HIF-1α基因沉默对人胰腺癌Patu8988细胞增殖和细胞周期的影响

目的:观察沉默HIF-1α基因对人胰腺癌Patu8988细胞增殖和细胞周期的影响。方法:构建针对乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体LV-RNAi-HIF-1α并转染人胰腺癌Patu8988细胞,MTT法观察HIF-1α基因沉默后胰腺癌Patu8988细胞体外增殖情况,以空白组及转染阴性对照干扰载体的阴性组为对照;流式细胞仪检测Patu8988/LV-RNAi-HIF-1α的细胞周期,以空白组为对照。结果:与空白组及阴性组细胞相比,Patu8988/LV-RNAi-HIF-1α的细胞增殖速度减慢,差异有统计学意义(F=58.48,P=0.000;F=55.91,P=0.000);Patu8988/LV-RNAi-HIF-1 G0/G1细胞比例较空白组高(t=10.87,P=0.001),S期、G2/M期细胞比例较空白组低(t=6.44,P=0.005,t=5.49,P=0.005),表现出G0/G1期阻滞。结论:HIF-1α基因表达沉默抑制人胰腺癌Patu8988细胞的DNA合成,将细胞阻滞于G0/G1期,使Patu8988细胞增殖能力降低,胰腺癌细胞体外生长被显著抑制。

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除H9c2细胞Tudor-SN基因对细胞周期的阻滞及增殖的抑制

基因特异性敲除的细胞常用于生物学研究。近些年兴起的CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease)基因编辑技术越来越广泛地用于基因特异性敲除的实验中。本实验通过利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,实现对大鼠心肌H9c2细胞Tudor-SN(tudor staphylococcal nuclease)基因的敲除,并观察其对H9c2细胞周期及增殖的影响。选择PX462质粒为载体,利用软件设计能特异性识别H9c2细胞Tudor-SN基因第2个外显子的上下游sgRNA(single-guided RNA),构建1对重组质粒。随后,将这对质粒共同转入H9c2细胞中,再挑选阳性单克隆细胞进行培养。Western印迹鉴定其敲除效果,并用敲除成功的细胞株通过流式细胞术及CCK-8(cell counting kit 8)实验进行细胞周期和增殖的检测。Western印迹结果显示,在阳性细胞中,Tudor-SN蛋白不表达,成功实现了对Tudor-SN基因的敲除。流式结果显示,Tudor-SN基因敲除(KO)细胞发生了G1期阻滞。G1期细胞占比由H9c2野生型(WT)细胞的54.28%±0.21%升高到KO细胞的61.96%±0.40%(*P<0.05)。CCK-8实验结果显示,KO细胞的增殖速率减慢。生长第6天的A值由WT细胞的2.82±0.03降低到KO细胞1.85±0.19(*P<0.05)。本实验成功构建了H9c2细胞Tudor-SN基因敲除细胞株,并检测到Tudor-SN基因敲除对细胞周期的阻滞及增殖的抑制,为研究Tudor-SN基因对心肌细胞功能的调控提供了便利的工具及研究的基础。

黄芪注射液对乳腺癌MCF-7细胞增殖周期以及细胞凋亡、迁移影响的实验研究

目的探讨黄芪注射液对乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期、凋亡及迁移的影响。方法通过MTT法观察药物处理后对乳腺癌MCF-7细胞的生长增殖情况的影响;通过流式细胞术检测黄芪注射液对乳腺癌MCF-7细胞增殖周期、凋亡的影响;利用划痕实验检测黄芪注射液对乳腺癌MCF-7细胞的迁移的影响。结果 MTT结果发现,不同浓度的黄芪注射液(100、200、400、600、800mg/ml)对乳腺癌MCF-7细胞的增殖具有不同程度的抑制作用;流式细胞术结果显示,与空白对照组相比,200和400mg/ml黄芪注射液均能导致G_1期增加,且两个浓度的凋亡率都大于空白对照组;划痕实验结果显示200和400mg/ml黄芪注射液组较空白对照组划痕愈合率低。结论不同浓度的黄芪注射液在体外对乳腺癌MCF-7细胞增殖具有一定的抑制作用;同时可将细胞增殖周期阻滞在G_1期,促进MCF-7细胞凋亡;一定浓度的黄芪注射液对MCF-7细胞的迁移具有抑制作用,为乳腺癌的临床应用提供实验基础。

附子生物碱对人胃癌细胞株SGC-7901凋亡及细胞周期的影响

目的:观察附子生物碱对人胃癌细胞株SGC-7901的增殖以及凋亡的影响。方法:运用MTT法,测定经附子生物碱处理后体外培养SGC-7901细胞的增殖活性。分别采用Annexin-V/PI双染法、流式细胞仪检测附子生物碱对细胞凋亡周期的影响。结果:①附子生物碱分别作用人胃癌细胞株SGC-7901 24 h、48 h、72 h后的IC50为0.231 8±0.002 2、0.160 1±0.022 7、0.103 1±0.023 1 mg·mL-1,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01)。②当附子生物碱浓度达到0.8 mg·mL-1时出现明显的凋亡,凋亡率为(59.38±5.05)%。③流式细胞仪检测发现,与空白对照组相比,给药组处于S期细胞的比例显著增多,并且G0/G1期前出现凋亡亚二倍体峰。结论:附子生物碱体外对人胃癌细胞SGC-7901具有增殖抑制作用,并促进其凋亡,还可使SGC-7901细胞阻滞于S期。

玉米低聚肽促HL-7702人肝细胞增殖作用

采用MTT法测定细胞增殖、流式细胞术分析细胞周期及细胞存活率,对玉米低聚肽的促HL-7702人肝细胞增殖作用进行了研究。结果显示:玉米低聚肽在1～10 g/L内,可促进肝细胞生长,其促进作用与肽浓度呈正相关;给予肝细胞玉米低聚肽24 h后,细胞周期中S期及G2/M期细胞的比例上升;并且在此浓度范围内,玉米低聚肽对肝细胞存活率及形态影响较小。研究表明,玉米低聚肽有促进HL-7702人肝细胞增殖及DNA合成的作用,可显著提高肝细胞活力,提示其在保肝护肝中可能具有一定作用。

二氢青蒿素通过PTEN/PI3K/Akt通路抑制胃癌细胞的增殖

目的:探讨二氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)通过PTEN/PI3K/Akt通路对人胃癌细胞株SGC7901细胞周期的影响及其分子机制。方法:不同浓度(6.25、12.5、25、50、100μmol/L)DHA作用SGC7901细胞24、48、72h后,细胞计数法检测SGC7901细胞增殖的情况。不同浓度DHA作用SGC7901细胞24 h后,流式细胞术测定细胞周期的分布;RT-PCR和Western blotting分别测定cyclin D1、P27的mRNA和蛋白的表达水平;Western blotting测定PTEN、PI3K、p-Akt的表达水平。分别以PTEN特异性小干扰RNA(PTEN-siRNA)及无关序列对照siRNA(non-specific siRNA,NS-siRNA)转染细胞,加入100μmol/L DHA,作用SGC7901细胞24 h后,Western blotting测定cyclin D1、P27、PTEN、PI3K、p-Akt的表达水平。结果:DHA剂量和时间依赖性抑制SGC7901细胞的增殖,使细胞周期阻滞于G1期(P<0.05)。RT-PCR和Western blotting分析结果显示,100μmol/L DHA作用SGC7901细胞24 h后,cyclin D1 mRNA和蛋白表达显著下降,P27 mRNA和蛋白表达显著上升(P<0.05)。PTEN的蛋白表达显著增加,PI3K和p-Akt的表达水平逐渐下降(P<0.05)。敲低PTEN表达后,DHA对PI3K和p-Akt的表达水平的影响明显减弱,与此同时,cyclin D1表达水平升高,P27表达有所下降(P<0.05)。结论:DHA通过抑制PTEN/PI3K/Akt信号通路的活化,影响细胞增殖相关基因cyclin D1和P27的表达,进而使细胞阻滞于G0/G1期,抑制人胃癌SGC7901细胞的增殖。

凝血酶敏感蛋白-1对胆囊癌细胞生长增殖的作用

目的探讨研究凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)对胆囊癌细胞株GBC-SD生长增殖的作用及其作用途径。方法根据处理因素将胆囊癌细胞分为:空白对照组,TSP-1组,CD36单抗阻断组、CD47单抗阻断组。用四唑盐比色法(MTT)和流式细胞术检测TSP-1及受体CD36、CD47对胆囊癌细胞生长、细胞周期的影响。结果TSP-1组、CD36阻断组、CD47阻断组细胞生长明显低于对照组(抑制率分别为:23.63%,9.57%,18.13%)。CD36阻断组的抑制率小于CD47阻断组。TSP-1组G0/G1期细胞数增加,S期和G2/M期细胞数减少,与对照组和CD36阻断组相比有显著性差异。增殖指数分别为:对照组(39.55±2.12)、TSP-1组(26.21±0.61)、CD36阻断组(36.43±1.28)、CD47阻断组(30.73±0.38);各组之间两两比较均有差异。结论TSP-1可对抑制胆囊癌细胞的生长,通过与受体CD36的结合阻滞胆囊癌细胞停止于G0/G1期可能是主要的作用途径。

辐射诱导转录子RIGb cDNA对HeLa细胞增殖的抑制作用

核酸序列同源性分析和RT -PCR确定辐射诱导转录子RIGb是染色质重构基因CHD6表达的一个剪接转录子.Northern杂交结果表明,0 . 5Gyγ射线诱导RIGbmRNA表达增加,但4Gy大剂量照射对其表达无明显的影响.正常成人组织Northern杂交结果显示,RIGb基因在心脏、肝脏和睾丸中有高表达.细胞生长曲线分析结果表明,转染和稳定表达RIGb的人宫颈癌细胞(HeLa)的增殖生长受到明显抑制,细胞周期分析发现G1/S期阻滞.

XB130基因对肝细胞癌细胞增殖的影响及其机制

背景与目的:XB130蛋白在肿瘤细胞增殖和侵袭中有重要作用,但在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的研究却极少,其作用至今仍不清楚。该研究拟探讨XB130基因对HCC细胞增殖能力的影响及其可能的下游机制。方法:采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测HCC细胞系Huh7、HepG2、SNU449及正常肝脏细胞系HL7702内XB130蛋白的表达。将XB130-siRNA转染Huh7细胞后,采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测Huh7细胞活性,流式细胞术检测Huh7细胞周期,Western blot检测p-AKT、p-GSK3β、cyclin D1及p-Rb的蛋白表达水平,反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测E2F/DP-1的靶基因cyclin E1、c-Myc及PCNA的mRNA表达水平。结果:XB130蛋白在Huh7、Hep G2、SNU449和HL7702细胞中的相对表达量分别为0.66±0.10、0.78±0.11、0.83±0.08和0.32±0.06,各HCC细胞与HL7702细胞的差异均有统计学意义(P均<0.01)。XB130-siRNA转染可成功抑制Huh7细胞中XB130蛋白的表达。沉默XB130后,Huh7细胞活性在72 h后明显减弱(P<0.001),48 h后G0/G1期细胞比例升高,S和G2/M期细胞比例降低(P均<0.01),p-AKT、p-GSK3β、cyclin D1及p-Rb的蛋白表达下降(P均<0.01),cyclin E1、c-Myc及PCNA的mRNA表达下降(P?均<0.001)。结论:XB130通过对细胞周期蛋白及下游转录因子的调控,影响HCC细胞增殖。

Hes1对急性髓系白血病患者骨髓CD34^＋CD38^-细胞的作用及其机制研究

目的:研究Hes1对急性髓系白血病(AML)患者骨髓CD34+CD38-细胞的作用及其机制。方法:收集初治AML患者及正常供者骨髓样本后,通过密度梯度离心法获取单个核细胞,流式细胞术检测CD34+CD38-细胞比例及其细胞周期。通过免疫磁珠法分选CD34+CD38-细胞后,体外集落形成实验(CFC)检测其增殖能力,并通过Realtime PCR检测其Hes1的表达量。构建Hes1过表达逆转录病毒载体,感染正常供者骨髓CD34+细胞后,流式细胞术分析其细胞周期的改变,CFC检测其增殖的改变。结果:AML患者骨髓CD34+CD38-细胞比例明显低于正常对照,流式细胞术结果显示患者来源CD34+CD38-细胞大多数进入静止期,CFC结果显示患者CD34+CD38-细胞体外扩增能力下降。Realtime PCR结果发现患者CD34+CD38-细胞中Hes1表达上调。提高正常供者CD34+细胞中Hes1的表达后,细胞增殖减少,进入静止期。结论:在AML中CD34+CD38-细胞比例下降,进入静止期,与Hes1的表达上调有关。

AT1-R siRNA对雌激素诱导的Ishikawa细胞生物学行为的影响

目的:通过转染小干扰RNA(siRNA)沉默血管紧张素受体1(angiotensin receptor 1,AT1R)的表达来研究其对雌激素诱导的Ishikawa细胞增殖和细胞周期及凋亡的影响。方法:免疫荧光检测AT1R在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达,转染AT1-R siRNA,Western blot检测转染前后Ishikawa细胞中AT1R蛋白的表达。MTT检测雌激素诱导Ishikawa细胞的增殖及雌激素诱导的雌激素受体抑制剂作用下转染前后Ishikawa细胞的增殖,Western blot检测细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulatedkinases 1/2,ERK1/2)表达。结果:免疫荧光检测AT1R表达于Ishikawa细胞,转染AT1-R siRNA 72 h后AT1R蛋白表达降低最显著,降低82.40%(P<0.05),为此检测转染72h后细胞增殖周期及凋亡,MTT结果显示,雌激素能诱导Ishikawa细胞增殖,封闭雌激素受体后雌激素诱导的Ishikawa细胞增殖受到抑制,封闭雌激素受体后雌激素诱导的转染组细胞增殖较未转染组受到明显抑制;流式细胞周期结果显示,雌激素受体封闭后雌激素诱导的转染组细胞较未转染组S期减少,凋亡增多(P<0.05),其ERK1/2表达较未转染组明显降低(P<0.05)。结论:AT1R可促进雌激素诱导的Ishikawa细胞增殖,其机制可能与ERK1/2表达下降有关。

苯并[a]芘诱导肺癌的分子机制研究进展

肺癌发病率及死亡率均较高,其对患者经济及社会医疗成本造成沉重的负担。大量研究证实环境致癌物苯并[a]芘{benz(a)pyrene,B[a]P}在肺癌发生发展中发挥关键作用,目前对其诱导肺癌的分子机制已尚有研究,但具体机制尚不清楚。本文将从B[a]P诱导肺癌生物学功能方面如细胞凋亡、细胞周期及增殖、细胞迁移及侵袭、炎症微环境以及表观遗传学方面进行综述,为环境致癌物诱导肺癌的预防及治疗提供依据。

HERG1 K^+通道在肝癌细胞系BEL-7402中的表达及其意义

[目的]观察HERG1 K+通道在肝癌细胞系BEL-7402的表达,探索其在肝癌发生与发展中的作用。[方法]RT-PCR方法检测hepg1在肝癌细胞系BEL-7402细胞和正常肝细胞系L-02细胞中表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)研究HERG1 K+通道对BEL-7402细胞和L-02细胞增殖作用;以流式细胞仪检测该通道对肝癌细胞系BEL-7402细胞周期的影响。[结果]HERG1 K+通道在肝癌细胞中表达,而在正常肝细胞中不表达,该通道特异性抑制剂E-4031可以显著抑制BEL-7402细胞的增殖,而对不表达herg1基因的L-02细胞增殖不起作用;E-4031抑制BEL-7402细胞HERG1 K+通道后可导致G1期细胞显著上升。[结论]HERG1 K+通道可能是一个潜在的癌基因,可促进肝癌细胞的增殖;参与调控BEL-7402细胞周期的G1期进程。通过抑制该通道的功能,或下调其表达抑制该肿瘤的发生与发展;HERG1 K+通道可能是肝癌治疗的一个潜在的药物靶点和诊断性生物标志。

红藤提取物联合5-氟尿嘧啶抑制肝癌细胞生长作用及机制研究

目的研究红藤提取物联合5-氟尿嘧啶对人肝癌HepG2细胞生长的抑制作用,并初步探讨其作用机制。方法体外培养HepG2细胞,以不同质量浓度的红藤提取物作用于细胞,采用MTT法检测其对细胞生长的影响,选择后续实验浓度。将HepG2细胞分为对照组、红藤提取物(40 mg/L)组、5-氟尿嘧啶(10μmol/L)组及联合用药(红藤提取物40 mg/L+5-氟尿嘧啶10μmol/L)组,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞周期,Western blotting法检测细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)及细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK4)表达水平。结果 MTT检测结果显示,红藤提取物呈质量浓度依赖性地抑制HepG2细胞增殖,选择其质量浓度为40mg/L用于后续实验。与对照组比较,红藤提取物组和5-氟尿嘧啶组细胞增殖抑制率显著升高,G_0/G_1期细胞比例显著升高,S期和G2/M期细胞比例显著降低,细胞中PCNA、Cyclin D1、CDK4蛋白的表达显著降低(P<0.05)。与5-氟尿嘧啶组比较,联合用药能显著抑制HepG2细胞增殖,阻滞细胞周期,抑制细胞中PCNA、Cyclin D1、CDK4蛋白表达(P<0.05)。结论红藤提取物联合5-氟尿嘧啶能够增强对HepG2细胞生长的抑制作用,其作用机制可能与抑制细胞中PCNA、Cyclin D1、CDK4蛋白表达水平有关。

上皮性卵巢癌组织中Ki67和PCNA的表达及有丝分裂指数

目的分析不同的增殖指标与上皮性卵巢癌临床病理指标的相关性,并探讨其对个体化治疗的指导意义。方法应用免疫组织化学二步法检测109例上皮性卵巢癌组织(其中73例有转移灶),20例交界性、28例良性上皮性卵巢瘤及20例正常卵巢上皮组织中Ki67、PCNA的蛋白核表达并观察计算有丝分裂指数(MI);同时应用原位杂交法检测其中74例卵巢上皮组织(上皮性卵巢癌37例、交界性卵巢瘤14例、良性卵巢瘤11例、正常卵巢上皮组织12例)中Ki67、PCNA的mRNA表达。结合临床病理指标,进行统计学分析处理。结果①上皮性卵巢癌中Ki67的mRNA和蛋白的阳性表达率及过表达率高于其他组织(P<0.05)。PCNA的mRNA和蛋白的阳性表达率及过表达率在四组之间差异无统计学意义(P>0.05)。两个指标的mRNA和蛋白表达呈正相关(r=0.449,P=0.025;r=0.484,P=0.014)。②Ki67在低分化、Ⅲ-Ⅳ期病例中阳性表达率高,在浆液性卵巢癌中呈过表达,而在其他类型(黏液性、恶性苗勒氏混合瘤、移行细胞癌伴鳞癌分化等)中呈低表达或表达缺失,在其他临床病理指标方面差异无统计学意义。PCNA在上皮性卵巢癌FIGO分期、分化程度,组织学类型及其他临床病理指标的阳性表达率差异均无统计学意义。有丝分裂呈高指数者共72例(66.1%)。低分化、临床晚期病例较高分化和临床早期病例MI高指数者比例高(P<0.05)。③Ki67过表达同时MI高指数卵巢癌患者共有57例,与另外52例非同时Ki67过表达及MI高指数患者比较在临床分期、分化程度及组织学类型之间差异有统计学意义(P<0.05)。④在73例既有原发灶又有转移灶的病例中:原发灶中三者的表达分别为:Ki67蛋白58.9%、PCNA蛋白91.8%、高指数者占61.6%。在转移灶中(腹膜/大网膜)三者的阳性表达率分别为:Ki67蛋白41.1%、PCNA蛋白74.0%、高指数者占38.4%。原发灶中三种指标明显高于转移灶(P<0.05)。Ki67蛋白在原发灶中的阳性表达强度高于转移灶(P=0.040),而PCNA蛋白在原发灶和转移灶中的阳性表达强度无明显差异(P=0.514)。结论联合检测Ki67和计算MI可评估上皮性卵巢癌的增殖状态,而PCNA不能作为卵巢癌增殖程度和良恶性鉴别的良好指标。

微小RNA-34c在子宫内膜癌中的功能研究

目的研究微小RNA-34 c在子宫内膜癌中的功能。方法以反转录聚合酶连锁反应法(RT-PCR)检测miR-34c在子宫内膜癌组织及正常子宫内膜组织中的表达。将人子宫内膜癌细胞RL95-2分为实验组(miR-34c)及空白组(空白质粒),以噻唑蓝法(MTT)检测细胞活力,用平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,以流式细胞术检测细胞周期变化,用免疫印迹技术分析细胞中周期蛋白依赖激酶4(CDK4)、CDK6蛋白表达及视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)磷酸化水平。结果 miR-34c在子宫内膜癌组织中的表达为0.45±0.05,在正常子宫内膜组织的表达为1.03±0.10,组间比较差异有统计学意义(P<0.01);细胞周期阻滞在G1期,空白组比例为(57.75±5.45)%,实验组为(78.73±8.62)%明显增加(P<0.01),且细胞中CDK4及CDK6表达量明显降低(P<0.01),Rb磷酸化水平也明显降低(P<0.01)。结论 miR-34c在子宫内膜癌组织中低表达,当提高其表达后能显著抑制子宫内膜癌细胞RL95-2的增殖。