SPARCL1在动脉粥样硬化斑块形成中的作用研究

目的探讨富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白类似蛋白1(SPARCL1)对动脉粥样硬化(AS)斑块形成的影响。方法采用病例对照研究,选取394例AS确诊患者作为病例组,年龄、性别相匹配的394例健康对照者作为对照组。利用酶联免疫吸附试验测定血清SPARCL1表达水平;免疫组织化学实验评估SPARCL1蛋白在AS斑块区的表达水平及定位,同时检测AS患者和正常对照人群外周血的中性粒细胞及单核细胞的SPARCL1蛋白表达情况;构建SPARCL1过表达及抑制表达的重组腺病毒载体,以小鼠巨噬细胞(J774A.1)为靶细胞,进行细胞划痕实验观察SPARCL1对细胞迁移的影响。结果AS患者组的血清SPARCL1水平低于健康组(P<0.05);在AS斑块中检测到SPARCL1高表达,且主要表达在泡沫细胞胞浆;AS患者的外周血中性粒细胞及单核细胞SPARCL1表达水平低于正常对照(P<0.05);SPARCL1过表达及抑制表达的重组腺病毒构建成功;抑制SPARCL1表达的J774A.1细胞中的细胞迁移率降低,过表达SPARCL1的J774A.1细胞中的细胞迁移率增加(P<0.05)。结论SPARCL1在AS病变部位泡沫细胞高表达,这可能来自于外周血单核细胞和中性粒细胞的代偿性募集,SPARCL1可能作为血管保护因子参与抑制AS斑块的发生发展。

膜联蛋白A5低表达对人宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭的影响

目的探讨膜联蛋白A5(ANXA5)低表达对人宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭的影响。方法将细胞分为干扰组、阴性对照组、转染试剂对照组和空白对照组,采用脂质体转染法将siRNA转染干扰组HeLa细胞,在转染72h后采用RT-PCR和Western blotting检测各组ANXA5的表达以鉴定抑制效率;细胞划痕实验检测各组HeLa细胞的迁移能力;Transwell实验检测各组HeLa细胞的侵袭能力;RT-PCR和Western blotting分别检测ANXA5低表达对E-钙黏蛋白(E-cadherin)和基质金属蛋白酶(MMP)-9 mRNA及蛋白表达的影响。结果干扰组ANXA5蛋白及mRNA的表达均明显低于阴性对照组(P<0.05);其表达均被显著抑制,干扰组细胞的迁移及侵袭能力比阴性对照组明显增强(P<0.05),E-cadherin mRNA及蛋白的表达显著低于阴性对照组(P<0.05);干扰组MMP-9mRNA及蛋白的表达均显著高于阴性对照组(P<0.05)。结论靶向ANXA5的siRNA可有效抑制ANXA5的表达,且ANXA5低表达可能通过影响E-cadherin和MMP-9的表达来促进HeLa细胞的迁移和侵袭能力。

蚓激酶对胃癌SGC7901细胞增殖抑制和凋亡诱导作用

目的:探讨蚓激酶(LBK)对胃癌SGC7901细胞的调控作用,并阐明其作用机制。方法:取对数生长期SGC7901细胞,将细胞分为对照组和2、4、8 U·mL^(-1) LBK组。采用MTT法检测不同时间段(24、48和72h)各组SGC7901细胞增殖抑制率,采用细胞划痕实验检测各组SGC7901细胞体外迁移能力,采用流式细胞术检测各组SGC7901细胞凋亡率和不同细胞周期细胞百分率,采用Western blotting法检测各组SGC7901细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达水平。结果:MTT检测,与对照组比较,作用24、48和72h后不同剂量LBK组SGC7901细胞增殖抑制率明显升高(P<0.01)。细胞划痕实验,与对照组比较,4和8U·mL^(-1)LBK组SGC7901细胞划痕距离明显增加(P<0.01)。流式细胞术检测,与对照组比较,4和8U·mL^(-1) LBK组SGC7901细胞凋亡率明显升高(P<0.01),G1期和S期细胞百分率明显降低(P<0.01),G2期细胞百分率明显升高(P<0.01)。Western blotting法检测,与对照组比较,8U·mL^(-1) LBK组SGC7901细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05),Bax和caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:LBK可抑制胃癌细胞株SGC7901增殖和迁移能力,且能够诱导细胞凋亡,其可能的机制是通过调节Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平来实现的。

全反式维甲酸抑制人肺腺癌A549细胞迁移的机制探讨

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)对人肺腺癌细胞迁移的影响及其作用机制。方法细胞划痕实验检测ATRA对A549细胞迁移的影响;Western blot分析肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的表达和肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化程度;观察MLCK抑制剂ML-7是否影响A549细胞的迁移能力。结果 1 mg.L-1 ATRA处理的A549细胞和细胞对照以及溶剂对照细胞相比,细胞的迁移距离无明显变化,而10 mg.L-1ATRA可明显降低细胞的迁移距离(P<0.05)。Western blot分析结果表明10 mg.L-1 ATRA可明显降低A549细胞ML-CK的表达和MLC磷酸化(P<0.05);ML-7可明显降低A549细胞迁移(P<0.05)。结论 ATRA通过降低MLCK的表达和MLC磷酸化,抑制A549细胞的迁移。

TGF-β1对口腔癌相关成纤维细胞迁移特性的影响

目的:采用细胞划痕实验,研究外源性TGF-β1(transforming growth factor beta)细胞因子对体外分离培养的原代癌相关成纤维细胞(CAFs)迁移特性的影响,探讨TGF-β1细胞因子对CAFs生物学性能的影响。方法:以口腔正常成纤维细胞(NFs)和未经处理的CAFs细胞为对照组,采用细胞划痕实验观察一定浓度的TGF-β1在不同时间作用后对CAFs迁移特性的影响。结果:与NFs组和未处理组CAFs相比,10μg/L的TGF-β1在不同时间点能够明显促进CAFs的迁移。结论:TGF-β1细胞因子能够明显促进CAFs的迁移,对CAFs的生物学性能具有重要影响。

N-(4-羟基苯基)维生素甲酰胺抑制人肺腺癌A549细胞体外迁移机制

目的研究N-(4-羟基苯基)维生素甲酰胺(4-HPR)对人肺腺癌细胞A549体外迁移能力的影响及其作用机制。方法 1μmol/L全反式维甲酸(ATRA)和4-HPR处理肺腺癌A549细胞24 h后,细胞划痕实验检测其对A549细胞体外迁移能力的影响;Western blot法检测骨桥蛋白(OPN)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的表达和肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化程度;细胞划痕实验观察MLCK抑制剂ML-7对A549细胞迁移能力的影响。结果 1μmol/L 4-HPR处理的A549细胞与细胞对照以及溶剂对照细胞相比,迁移距离明显降低(P<0.05);Western blot分析结果表明1μmol/L 4-HPR可明显降低A549细胞MLCK的表达和MLC磷酸化(P<0.05),而对OPN表达无显著影响;ML-7可明显减少A549细胞迁移距离(P<0.05)。结论 4-HPR可能通过减少MLCK的表达和MLC磷酸化,抑制A549细胞的体外迁移。

PRL-3和RhoC在A549细胞中的表达及意义

背景与目的在前期研究中,我们发现在非小细胞肺癌中PRL-3和RhoC的表达具有相关性,提示两者可能存在相互作用。本研究通过检测两者在A549细胞迁移中的作用以及是否存在相互作用,为进一步研究它们在肿瘤发生发展中的作用机理提供实验依据。方法应用PRL-3抗体、RhoC抗体分别阻断A549细胞中PRL-3和RhoC的功能,采用细胞划痕实验检测两者对其迁移能力的影响;应用RT-PCR检测PRL-3和RhoC表达的变化。结果 PRL-3和RhoC功能被阻断后,A549细胞迁移能力明显降低;阻断PRL-3的A549细胞中RhoC表达降低,然而阻断RhoC的A549细胞中PRL-3表达无明显改变。结论 PRL-3和RhoC可能具有促进A549细胞远处转移的功能;PRL-3可能具有上调RhoC表达的功能;PRL-3促进癌细胞远处转移的功能可能是通过RhoC及其下游因子实现的,而RhoC对PRL-3的表达可能无反馈性调节作用。

骨髓间充质干细胞促进肺癌转移的机制

背景:从目前研究来看,间充质干细胞对肿瘤细胞的增殖、转移具备促进或抑制作用存在较大的争议。目的:探讨骨髓间充质干细胞促进肺癌转移的机制。方法:釆用全骨髓直接贴壁法获得原代大鼠骨髓间充质干细胞,差速贴壁结合消化控制法纯化细胞。培养肺癌细胞株,采用划痕实验、细胞侵袭实验及迁移实验观察骨髓间充质干细胞对肺癌细胞迁移、侵袭、转移能力的影响,建立大鼠肺癌原位肿瘤模型,左侧肺接种骨髓间充质干细胞,移植后14 d观察肺组织病理改变。结果与结论:1划痕后肺癌细胞迁移速率较大,随着时间的不断延长,划痕处愈合;2加入骨髓间充质干细胞后肺癌细胞迁移数增多;3加入骨髓间充质干细胞后肺癌细胞穿透Matrigel的能力增强;4肺癌组织周围存在明显的纤维结缔组织,且与周围组织边界清楚,肿瘤细胞核大;转移病灶组织出现明显的浸润,坏死比较明显,肿瘤细胞核大;5结果提示,骨髓间充质干细胞能提高肺癌细胞株的侵袭、迁移以及转移能力。

慢病毒转导敲低Smad7表达对大鼠原代心肌成纤维细胞增殖、迁移、细胞表型分化和Ⅰ型胶原蛋白表达的影响

目的探讨Smad7敲低后对原代心肌成纤维细胞增殖、迁移、胶原分泌和细胞表型转化的影响。方法原代培养10只SD大鼠乳鼠的心肌成纤维细胞,免疫组织化学染色鉴定细胞。采用慢病毒转染方法敲低心肌成纤维细胞Smad7的表达,Western blotting验证Smad7蛋白敲低效率,实时无标记细胞仪检测心肌成纤维细胞的增殖情况,细胞划痕实验检测细胞的迁移情况,Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和细胞表型转化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。结果成功培养心肌成纤维细胞,并进行细胞鉴定。慢病毒转染的心肌成纤维细胞感染复数(MOI)值为100,转染后88.33%的细胞表达绿色荧光蛋白,慢病毒敲低组Smad7的蛋白表达明显下调(P<0.05)。慢病毒敲低Smad7后细胞增殖明显下降(P<0.01),细胞迁移率明显减少(P<0.01)。与对照组相比,慢病毒敲低组细胞ColⅠ表达明显下降(P<0.01),α-SMA表达明显升高(P<0.01)。结论Smad7表达敲低后,心肌成纤维细胞的细胞功能发生明显改变,这些改变可能与Smad7下调导致心肌纤维化程度加重有关。

还原氧化石墨烯对人原代成纤维细胞的毒性研究

通过氧化石墨烯制备还原氧化石墨烯,采用透射电子显微镜对其进行表征,并将其作用于人原代成纤维细胞,通过CCK8法细胞活性检测和细胞划痕实验研究还原氧化石墨烯对人原代成纤维细胞的毒性。结果表明:与氧化石墨烯相比,还原氧化石墨烯颜色变深,粉末变细,具有明显的薄层和褶皱结构;CCK8法细胞活性检测结果显示5μg·mL^-1是还原氧化石墨烯对人原代成纤维细胞的安全浓度;细胞划痕实验结果显示还原氧化石墨烯浓度小于5μg·mL^-1时对人原代成纤维细胞的愈合没有影响。

microRNA-29c对人胰腺癌细胞侵袭转移的抑制作用及机制

目的:探讨microRNA-29c对人胰腺癌细胞(As PC-1、Bx PC-3、PANC-1、MIA Pa Ca-2)生物学特性的影响。方法:培养1种人正常胰腺上皮细胞(HPDE)及4种人胰腺癌细胞(As PC-1、Bx PC-3、PANC-1、MIA Pa Ca-2),采用real-time PCR法观察5种细胞系中microRNA-29c的表达差异,以microRNA-29c过表达腺病毒感染的PANC-1和MIA Pa Ca2细胞作为实验组,以空载体感染的PANC-1和MIA Pa Ca2细胞作为阴性对照组,采用细胞划痕实验、Transwell法检测两组细胞体外侵袭能力,Western blot检测两组细胞上皮间充质转化(EMT)相关蛋白波形蛋白(Vimentin)及E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达。结果:real-time-PCR显示各胰腺癌细胞系中microRNA-29c水平明显低于正常胰腺细胞系(P<0.05),细胞划痕实验发现感染腺病毒48 h后实验组PANC-1、MIA Pa Ca-2细胞的迁移距离明显短于阴性对照组(P<0.05),Transwell小室细胞侵袭实验发现实验组PANC-1和MIA Pa Ca-2细胞侵袭数量明显低于阴性对照组(P<0.05);Western blot蛋白免疫印迹结果显示PANC-1和MIA Pa Ca-2细胞过表达microRNA-29c后,Vimentin表达减少,E-cadherin表达增加。结论:microRNA-29c的过表达可有效抑制胰腺癌细胞的体外侵袭与转移,可能与Vimentin表达减少,E-cadherin表达增加有关,有望成为胰腺癌生物治疗的潜在靶点。

Cdc42表达载体构建及协同药物对细胞迁移的影响

为了研究Cdc42协同拟肽化合物对A549细胞迁移的影响,构建携带红、绿荧光报告基因的Cdc42真核表达载体,转染293T细胞,观察基因表达情况;测定实验用化合物(PMC4)对A549细胞的毒性;进一步将Cdc42转染高迁移率的A549细胞,然后用拟肽化合物刺激,通过细胞划痕实验,初步检测Cdc42协同拟肽化合物对A549细胞迁移的影响。结果表明:本实验成功构建了Cdc42异构体基因的真核表达载体pGFP-cdc42-2、pGFP-cdc42-3、pRed-cdc42-2、pRed-cdc42-3,转染293T细胞效率约为90%;10 μmol/L的拟肽化合物对A549细胞毒性微弱,拟肽药物分子末端对位上的取代基为氟时,其对细胞迁移具有促进作用,过表达Cdc42时,Cdc42协同药物使细胞迁移进一步增加,具体机制有待进一步研究。

IL-17A对人子宫内膜癌Ishikawa细胞迁移能力的影响

目的:探讨IL-17A对人子宫内膜癌Ishikawa细胞迁移能力的影响,通过检测迁移侵袭相关蛋白MMP-9的表达,初步探讨其作用机制。方法:体外培养Ishikawa细胞,将细胞分为对照组及IL-17A处理组,细胞划痕实验检测2组细胞的迁移能力,采用Western blotting检测迁移相关蛋白MMP-7、MMP-9蛋白表达。结果:IL-17在人子宫内膜癌Ishikawa细胞中有表达,给药组细胞的迁移能力比空白组明显增强。结论:人子宫内膜癌Ishikawa细胞中有IL-17表达,外源性IL-17可促进细胞的迁移。

脂联素对结肠癌细胞株HT-29的抑制作用研究

目的研究人脂联素重组体对人大肠癌HT-29细胞体外侵袭能力的影响。方法将HT-29细胞分为对照组和脂联素重组体实验组(2.5、5、10、15μg/ml),药物作用一定时间后,分别以MTT法、细胞划痕法检测脂联素重组体对大肠癌细胞增殖、迁移能力的影响。结果脂联素重组体能显著降低HT-29细胞体外增殖和迁移能力(P<0.01),此作用具有剂量依赖性。结论脂联素可抑制结肠癌细胞HT-29的体外增殖和侵袭。

吴茱萸次碱对棕榈酸诱导的脂质损伤肝细胞的影响

目的:研究吴茱萸次碱(Rut)对棕榈酸(PA)诱导的脂质损伤肝细胞(LO2)的细胞活力、活性氧(ROS)以及缝隙连接蛋白32(Cx32)和缝隙连接蛋白26(Cx26)表达水平的影响。方法:加入不同浓度的Rut溶液预处理LO2细胞20 min后,每个孔加入PA(0.2 mmol/L)溶液,共同孵育24 h,分别应用细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞活力,二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧的表达、划痕负载实验检测缝隙连接细胞间通讯(GJIC)的功能变化及免疫印迹实验(Western blotting)检测缝隙连接蛋白Cx32和Cx26的表达水平。结果:CCK-8实验结果显示,Rut(0.1μmol/L,0.5μmol/L,1μmol/L)能抑制PA诱导的LO2细胞活力的下降;DCFH-DA荧光探针实验显示PA诱导细胞后ROS的表达增强,Rut预处理细胞后能够减少ROS的表达;划痕负载实验结果显示,PA诱导细胞后能够抑制细胞的GJIC功能,预先给予Rut处理能够改善GJIC的功能障碍;Western blotting显示PA诱导细胞后缝隙连接蛋白Cx32和Cx26的表达水平显著降低,给予Rut预处理后能够恢复Cx32和Cx26的表达。结论:PA能够诱导LO2细胞的脂质损伤,导致细胞活性降低、细胞内活性氧增加以及GJIC的功能障碍;Rut预处理LO2细胞后可减轻PA诱导的细胞损伤,并且恢复细胞的缝隙连接蛋白Cx32和Cx26的表达和GJIC的功能。

硫酸酯化天麻多糖抗脑胶质瘤活性的研究

目的:研究硫酸酯化天麻多糖(sulfated gastrodia elata polysaccharides,GEPs)抗脑胶质瘤的活性。方法:将大鼠脑胶质瘤细胞(C6)实验分为空白对照组和GEPs各剂量组(0.10,0.25,0.50,1.00,1.50 mg·ml^-1),采用CCK-8法检测细胞存活率,并观察细胞形态变化;采用DAPI荧光染色法观察细胞凋亡形态;采用划痕实验检测不同浓度GEPs对细胞迁移能力的影响。结果:GEPs各剂量组作用于C6胶质瘤细胞24 h和48 h时可显著降低细胞生存率(P<0.05),并呈浓度依赖性(P<0.01)。倒置显微镜下可见,随着GEPs浓度的上升,C6细胞体积变小,细胞间隙变大,失去原有的细胞形态,并且贴壁不良,产生大量漂浮物。DAPI染色观察到C6细胞数量明显锐减,细胞核缩小,凋亡的细胞明显增多。细胞划痕实验表明,GEPs各剂量组作用于C6细胞24 h后,愈合率逐渐下降,并呈浓度依赖性(P<0.05)。结论:硫酸酯化天麻多糖能显著抑制神经胶质瘤细胞生长的活性,并可有效抑制神经胶质瘤细胞的迁移。

微通道中细胞划痕尺寸的定量控制

细胞划痕尺寸的定量控制是探究细胞迁移过程的先决条件。该文基于微流控技术,设计了一种利用胰蛋白酶消化法制造细胞划痕的微流控芯片,提出了基于流量控制定量调控细胞划痕尺寸的方法,并通过数值仿真、荧光素可视化实验以及细胞实验对该方法进行了分析和验证。荧光粉实验与数值仿真结果表明,荧光粉溶液宽度,等效于划痕宽度,与荧光粉溶液流量比成正比例线性关系。在总流量一定情况下(Q0=100μl/min),增加荧光粉溶液流量(Q2=50μl/min)可减小分子横向扩散的影响,维持主通道内划痕宽度的一致性。内皮细胞划痕实验结果有效证明了基于流量控制胰蛋白酶消化产生细胞划痕方法的可行性,且与数值仿真和荧光粉可视化实验结果吻合良好。该文设计的微流控芯片及细胞划痕尺寸定量控制方法为研究细胞迁移和开展内皮细胞划痕愈合实验提供了有效的实验平台。

纳米山药多糖对4种肿瘤细胞的作用

目的研究纳米山药多糖的抗肿瘤活性,并对其作用机制进行探究。方法细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK-8试剂盒)测定各给药组对肿瘤细胞抑制率的影响;Western blotting检测不同给药组给药48 h后对4种肿瘤细胞凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8表达情况的影响;细胞划痕实验检测各给药组对肿瘤细胞迁移能力的影响。结果 CCK-8实验表明,与对照组相比,纳米山药多糖高剂量组(80 ng·m L?1)、氟尿嘧啶组(80 ng·m L?1)能够明显抑制肿瘤细胞增殖(P<0.05);Western blotting实验显示纳米山药多糖高剂量组(80 ng·m L?1)与氟尿嘧啶组(80 ng·m L?1)肿瘤细胞凋亡蛋白caspase-3、caspase-8条带灰度降低,蛋白含量表达与对照组比较明显减少(P<0.05);细胞划痕实验表明纳米山药多糖作用于4种肿瘤细胞48 h后,细胞愈合率均有不同程度的下降(P<0.05)。结论纳米山药多糖剂量的升高,促进肿瘤细胞凋亡蛋白caspase-3和caspase-8蛋白酶原的活化,酶原降解增多,抑制肿瘤细胞生长,促进肿瘤细胞凋亡,降低细胞划痕愈合率,具有抗肿瘤活性。

化合物ZWF对A549细胞迁移、细胞周期和凋亡的作用

目的观察化合物ZWF对人肺癌A549细胞迁移、细胞周期和凋亡的影响。方法用不同浓度ZWF处理A549细胞,通过划痕实验检测细胞的体外迁移能力;采用流式细胞术观察其对细胞周期的影响,利用Hoechst33342荧光染色法和Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果 8~64 mg·L-1 ZWF的细胞迁移率均明显小于阴性组。1~12 mg·L-1的ZWF使G1期细胞比例均明显大于阴性组。阴性组细胞Hoechst33342荧光染色呈均匀浅蓝色荧光;ZWF8、16 mg·L-1组细胞核固缩,出现染色不均匀现象;32 mg·L-1组细胞核浓染更明显;64 mg·L-1组细胞大量破裂死亡,可初步判定ZWF能促细胞凋亡作用并呈剂量依耐性。ZWF在8~64 mg·L-1内,细胞凋亡比例均大于阴性组,且32、64 mg·L-1组存在显著性差异。结论 ZWF抗人肺癌A549细胞的作用可通过抑制细胞迁移、阻滞细胞分裂周期和诱导细胞凋亡等方式发生。

上调miRNA-100对胃癌SGC-7901细胞侵袭和转移的影响

目的探讨微小核糖核酸(miRNA)-100对人胃癌SGC-7901细胞侵袭、转移能力的影响。方法体外培养人胃癌SGC-7901细胞,将细胞分为空白对照组、阴性对照组和miRNA-100转染组。应用脂质体法,miRNA-100转染组、阴性对照组分别用构建的miRNA模拟物、阴性对照转染SGC-7901细胞。采用逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)法检测各组细胞中miRNA-100的表达水平,细胞划痕实验检测细胞的迁移能力,Tranwell实验检测细胞的侵袭能力。结果 RT-PCR结果显示,miRNA-100转染组miRNA-100的表达量明显高于空白对照组和阴性对照组(P均<0.05)。细胞划痕实验显示,与空白对照组及阴性对照组比较,24 h和48 h时miRNA-100组周边细胞迁移至中央划痕区的距离明显增大,差异有统计学意义(P均<0.01)。Transwell实验显示,与空白对照组和阴性对照组相比,转染miRNA-100后,穿越小室的SGC-7901细胞数目明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论转染miRNA-100可使SGC-7901细胞的迁移能力明显降低、细胞的侵袭能力被抑制,上调miRNA-100能抑制人胃癌SGC-7901细胞的侵袭、转移能力。