细胞周期信号通路相关基因单核苷酸多态性与肝细胞癌临床病理特征关系

目的探讨细胞周期信号通路相关基因CDC25C、CDKN2A(p16)、MCM4、MCM7、PARDC(DNA-PK)、RAD21、RBL2(p107)、YWHAB(14-3-3)、SMAD3、KAT2B、CHEK1单核苷酸多态性(SNP)与肝细胞癌(HCC)临床病理特征的关系,为HCC的预后预测提供科学依据。方法于2007年7月—2011年3月整群抽取在广西医科大学第一附属医院肝胆外科就诊和治疗的498例新发HCC患者进行相关流行病学调查和临床病理资料的收集,并采集其空腹静脉血提取血液样本DNA,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法对14个细胞周期信号通路相关基因SNP位点进行基因分型。结果在校正了年龄、性别、民族、HCC家族史、HBs Ag、吸烟和饮酒情况后,多因素非条件logistic回归分析结果显示,携带YWHAB基因rs2425675位点等位基因A基因型AG/AA患者的包膜侵犯风险为基因型GG患者的2.097倍(OR=2.097,95%CI=1.034~4.256);携带RBL2基因rs3929位点等位基因C基因型GC/CC患者的包膜侵犯风险为基因型GG患者的2.234倍(OR=2.234,95%CI=1.100~4.534);携带CDC25C基因rs3734166位点等位基因G基因型GA/GG患者的子灶发生风险为基因型AA患者的0.460倍(OR=0.460,95%CI=0.259~0.816),癌栓发生风险为基因型AA患者的0.651倍(OR=0.651,95%CI=0.439~0.965);携带CHEK1基因rs515255位点等位基因T基因型TC/TT患者的子灶发生风险为基因型CC患者的0.451倍(OR=0.451,95%CI=0.252~0.807),肿瘤数目多发的风险为基因型CC患者的0.655倍(OR=0.655,95%CI=0.442~0.971)。分层分析结果显示,YWHAB基因rs2425675位点在无HCC家族史、不吸烟、不饮酒的患者中,其SNP多态性与肝癌肿瘤包膜侵犯和假包膜的发生存在统计学关联(均P<0.05);CDC25C基因rs3734166位点在无HCC家族史、不吸烟、不饮酒、HBs Ag阴性和阳性的患者中,其SNP多态性与子灶、癌栓、脉管侵犯和肝硬化的发生存在统计学关联(均P<0.05);CHEK1基因rs515255位点在无HCC家族史、不吸烟、饮酒、不饮酒和HBs Ag阳性的患者中,其SNP多态性与包膜侵犯、子灶的发生和肿瘤数目多发存在统计学关联(均P<0.05);RBL2基因rs3929位点在吸烟、不吸烟、饮酒、不饮酒和HBs Ag阴性患者中,其SNP多态性与包膜侵犯和脉管侵犯的发生存在统计学关联(均P<0.05)。结论 YWHAB、RBL2、CDC25C和CHEK1基因SNP多态性可能与HCC的临床病理特征相关。

川陈皮素调节CDK1/CCNB1/PLK1信号通路对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 探究川陈皮素(NOB)调节细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)/细胞周期蛋白B1(CCNB1)/Polo样激酶1(PLK1)信号通路对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。方法 用浓度为10.0~160.0μmol/L的川陈皮素处理人肝癌细胞(Huh-7),CCK-8法检测细胞活性,筛选最佳川陈皮素浓度;将Huh-7细胞分为对照组(Control组),NOB低(L组)、中(M组)、高(H组)浓度组、CDK1/CCNB1抑制剂组(CE组);用平板克隆法、流式细胞仪、划痕实验、Transwell实验分别检测细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭;免疫印迹法(Western blot)检测细胞增殖相关蛋白(Ki67、Cyclin D1)、凋亡相关蛋白(Bax、Caspase-3)、迁移侵袭相关蛋白(MMP-2、MMP-9)、CDK1、CCNB1、PLK1蛋白表达;用裸鼠移植瘤方法检测NOB对肝癌移植瘤生长的影响。结果 选择20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的NOB浓度用于后续实验。与Control组比较,L、M、H、CE组集落形成数、细胞划痕愈合率、细胞侵袭数量及Ki67、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、CDK1、CCNB1、PLK1表达水平降低,细胞凋亡率、Caspase-3、Bax表达水平明显上升(P<0.05)。裸鼠成瘤实验发现,NOB组移植瘤生长更为缓慢,移植瘤的质量和体积明显下降,且CDK1、CCNB1、PLK1表达下调(P<0.05)。结论 NOB抑制CDK1/CCNB1/PLK1信号通路抑制肝癌细胞的恶性生物学行为。

虫草素通过MEX3A抑制肝癌细胞增殖的机制研究

[目的]探讨虫草素通过肌肉增生蛋白3A(muscle excess 3A,MEX3A)抑制肝癌细胞增殖的分子机制。[方法]以0、50、100、150、200及250μmol·L^(-1)浓度的虫草素分别处理Huh-7肝癌细胞24、48及72 h,采用细胞增殖检测(cell counting kit-8,CCK-8)法检测细胞活力,筛选出虫草素最佳干预浓度及时间。使用最佳干预浓度虫草素对Huh-7肝癌细胞进行干预,并进行高通量转录组测序,对测序结果进行生物信息学分析,筛选差异基因。设立空白对照组、MEX3A沉默组、MEX3A过表达组、虫草素组、虫草素+MEX3A沉默组和虫草素+MEX3A过表达组,以CCK-8法检测各组细胞活力,流式细胞术检测各组细胞的凋亡率及S期细胞比例,集落形成实验检测各组细胞的增殖情况。最后采用免疫印迹法检测各组细胞周期信号通路的关键蛋白细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)、细胞周期蛋白依赖性激酶6(cyclin-dependent kinase 6,CDK6)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)及细胞周期蛋白E1(Cyclin E1)表达的变化情况。[结果]虫草素最佳干预浓度为200μmol·L^(-1),干预时间为48 h。高通量测序后转录组基因差异分析显示,虫草素组与空白对照组共存在564个差异基因,下调明显的基因集包括MEX3A基因。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析发现,明显下调的基因高度富集在细胞周期等促肝癌细胞增殖的信号通路。与空白对照组比较,虫草素可明显抑制Huh-7细胞中MEX3A的mRNA及蛋白表达(P<0.001)。虫草素干预后Huh-7细胞活力降低、克隆数减少、凋亡增加、S期细胞比例减少(P<0.01)。回复实验显示,虫草素+si-MEX3A使肝癌细胞的活力和克隆数进一步减少,凋亡率进一步增加(P<0.01),而S期细胞比例进一步减少(P<0.01)。免疫印迹结果显示,虫草素干预组的CDK4、CDK6、Cyclin D1、CDK2和Cyclin E1蛋白表达明显降低(P<0.01),虫草素+MEX3A沉默组上述蛋白表达进一步降低(P<0.01)。[结论]虫草素通过降低MEX3A表达调控细胞周期相关蛋白,从而抑制肝癌细胞的增殖。

基于TCGA数据库数据分析肺腺癌组织中ESYT3基因的表达变化、临床意义及其分子作用机制

目的基于TCGA数据库数据分析肺腺癌组织中扩展突触标记蛋白3(ESYT3)基因的表达变化和临床意义,并探讨其分子作用机制。方法从TCGA数据库中下载肺腺癌患者的临床相关资料,观察肺腺癌组织和正常肺组织中ESYT3 RNA的表达量、ESYT3 DNA甲基化水平。以肺腺癌组织中ESYT3 RNA表达量中位值为界,将肺腺癌患者分为低表达组和高表达组,单因素Logistic回归分析ESYT3 RNA高、低表达与肺腺癌患者临床病理特征的关系,采用Kaplan-Meier法分析ESYT3 RNA高、低表达组患者中位生存期。通过R语言“limma”包筛选ESYT3 RNA高、低表达组患者的差异表达基因,并对低表达组中的差异表达基因进行GO生物过程富集分析和KEGG信号通路富集分析。提取KEGG细胞周期信号通路相关基因,分析其在ESYT3 RNA高、低表达组患者的差异表达情况,并利用Pearson相关性分析ESYT3与差异表达基因的相关性。结果肺腺癌组织中ESYT3 RNA的表达量为1.335(0.704,2.546),正常肺组织中ESYT3 RNA的表达量为3.953(2.986,4.737),两者相比,P<0.001。肺腺癌组织中ESYT3 DNA甲基化水平高于正常肺组织(P<0.01)。ESYT3 RNA高、低表达与肺腺癌患者性别、临床分期和T分期有关(P均<0.05)。低表达组肺腺癌患者中位生存期低于高表达组(P<0.01)。共筛选出ESYT3 RNA高、低表达组患者的差异表达基因1396个,GO生物学过程和KEGG信号通路富集分析结果显示,ESYT3低表达组中表达上调的基因主要在细胞周期等相关通路富集。共筛选出BUB1、BUB1B、CCNA2等26个参与KEGG细胞周期信号通路的差异表达基因,相关性分析结果显示,ESYT3与CCNA2、MAD2L1、PLK13个基因表达中度负相关。结论ESYT3基因在肺腺癌组织中低表达,ESYT3表达水平与患者性别、临床分期、T分期、生存期有关。ESYT3低表达影响细胞周期等信号通路,并与CCNA2、MAD2L1、PLK1等基因的表达呈负相关关系。

蒲公英多糖通过下调LncRNA CCAT1表达抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭

目的通过观察蒲公英多糖(dandelion polysaccharide,DP)联合小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向沉默长链非编码RNA(LncRNA)结肠癌相关转录因子1(colon cancer-associated transcript 1,CCAT1)对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,探究DP抗乳腺癌可能的分子机制。方法在线数据工具分析CCAT1在乳腺癌组织中的差异表达,qRT-PCR分别检测CCAT1在乳腺癌细胞系中的差异表达、DP(100、200μg/mL)对MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231细胞中CCAT1表达的影响以及siCCAT1对MDA-MB-231细胞中CCAT1表达的影响;CCK-8实验、划痕实验和Transwell实验分别检测DP联合siCCAT1对MDA-MB-231细胞活力、迁移和侵袭能力的影响;在线数据工具预测CCAT1下游靶基因及靶基因富集的信号通路;Western blotting检测DP联合siCCAT1对MDA-MB-231细胞EMT相关蛋白及蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)/细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)/周期蛋白依赖性激酶6(cyclin-dependent kinases 6,CDK6)信号通路中关键蛋白表达的影响。结果与癌旁正常组织及正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,CCAT1在人乳腺癌组织和细胞中高表达(P<0.01);与对照组比较,DP呈剂量和时间相关性地抑制MDA-MB-231及MCF-7细胞活力(P<0.05、0.01),但对MCF-10A细胞活力无明显影响;与MCF-10A及MCF-7细胞相比,DP可显著下调MDA-MB-231细胞中CCAT1表达水平(P<0.01);与siNC组比较,siRNA可显著降低CCAT1在MDA-MB-231细胞中的表达(P<0.01),且DP(200μg/mL)联合siCCAT1更加显著降低了MDA-MB-231细胞中CCAT1的表达水平(P<0.01);与对照组及siNC组比较,DP(200μg/mL)和siCCAT1均能抑制MDA-MB-231细胞活力(P<0.01),且DP(200μg/mL)联合siCCAT1对MDA-MB-231细胞活力的抑制作用更为明显(P<0.01);与对照组及siNC组比较,DP(200μg/mL)和siCCAT1均能抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭(P<0.01),且DP(200μg/mL)联合siCCAT1抑制MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的作用更为明显(P<0.01);与单独用DP或siCCAT1相比,DP联合siCCAT1处理MDA-MB-231细胞中EMT进程相关蛋白E-cadherin表达上调更为显著(P<0.01),N-cadherin和Vimentin蛋白表达下调更为显著(P<0.01);在线生物工具预测出CCAT1靶基因共1929个,这些靶基因主要富集在RNA聚合酶II启动子转录调控、信号转导、转录调控等关键生物过程;富集的通路主要有癌症、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt信号通路;与对照组及siNC组比较,DP(200μg/mL)和siCCAT1均能下调MDA-MB-231细胞中Akt/GSK-3β/Cyclin D1/CDK6信号通路关键蛋白p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β、Cyclin D1、CDK6蛋白表达水平(P<0.05、0.01),且DP(200μg/mL)联合siCCAT1应用时对其关键蛋白下调作用更为显著(P<0.01)。结论DP联合siCCAT1显著抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和EMT进程,其机制可能与下调MDA-MB-231细胞中CCAT1表达进而抑制Akt/GSK-3β/Cyclin D1/CDK6信号通路有关。

内皮素受体B基因过表达对乳腺癌ZR-75-1细胞活力和周期的影响

目的探讨过表达内皮素受体B(EDNRB)基因对人乳腺癌ZR-75-1细胞活力和细胞周期的影响。方法设计EDNRB基因特异性引物,与GV492载体连接构建含EDNRB基因全长序列的过表达载体,慢病毒包装后转染ZR-75-1细胞,构建稳定过表达EDNRB的乳腺癌细胞系。用半定量逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测EDNRB mRNA和蛋白的表达水平,用噻唑蓝法检测EDNRB过表达对细胞生长的影响,用流式细胞术检测EDNRB过表达对细胞周期的影响,用蛋白质印迹法检测EDNRB过表达对细胞周期相关蛋白表达的影响。结果未处理组、GV492转染组和GV492-EDNRB转染组的EDNRB mRNA表达水平分别为0.22±0.13、0.13±0.10和1.79±0.12,EDNRB蛋白相对表达水平分别为0.75±0.04、0.80±0.21和1.43±0.10,GV492-EDNRB转染组的上述指标与未处理组和GV492转染组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。未处理组和GV492-EDNRB转染组的细胞存活率分别为0.98±0.58和0.62±0.15,G1期细胞百分比分别为(52.10±1.25)%和(63.35±1.06)%,抑癌蛋白53(p53)蛋白相对表达水平分为0.19±0.03和0.36±0.05,p21蛋白相对表达水平分为0.42±0.04和0.78±0.17,细胞周期蛋白1(CCND1)蛋白相对表达水平分为0.34±0.11和0.79±0.27,周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)蛋白相对表达水平分为0.83±0.14和0.36±0.01,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论本实验成功构建了EDNRB基因过表达的乳腺癌ZR-75-1细胞系;EDNRB过表达抑制了ZR-75-1细胞生长,并将细胞周期阻滞在G1期,其机制可能与p53-p21-CCND1/CDK4通路有关。

基于转录组学和网络药理学探讨肉豆蔻挥发油干预低氧性肺动脉高压的作用机制

目的基于转录组学和网络药理学探讨肉豆蔻挥发油(volatile oil from Myristica fragrans,VOMF)干预低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary artery hypertension,HPAH)的作用机制。方法通过SwissTargetPrediction数据库获取VOMF活性成分和药物潜在靶点,应用GEO数据库获取HPAH疾病相关靶点,Cytoscape软件构建“成分-靶点-疾病”网络;运用Pymol和MOE软件对VOMF关键活性成分与作用靶点进行分子对接。采用雄性SD大鼠制备肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs),低氧处理并给予VOMF干预后,进行转录组学分析获取差异表达基因,采用Western blotting验证VOMF对细胞周期信号通路相关蛋白表达的影响。结果网络药理学分析共得到VOMF潜在作用靶点512个,HPAH疾病相关差异靶点2912个,交集基因80个;转录组学分析共得到40个共同差异表达基因。以P<0.05为筛选条件将转录组学和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析结果进行交集,得到交集通路8条,其中与HPAH密切相关的包括细胞周期信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路。结合文献报道和课题组前期研究,选取细胞周期信号通路进行验证。Western blotting结果显示,与对照组比较,模型组细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin dependent kinase 2,CDK2)、CDK4、细胞周期蛋白D1(cell cycle protein D1,Cyclin D1)、Cyclin A2蛋白表达水平升高(P<0.01、0.001),p27Kip1蛋白表达水平降低(P<0.01);与模型组比较,VOMF组CDK2、CDK4、Cyclin D1、Cyclin A2蛋白表达水平降低(P<0.05、0.01、0.001),p27Kip1蛋白表达水平升高(P<0.05、0.01)。结论从网络药理学和转录组学角度初步阐明了VOMF能够通过干预细胞周期信号通路,进而干预HPAH的发生,可为后续的药理学研究和临床应用提供依据与参考。