAP/TAZ信号通路,抑制HKF细胞增殖,促进其凋亡。

芒柄花素调节Hippo/YAP信号通路对炎症性肠病大鼠肠上皮细胞凋亡的影响

目的 探究芒柄花素(FMN)对炎症性肠病(IBD)大鼠肠上皮细胞凋亡的影响及可能机制。方法 采用三硝基苯磺酸诱导的方法构建大鼠IBD模型。将造模成功的48只大鼠按照随机数字表法分为模型组(生理盐水),低、高剂量FMN组(20、40 mg/kg FMN)和高剂量FMN+YAP抑制剂Verteporfin(VTPF)组(40 mg/kg FMN+10 mg/kg VTPF),每组12只;另取12只大鼠设为正常组(生理盐水);每天给药/生理盐水1次,连续7 d。末次给药后,对大鼠疾病活动指数(DAI)进行评分;测量大鼠结肠长度;观察大鼠结肠组织的病理学变化;检测大鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10水平;检测大鼠肠上皮细胞的凋亡情况;检测大鼠结肠组织中Yes相关蛋白(YAP)、切割型胱天蛋白酶3(cleaved-caspase-3)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达。结果 与正常组比较,模型组大鼠DAI评分,TNF-α、IL-6水平,肠上皮细胞凋亡率,cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);结肠长度显著变短(P<0.05);IL-10水平和YAP、Bcl-2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);结肠组织出现细胞形态异常、排列紊乱,炎症细胞浸润等病理学变化。与IBD组比较,低剂量FMN组、高剂量FMN组大鼠上述指标水平均显著改善(P<0.05),且具有剂量依赖性(P<0.05);而加入VTPF后,显著逆转了FMN对IBD大鼠上述指标的改善作用(P<0.05)。结论 FMN可能是通过抑制Hippo/YAP信号通路,促进YAP的表达,进而抑制IBD大鼠肠上皮细胞凋亡。

薯蓣皂苷抑制Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌细胞凋亡的研究

目的研究薯蓣皂苷(DIO)对人HepG2肝癌细胞凋亡的影响及其可能抗癌作用机制。方法DIO(0.25、0.5、1、2、4、6和8μmol/L)干预HepG2肝癌细胞,MTT法检测细胞增殖情况,并计算半数抑制率(IC50);划痕实验分析细胞的迁移能力,Western blot检查细胞中凋亡因子及Wnt/β-catenin通路蛋白表达差异。结果与对照组比较,DIO组HepG2细胞抑制率显著升高(P<0.01),并诱导细胞在形态学上出现凋亡特点,呈时间与剂量依赖性;划痕实验结果显示DIO显著抑制HepG2细胞的迁移距离;与对照组比较,DIO干预细胞24 h后,Caspase-3、cleaved Caspase-3水平明显上调,而Bcl-2、β-catenin水平显著下调(P<0.05、P<0.01);采用LiCl激活Wnt/β-catenin信号通路,LiCl组细胞中Wnt1、β-catenin水平较对照组显著上调(P<0.01);与LiCl组比较,LiCl+DIO组HepG2细胞Wnt1、β-catenin、GSK-3β蛋白表达显著下调(P<0.01)。结论DIO体外能够促进HepG2肝癌细胞凋亡,机制可能是其下调β-catenin的蛋白表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路传导,进而抑制凋亡因子Bcl-2表达,最终诱导细胞凋亡而发挥抗肝癌作用。

牛蒡子苷元调控Notch/Hes-1信号通路对口腔鳞状细胞癌HSC-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

目的:探究牛蒡子苷元(ARC)通过调控Notch/Hes-1信号通路对口腔鳞状细胞癌(OSCC)HSC-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及其机制。方法:使用不同质量浓度的ARC处理人HSC-3细胞,CCK-8法检测ARC对细胞增殖活力的影响,以选择适宜的药物浓度。将HSC-3细胞分为对照组、ARC-L组(10 mg/L ARC)、ARC-M组(20 mg/L ARC)、ARC-H组(40 mg/L ARC)和ARC-H+Jagged1/FC组(40 mg/L ARC+1.2μg/mL Jagged1/FC)。采用EdU法检测细胞增殖能力,划痕愈合实验、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞的迁移、侵袭能力及细胞周期和细胞凋亡率,WB法检测增殖(c-Myc、cyclin D1)、凋亡(BAX、Bcl-2、survivin)、EMT(E-cadherin、vimentin、Snail)及Notch/Hes-1通路(Notch 1、Hes-1、NICD)相关蛋白的表达水平。结果:与0 mg/L相比,10~80 mg/L的ARC均能显著降低HSC-3细胞增殖活力(均P<0.05)。与对照组相比,ARC-L组、ARC-M组和ARC-H组HSC-3细胞EdU阳性率、划痕愈合率、侵袭细胞数、S期和G2/M期细胞占比及c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、survivin、vimentin、Snail、Notch 1、Hes-1和NICD蛋白表达均显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率、G0/G1期细胞占比及BAX、E-cadherin的蛋白表达均显著升高(均P<0.05),且呈浓度梯度依赖性。同时使用Notch激动剂Jagged1/FC,则可部分逆转ARC对HSC-3细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及相关蛋白表达的作用(均P<0.05)。结论:ARC可能通过抑制Notch/Hes-1信号通路抑制OSCC细胞HSC-3增殖和侵袭并促进细胞凋亡。

艾灸督脉组穴对血管性痴呆大鼠海马p38 MAPK信号通路及细胞凋亡的影响

目的基于p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路探究艾灸督脉组穴对血管性痴呆(vascular dementia,VD)大鼠的脑保护机制。方法将60只SPF级健康雄性SD大鼠随机分为假手术组(12只)和实验组(48只);实验组大鼠采用双侧颈总动脉永久结扎法复制VD大鼠模型,随后将模型复制成功的大鼠分为模型组、艾灸组、阻滞剂组、艾灸+阻滞剂组,每组12只;艾灸组大鼠取“百会”“大椎”“风府”穴,采用温和灸法治疗,每次30 min,每日1次,治疗6 d,休息1 d,连续治疗4周;阻滞剂组在模型复制前30 min腹腔注射p38 MAPK阻滞剂(10μmol/L SB203580),模型复制成功后隔日注射1次,每次每只大鼠按1 mL/kg注射10μmol/L SB203580,连续注射4周;艾灸+阻滞剂组大鼠在阻滞剂组干预方法基础上进行艾灸治疗。采用Morris水迷宫实验检测大鼠认知功能,TUNEL法检测大鼠海马组织CA1区神经元凋亡率,Western blot法和RT-qPCR法分别检测大鼠海马组织CA1区p38 MAPK、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表达水平。结果与模型组比较,艾灸组、阻滞剂组、艾灸+阻滞剂组大鼠平均逃避潜伏期均显著缩短(P<0.05),穿越平台次数显著增加(P<0.05),海马组织CA1区神经元凋亡率显著降低(P<0.05),p38 MAPK、Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表达水平均显著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白及mRNA表达水平均显著升高(P<0.05);艾灸+阻滞剂组大鼠平均逃避潜伏期较艾灸组、阻滞剂组显著缩短(P<0.05),穿越平台次数显著增加(P<0.05),海马组织CA1区神经元凋亡率显著降低(P<0.05),p38 MAPK、Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表达水平均显著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白及mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)。结论艾灸督脉组穴对VD大鼠的认知功能具有一定的改善作用,其作用机制可能与调控p38 MAPK信号通路抑制海马神经元凋亡有关。

青蒿琥酯调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响

目的探讨青蒿琥酯对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡和自噬的作用及其分子机制。方法体外培养人肾母细胞瘤细胞株SK-NEP-1并以0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0μmol/L浓度的青蒿琥酯处理,采用CCK-8法测定各组细胞活力并筛选出青蒿琥酯最佳作用浓度。将SK-NEP-1细胞随机分为对照组、青蒿琥酯(100.0μmol/L)组、AMPK抑制剂Dorsomorphin(10.0μmol/L)组、青蒿琥酯(100.0μmol/L)+Dorsomorphin(10.0μmol/L)组,以青蒿琥酯和Dorsomorphin单独或联合处理各组细胞后,采用CCK-8法检测各组细胞活力,采用平板克隆形成实验检测各组细胞的集落形成情况;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况;采用MDC荧光染色法检测各组细胞的自噬情况;采用蛋白免疫印迹法检测各组细胞中凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、cleaved多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]、自噬相关蛋白[轻链3(LC3)Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1]及AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白的表达情况。结果不同浓度青蒿琥酯均可抑制SK-NEP-1细胞的活力(均P<0.05),且随浓度升高其抑制作用增强。用100.0μmol/L青蒿琥酯和10.0μmol/L Dorsomorphin分别处理SK-NEP-1细胞后,与对照组相比,青蒿琥酯组细胞的凋亡率、自噬空泡相对量及Bax、cleaved PARP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达水平均升高(均P<0.05),细胞活力、集落形成率及Bcl-2、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均降低(均P<0.05);Dorsomorphin组细胞凋亡率、自噬空泡相对量及Bax、cleaved PARP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达水平均降低(均P<0.05),细胞活力、集落形成率及Bcl-2、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均升高(均P<0.05)。青蒿琥酯和Dorsomorphin联合干预SK-NEP-1细胞逆转了青蒿琥酯的抗肿瘤作用。结论青蒿琥酯可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路增强肾母细胞瘤细胞自噬,进而抑制其增殖并促进其凋亡。

积雪草酸调节PI3K/AKT信号通路对七氟烷诱导的海马神经元HT-22细胞凋亡的影响

目的探讨积雪草酸(AA)通过调节磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路对七氟烷(SEVO)诱导的HT-22细胞凋亡的影响。方法使用不同浓度(0、5、10、15、20、30μmol/L)AA处理七氟烷诱导HT-22细胞24 h,CCK-8检测HT-22细胞活力;将HT-22细胞分为对照(Control)组、七氟烷(SEVO)组、AA低浓度(AA-L,10μmol/L)组、AA中浓度(AA-M,15μmol/L)组、AA高浓度(AA-H,20μmol/L)组和AA高浓度+PI13K通路抑制剂LY294002(AA-H+LY294002,20μmol/L AA+5μmol/L LY294002)组。显微镜下观察各组细胞形态变化,ELISA检测炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)及氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)水平,活性氧(ROS)试剂盒检测ROS水平,TUNEL试剂盒检测HT-22凋亡,JC-1法检测线粒体膜电位,三磷酸腺苷(ATP)含量检测试剂盒检测ATP含量,Western blot检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT蛋白表达。结果与0μmol/L相比,5~30μmol/L AA处理的HT-22细胞活力呈浓度依赖性升高(P<0.05),选择浓度为10、15、20μmol/L的AA用于后续实验。与SEVO组相比,AA-L组、AA-M组和AA-H组TNF-α、IL-6、MDA和ROS水平、细胞凋亡率、Bax和Caspase-3蛋白表达降低,SOD和GSH-Px水平、红/绿JC-1荧光比、ATP含量、Bcl-2蛋白表达、PI3K和AKT磷酸化水平增加(P<0.05),且呈浓度依赖性。LY294002可逆转AA对七氟烷诱导的HT-22细胞损伤的保护作用(P<0.05)。结论AA通过激活PI3K/AKT信号通路保护七氟烷诱导的HT-22细胞损伤,为新型减轻七氟烷诱导的神经毒性的药物开发提供了一定的理论参考。

芍药苷调节丝氨酸/苏氨酸激酶/鼠双微基因2/p53信号通路对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响实验研究

目的:探讨芍药苷(PAE)调节丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)/鼠双微基因2(MDM2)/p53信号通路对弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法:以OCI-LY3细胞为研究对象,分别设置PAE低浓度组(15μmol/L PAE)、PAE中浓度组(30μmol/L PAE)、PAE高浓度组(60μmol/L PAE)、PAE高浓度+SC79(AKT激活剂)组(60μmol/L PAE+8μg/ml SC79),同时以未经处理的细胞为对照组。48 h后,分析细胞增殖、克隆形成能力及细胞周期和凋亡变化,检测AKT/MDM2/p53信号通路相关蛋白的表达水平。结果:与对照组比较,PAE低浓度组、PAE中浓度组、PAE高浓度组细胞凋亡率、p53表达、G_(0)/G_(1)期增加,细胞克隆形成数和细胞增殖率,p-AKT/AKT和p-MDM2/MDM2表达水平,以及G_(2)/M、S期降低(均P<0.05)。与PAE高浓度组比较,PAE高浓度+SC79组细胞凋亡率、p53表达、G_(0)/G_(1)期降低,细胞克隆形成数和细胞增殖率,p-AKT/AKT和p-MDM2/MDM2表达水平,以及G_(2)/M、S期增加(均P<0.05)。结论:PAE通过抑制AKT/MDM2上调p53表达,抑制DLBCL细胞增殖、细胞周期进展,诱导其凋亡。

基于PI3K/Akt/p53信号通路探讨白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物诱导急性髓系白血病细胞凋亡的作用

目的通过评估白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物(EAEHDW)对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/p53信号通路传导调节作用,探讨其抑制急性髓系白血病M2型(AML-M2)细胞株Kasumi-1增殖及诱导凋亡的机制。方法利用乙酸乙酯从白花蛇舌草中萃取制备得到EAEHDW,高效液相色谱串联质谱装置检测样品纯度。设置空白组,将浓度分别为0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的EAEHDW加入对数生长期的Kasumi-1细胞株,采用MTT法检测不同浓度EAEHDW作用不同时间后Kasumi-1细胞存活率,采用Annexin V/PI流式细胞术检测不同浓度EAEHDW作用24 h后Kasumi-1细胞凋亡情况,采用Western blot法检测不同浓度EAEHDW(0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL)作用24 h后Kasumi-1细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族蛋白及PI3K/Akt/p53信号传导通路蛋白表达情况。结果不同浓度的EAEHDW干预后,细胞存活率较空白组明显降低,细胞凋亡率较空白组明显升高,且细胞存活率随着作用时间的延长和药物浓度的增加而下降越明显,细胞凋亡率随着药物浓度的增加而升高越明显,差异均有统计学意义(P均<0.05);不同浓度的EAEHDW作用于Kasumi-1细胞后,细胞中多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、细胞色素C(Cyto-C)、p53蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、鼠双微染色体2(MDM2)、磷酸化MDM2(p-MDM2)蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。结论EAEHDW可明显抑制髓系白血病Kasumi-1细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与影响Caspase家族蛋白表达和抑制PI3K/Akt/p53信号通路导致p53激活有关。

针刺对脑心综合征大鼠脑组织细胞凋亡、炎症因子及丝裂原活化蛋白激酶/核因子-κB/激活蛋白-1信号通路的影响

目的探讨针刺对脑心综合征大鼠脑组织细胞凋亡、炎症因子及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)信号通路的影响。方法将36只SD大鼠随机分为针刺组、模型组和对照组,各12只。采用胶原酶加肝素联合注射大鼠尾状核制备脑心综合征大鼠模型,对照组给予等剂量生理盐水向大鼠尾状核注入,手术操作过程同模型组。模型组和假手术组均不予针刺;针刺组选心俞穴、内关穴、风府穴和水沟穴,每日针刺1次,连续3天。采用原位末端凋亡(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)法测定脑组织细胞凋亡情况;神经功能采用Zea-Longa法评估;运用酶联免疫法测定白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α水平;采用Western Blot法测定MAPK、NF-κB、AP-1蛋白表达。结果模型组和针刺组大鼠脑组织细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠脑组织AI低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠神经行为评分高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠神经行为评分低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠MAPK蛋白灰度值、NF-κB蛋白灰度值和AP-1蛋白灰度值高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠MAPK蛋白灰度值、NF-κB蛋白灰度值和AP-1蛋白灰度值低于模型组(P<0.05)。结论脑心综合征大鼠采用针刺可减轻大鼠脑组织细胞凋亡,减轻大鼠炎症因子,且可下调MAPK/NF-κB/AP-1信号通路表达。

瑞马唑仑调节HIF-1α/BNIP3信号通路对OGD/R诱导神经细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨瑞马唑仑对OGD/R诱导的神经细胞自噬和凋亡的影响及作用机制。方法体外培养小鼠海马神经元细胞(HT22)并进行神经细胞氧糖剥夺/再复氧(OGD/R),筛选实验用瑞马唑仑浓度;将HT22细胞分为对照组、OGD/R组、瑞马唑仑组、2-ME2组、瑞马唑仑+2-ME2组;CCK8法检测5组HT22细胞活力;流式细胞术检测5组HT22细胞凋亡率;透射电子显微镜观察5组HT22细胞自噬小体的形成;Western blot检测5组HT22细胞HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达。结果确定实验用瑞马唑仑浓度为50μg/mL;与对照组比较,OGD/R组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05);与OGD/R组比较,瑞马唑仑组HT22细胞自噬小体增加,OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平上调,凋亡率下调(P<0.05);2-ME2组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05)。与瑞马唑仑组比较,瑞马唑仑+2-ME2组HT22细胞自噬小体数量减少,OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05);与2-ME2组比较,瑞马唑仑+2-ME2组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平上调,凋亡率下调(P<0.05)。结论瑞马唑仑可通过激活HIF-1α/BNIP3信号通路促进OGD/R诱导的神经细胞自噬,抑制细胞凋亡,从而减轻OGD/R诱导的神经细胞损伤。

天智颗粒激活PI3K-AKT信号保护Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞凋亡作用研究

目的:研究天智颗粒对Aβ_(25-35)诱导的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡的作用及其机制。方法:用不同浓度天智颗粒或天智颗粒+LY294002干预Aβ_(25-35)处理的PC12细胞,通过MTT检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡和氧应激,酶标仪检测Caspase 3活性和丙二醛(MDA)含量,免疫印迹法检测Bcl2/Bax、p-AKT/AKT蛋白水平。结果:天智颗粒剂量依赖地改善Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞活力下降,抑制其凋亡,降低Caspase 3活性,上调Bcl2/Bax表达,减少氧应激和MDA的生成,同时促进PI3K/AKT信号的活化。而PI3K抑制剂LY294002干预显著地逆转天智颗粒的这些有益作用。结论:天智颗粒能有效地保护Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞凋亡,其机制可能与激活PI3K/AKT信号相关。

流体静压力通过Ca^(2+)/CaMKⅡ/MAPK信号通路调控髁突软骨细胞增殖与凋亡

目的:考察30 kPa流体静压力调控髁突软骨细胞增殖及凋亡的分子机制。方法:体外培养大鼠髁突软骨细胞,分为4组:正常压力组、30 kPa压力组、KN93对照组、30 kPa压力+KN93组。5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)标记法测定细胞增殖。流式细胞术法检测细胞凋亡比例。荧光探针法检测细胞内Ca^(2+)水平。Western blot法检测细胞钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)、p-c-Jun、c-Jun、磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、p-p38、p38蛋白表达。结果:与正常压力组相比,30 kPa压力组细胞增殖率均降低;凋亡率均提高;细胞内Ca^(2+)水平升高;CaMKⅡ蛋白表达上调,(p-c-Jun)/(c-Jun)、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)、(p-p38)/(p38)的比值均增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。与30 kPa压力组相比,30 kPa压力+KN93组细胞增殖率均提高;凋亡率均降低;细胞内Ca^(2+)水平降低;CaMKⅡ蛋白表达下调,(p-c-Jun)/(c-Jun)、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)、(p-p38)/(p38)的比值均降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:30 kPa静压力持续作用髁突软骨细胞,可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,提高细胞内Ca^(2+)水平,其作用机制为Ca^(2+)通过CaMKⅡ激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信号通路。

从NF-κB/Bcl-2信号通路调控成纤维样滑膜细胞凋亡角度探讨中医药抑制类风湿关节炎滑膜炎症机制的研究进展

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎症为主要特征的自身免疫性疾病,成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)的抗凋亡是导致该病病情发展的主要因素。如何促进FLS凋亡并抑制炎症反应是目前RA治疗和研究的重点。核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)/B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)信号通路在RA发病过程中发挥了关键作用,其与FLS炎症倾向、抗凋亡等密切相关。研究并探讨NF-κB/Bcl-2信号通路调控FLS凋亡的机制及作用,介绍中医药靶向该通路促进FLS凋亡进而抑制RA滑膜炎症的研究现状,旨在为中医药治疗RA的研究提供一定基础。

鸦胆子苦醇通过TLR9-MyD88信号通路调控Hela细胞凋亡的机制研究

目的探究鸦胆子苦醇(Brusatol,BRU)通过TLR9-MyD88信号通路调控Hela细胞凋亡的分子机制。方法针对本实验室保存的Hela细胞,使用不同浓度(0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 nmol·L^(-1))的鸦胆子苦醇处理细胞。并将Hela细胞分为Control组(正常培养的Hela细胞)、BRU-L组(使用10.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇处理细胞)BRU-H组(使用20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇处理细胞)、BRU+pcDNA-NC组(转染pcDNANC+20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇)、BRU-H+pcDNA-TLR9组(转染pcDNA-TLR9+20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇)。使用细胞计数试剂盒(CCK-8)法和EdU法检测各组细胞增殖情况;TUNNEL染色法,经流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白免疫印迹(Western blot)检测各组细胞TLR9、MyD88、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)情况、ELISA检测各组细胞三磷酸腺苷(ATP)和活性氧基团(ROS)含量。结果与0 nmol·L^(-1)组比较,10 nmol·L^(-1)组细胞活存活率、IC50值开始显著降低(P<0.05)。不同浓度的BRU刺激细胞后,细胞增殖能力显著降低,且呈剂量依赖(P<0.05)。。与Control组比较,BRU-L、BRU-H组、BRU-H+pcDNA-NC组细胞5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)阳性细胞率、缺口末端标记法(TUNEL)阳性细胞率、细胞凋亡率、细胞Bcl-2蛋白均显著降低,TLR9和MyD88蛋白、Bax、Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平均明显增加(P<0.05);Control组、BRU-L、BRU-H组/BRU-H+pcDNA-NC呈持续递减/递减趋势(P<0.05);与BRU-H+pcDNA-NC组比较,BRU-H+pcDNA-TLR9组EDU阳性细胞率、TUNEL阳性细胞率、细胞凋亡率、细胞Bcl-2蛋白均显著升高,TLR9和MyD88蛋白、Bax、Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平均明显降低(P<0.05)。与Control组比较,BRU-L、BRU-H组、BRU-H+pcDNA-NC组细胞JC-1水平和ATP含量显著降低,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平显著增加(P<0.05);与BRU-L组比较,BRU-H组、BRU-H+pcDNANC组JC-1水平和ATP含量进一步降低,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平进一步增加(P<0.05);与BRU-H+pcDNA-NC组比较,BRU-H+pcDNA-TLR9组细胞JC-1水平和ATP含量增加,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平降低(P<0.05)。结论鸦胆子苦醇可通过调控TLR9-MyD88信号通路制Hela细胞增殖。

基于Fas/FasL信号通路探索舒芬太尼对急性心肌梗死大鼠心功能和心肌细胞凋亡的影响

目的基于脂肪酸合成酶(Fas)/脂肪酸合成酶配体(FasL)信号通路探索舒芬太尼对急性心肌梗死(AMI)大鼠心功能和心肌细胞凋亡的影响。方法选择健康雄性SD大鼠108只,适应性饲养7天,随机分为对照组、模型组、舒芬太尼低剂量组、舒芬太尼高剂量组、舒芬太尼高剂量+Fas阴性对照组、舒芬太尼高剂量+Fas慢病毒组,每组18只。模型组、舒芬太尼低剂量组、舒芬太尼高剂量组、舒芬太尼高剂量+Fas阴性对照组、舒芬太尼高剂量+Fas慢病毒组通过冠状动脉左前降支结扎法制作AMI模型;对照组除不结扎冠状动脉左前降支外,其余步骤与AMI模型相同。舒芬太尼低剂量组和舒芬太尼高剂量组分别于AMI模型制作成功后腹腔注射0.1、1µg/kg舒芬太尼。舒芬太尼高剂量+Fas阴性对照组和舒芬太尼高剂量+Fas慢病毒组分别于AMI模型制作成功后腹腔注射1µg/kg舒芬太尼,尾静脉注射200 nmol/kg NC shRNA慢病毒或Fas shRNA慢病毒。对照组和模型组腹腔注射等量生理盐水。术后72 h,采集大鼠尾静脉血,采用ELISA法检测血清肌钙蛋白T;采用超声心动图检测左心室射血分数(LVEF)、左心室缩短分数(LVFS)、左心室舒张末期内径(LVEDd)和左心室收缩末期内径(LVESd)。待大鼠心功能检测完成后,腹主动脉取血,采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-6。所有大鼠断头处死,留取心脏,随机取6只大鼠的心脏组织,TTC染色,计算心肌梗死面积;随机取6只大鼠的心脏组织,HE染色,观察心肌组织病理形态变化,采用TUNEL法检测细胞凋亡情况;取剩余6只大鼠的心脏组织,采用Western blotting法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3及Fas/FasL信号通路相关蛋白表达。结果与对照组比较,模型组血清肌钙蛋白T水平升高,LVEDd、LVESd升高,LVEF、LVFS降低,血清TNF-α、IL-6水平升高,心肌梗死面积增大,细胞凋亡率及Bax、Caspase-3、Fas、FasL蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达下降(P均<0.05);与对照组比较,模型组心肌细胞形态模糊、纹理消失、排列紊乱、心肌间小血管扩张、细胞数量减少,可见大量炎性细胞浸润。与模型组比较,舒芬太尼低剂量组和舒芬太尼高剂量组血清肌钙蛋白T水平降低,LVEDd、LVESd降低,LVEF、LVFS升高,血清TNF-α、IL-6水平降低,心肌梗死面积减小,细胞凋亡率及Bax、Caspase-3、Fas、FasL蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(P均<0.05);与模型组比较,舒芬太尼低剂量组和舒芬太尼高剂量组心肌细胞形态、纹理、排列、血管扩张、细胞数量及炎性细胞浸润显著改善。以舒芬太尼高剂量组上述效果改善较为明显。与舒芬太尼高剂量+Fas阴性对照组比较,舒芬太尼高剂量+Fas慢病毒组血清肌钙蛋白T水平升高,LVEDd、LVESd升高,LVEF、LVFS降低,血清TNF-α、IL-6水平升高,心肌梗死面积增大,细胞凋亡率及Bax、Caspase-3、Fas、FasL蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P均<0.05);与舒芬太尼高剂量+Fas阴性对照组比较,舒芬太尼高剂量+Fas慢病毒组心肌细胞形态模糊、纹理消失、排列紊乱、心肌间小血管扩张、细胞数量减少,炎性细胞浸润明显。结论舒芬太尼可改善AMI大鼠心功能,抑制心肌细胞凋亡,并且1µg/kg舒芬太尼的作用效果要优于0.1µg/kg舒芬太尼;抑制Fas/FasL信号通路激活可能是舒芬太尼改善AMI大鼠心功能的作用机制之一。

冬凌草甲素介导Notch信号通路对多发性骨髓瘤细胞生长水平、凋亡率及异常转化情况研究

目的探究冬凌草甲素介导Notch信号通路对多发性骨髓瘤细胞生长水平、凋亡率及异常转化情况。方法选取U266细胞、RPMI8226细胞和KAS-6/1细胞,采用CCK8法检测细胞生长水平,采用酶标仪492 nm处检测光密度检测物厚度D值测定细胞的生长抑制率,随后采用流式细胞仪检测RPMI8226细胞和U266细胞的凋亡情况,最后对所检测细胞进行异常转化的观察。结果研究组U266细胞、RPMI8226细胞和KAS-6/1细胞的生长水平均明显低于对照组(P<0.05)。研究组干预后Notch 1-siRNA与核因子κB(NF-κB)-siRNA表达水平变化明显优于对照组(P<0.05)。研究组RPMI8226细胞、U266细胞凋亡率明显优于对照组(P<0.05)。研究组异常转染、异常克隆、异常增生的发生率明显低于对照组(P<0.05)。结论冬凌草甲素能够明显抑制多发性骨髓瘤U266细胞、RPMI8226细胞、KAS-6/1细胞体外生长,有效激活Notch信号通路调节诱导肿瘤细胞凋亡过程,值得临床推广应用。

PIM1基因对急性髓系白血病U937细胞增殖、凋亡及JAK2/STAT3信号通路的影响

目的:探讨PIM1基因对急性髓系白血病(AML)U937细胞增殖、凋亡的影响,以及对JAK2/STAT3通路的调控作用。方法:收集初诊成人AML患者和单纯缺铁性贫血患者的骨髓单个核细胞,荧光定量PCR检测PIM1 mRNA表达。将AML细胞系U937细胞分为:U937组(U937细胞正常培养)、Si-PIM1组(U937细胞转染含PIM1 mRNA的低表达腺病毒载体)、Si-NC组(U937细胞转染不含PIM1 mRNA的低表达腺病毒载体)、CoA1组(U937细胞中加入浓度为20μmol/L的JAK2激活剂CoA1)、Si-PIM1+CoA1组(U937细胞转染含PIM1 mRNA低表达的腺病毒载体并加入浓度为20μmol/L的CoA1)。培养24 h。荧光定量PCR和蛋白印迹法检测U937细胞PIM1 mRNA和蛋白、JAK2/STAT3通路、细胞周期、凋亡相关蛋白表达;噻唑蓝法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞周期变化及凋亡率。结果:AML患者骨髓单个核细胞中PIM1 mRNA表达水平高于单纯缺铁性贫血患者(P<0.05)。与U937组相比,Si-PIM1组细胞PIM1 mRNA和蛋白、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、Cyclin D1、CDK2蛋白、细胞增殖活性、S期比例、G2/M期比例降低(均P<0.05),p27、Caspase-3蛋白、G0/G1期、凋亡率升高(均P<0.05),而CoA1组上述指标的变化情况与Si-PIM1组正好相反,CoA1可逆转Si-PIM1对U937细胞的作用效果。U937组、Si-PIM1+CoA1组、Si-NC组U937细胞上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:敲低PIM1基因表达可抑制U937细胞增殖、促进凋亡,缓解ALM进程,且上述作用可能与抑制JAK2/STAT3通路活化有关。