细胞周期末期促进复合物及其调节亚基Cdh1在缺血性脑损伤中的作用

研究认为泛素-蛋白酶体系统与细胞周期成分在脑缺血后神经元凋亡及胶质细胞增殖活化中起着重要作用。细胞周期末期促进复合物（anaphase promoting complex，APc）及其调节亚基Cdh1是联系细胞内泛素．蛋白酶体系统与细胞周期成分的中间枢纽，是细胞周期进程调控的关键蛋白。现就APC-Cdh1在缺血性脑损伤中的作用作一综述。

泛素连接酶APC/C参与的泛素化与细胞周期调节

后期促进复合物/细胞周期体(anaphase-promoting complex/cyclosome,APC/C)是一个多功能的泛素连接酶,参与细胞周期、代谢、DNA损伤修复、细胞自噬、凋亡、衰老及肿瘤发生等多种生物学过程。泛素化作为一种重要的翻译后修饰,可通过泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)调控蛋白质的降解。APC/C的分子量巨大,由多个亚基组成,在细胞周期调控中具有重要地位,可以通过介导细胞周期相关蛋白质的泛素化降解从而精确调控细胞周期的转换,并受共激活分子CDC20或CDH1的调控。了解APC/C的结构和功能,对于研究细胞周期及蛋白质翻译后修饰等生物学事件至关重要。近年,对APC/C分子结构和组成的解析工作取得了极大的进展,其在肿瘤中的作用及潜在的治疗应用也受到了关注。本文将着重对APC/C的组成和结构、参与泛素化的具体过程、在细胞周期中的调控和被调控机制以及参与肿瘤生成的最新研究进展进行综述。

UBE2C在肝细胞癌中的研究进展

泛素偶联酶E2C(UBE2C)是第10个被识别的泛素结合酶家族成员,又称为泛素结合酶10(UBCH10)。UBE2C在细胞内蛋白质的泛素化和降解过程中起到关键性作用,还可以参与细胞周期的调控,与人类多种肿瘤的形成密切相关。UBE2C在肝细胞癌中高表达,并促进HCC的增殖、迁移和侵袭,抑制HCC对化疗及靶向药物的敏感性,与不良的预后相关。高表达的UBE2C可以通过增强Wnt信号通路、调节p53信号通路及调控抗肿瘤免疫作用、改变肿瘤微环境来参与肝细胞癌发生发展的过程。本文就UBE2C在HCC中的研究进展进行综述。

APC-Cdh1在中枢神经系统中的表达分布特点

目的:探讨细胞周期末期促进复合物(APC)-Cdh1在中枢神经系统中的表达分布特点.方法:取健康成年雄性SD大鼠脑组织制作冰冻切片,免疫组化染色检测Cdh1的表达部位;免疫荧光双标检测Cdh1表达的细胞定位情况.取出生24h内乳鼠,原代培养神经元及神经干细胞,免疫组化检测NeuN进行神经元鉴定;Nestin染色进行神经干细胞初步鉴定;采用GFAP,MAP2免疫组化染色鉴定NSC分化特性.分别提取神经干细胞与神经元总RNA,采用实时定量PCR检测APC2个调节亚基Cdh1与CDC20的表达.结果:大鼠脑片免疫组化DAB染色显示Cdh1在海马、皮层均有大量表达,免疫荧光双标显示Cdh1表达主要定位于神经元中,星形胶质细胞表达较少.与神经干细胞相比,神经元中Cdh1 mRNA表达升高[(1.00±0.05)vs(2.10±0.07),P<0.05],但CDC20 mRNA几乎没有表达(1.00±0.04,0.02±0.01,P<0.05).结论:APC-Cdh1在大鼠脑组织中有大量表达,主要定位于神经元,且神经元中Cdh1表达高于神经干细胞.

原代缺氧缺糖损伤神经元模型Cdh1及其下游底物的表达

背景:课题组前期实验已证实Cdh1在大鼠海马、皮质均有大量表达,且体外实验发现神经元中Cdh1表达高于神经干细胞,可能与神经干细胞向神经元分化有关。但细胞周期末期促进复合物调节亚基Cdh1在缺血性神经元损伤中的作用,尚不明确。目的:体外构建原代缺氧缺糖损伤神经元模型,观察Cdh1及其下游底物表达变化。方法:取出生24 h内乳鼠大脑皮质,体外培养原代神经元并通过免疫荧光染色进行鉴定。使用无糖Earle’s液替代细胞培养液,利用三气培养箱充以氮气建立原代神经元缺氧缺糖模型,缺氧处理1 h后复氧。于缺氧前、缺氧缺糖损伤后6 h、1 d,3 d,7 d采用实时荧光定量PCR检测神经元Cdh1及其下游底物Skp2、Cyclin B1的表达。结果与结论:体外缺氧缺糖损伤后,原代神经元Cdh1及其下游底物Cyclin B1表达上调(P<0.05),Skp2表达均下调(P<0.05)。提示,体外缺氧缺糖损伤后神经元Cdh1表达升高,可能通过泛素化降解Skp2参与缺氧性神经元凋亡等病理过程。

慢病毒介导RNA干扰Cdh1的表达对大鼠脊髓损伤的修复作用

目的:观察大鼠脊髓损伤后皮层体感运动区Cdh1mRNA的表达变化,探讨慢病毒介导RNA干扰Cdh1的表达对脊髓损伤修复的作用.方法:15只雄性SD大鼠随机分成对照组和手术组,手术组采用Allen氏法建立脊髓打击损伤模型(T10～T11).荧光定量PCR检测脊髓损伤后大鼠体感运动皮层区Cdh1mRNA表达变化.30只雄性SD大鼠随机分为A组、B组和C组,建模1wk时分别注射生理盐水、空慢病毒和重组慢病毒.术后每周进行BBB评分,荧光定量PCR检测注射10d后Cdh1mRNA的表达,损伤后6wk同法注射BDA-TR,8wk取脊髓冰冻切片.结果:手术组的Cdh1mRNA表达高于对照组(P<0.05),注射药物10d后C组Cdh1mRNA表达低于A组及B组(P<0.05).损伤6wk后C组运动功能评分均高于另两组(P<0.05),且在脊髓空洞区可见更多神经纤维通过.结论:APC-Cdh1在抑制轴突生长方面可能起着重要的作用.

突变型Cdh1基因真核表达质粒的构建及鉴定

背景:细胞周期末期促进复合物调节亚基Cdh1的活性受到磷酸化调节,磷酸化的Cdh1不能与细胞周期末期促进复合物结合,从而抑制细胞周期末期促进复合物的活性。目的:构建突变型Cdh1基因真核表达质粒及鉴定。方法:采用RT-PCR方法,从大鼠海马组织扩增出Cdh1基因编码序列。通过限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切PCR回收产物和pBluescript质粒将Cdh1基因克隆到pBluescript质粒上。根据定点突变技术原理,以含Cdh1编码序列的pBluescript-Cdh1质粒为模版,针对Cdh1第40、151、163位丝氨酸(S)和第121位苏氨酸(T)设计4对突变引物,将4个氨基酸位点全部突变为丙氨酸(A)。最后通过测序鉴定。结果与结论:经电泳鉴定PCR扩增产物大小约为1500bp,包括Cdh1基因完整的编码序列、编码序列两端引入的酶切位点以及KOZAK序列,与预期相符。重组质粒pBluescript-Cdh1经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定与预期结果符合。DNA测序比对发现Cdh1(BC162059.1)编码序列第930位碱基A在重组质粒pBluescript-Cdh1上突变为G,但氨基酸无变化,为同义突变,其他DNA序列无突变。经测序鉴定pBluescript-Cdh1-4A40、121、151、163突变质粒第40、121、151、163位氨基酸全部突变为丙氨酸。提示实验成功构建磷酸化位点突变型Cdh1基因真核表达质粒。

慢病毒介导的Cdh1-siRNA在大鼠全脑缺血再灌注损伤后的表达及功能

目的:探讨慢病毒介导RNA干扰Cdh1的表达对全脑缺血再灌注损伤的影响。方法:将150只雄性SD大鼠随机分成生理盐水组(A组)、空慢病毒组(B组)和重组慢病毒组(C组)各50只。分别给予3组大鼠注射生理盐水、空慢病毒和重组慢病毒,注射3d后采用改良4-VO法建立SD大鼠全脑缺血再灌注损伤模型,采用荧光定量PCR检测大鼠海马组织Cdh1mRNA表达,Western blot检测Cyclin B的变化,TUNEL法检测海马CA1区凋亡细胞指数(AI)。于全脑缺血再灌注术后第7天行Morris水迷宫测试认知功能的变化。结果:C组Cdh1mRNA表达明显低于A、B组(P<0.05);AI值及Cyclin B表达均明显高于A、B组(P<0.05);水迷宫测试结果显示,术后第9～11天各时间点C组的寻台潜伏期明显长于A、B组(P<0.05)。结论:细胞周期末期分裂促进复合物及其调节亚基Cdh1可能通过Cyclin B堆积介导缺血性神经元的凋亡。

脊髓损伤后大鼠Cdh1 mRNA表达的变化

目的:探讨大鼠脊髓损伤(SCI)后损伤区脊髓组织Cdh1 mRNA的表达变化。方法:32只雄性SD大鼠随机分成对照组(C组)、SCI组(M组),每组16只。M组采用改良Allen打击法建立SCI模型;C组行假手术,仅暴露脊髓。术后第l、3、5、7天对大鼠后肢运动功能采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分进行评估;取损伤节段脊髓,提取组织总RNA,采用实时荧光定量PCR检测损伤区脊髓组织Cdh1 mRNA的表达。结果:术后各时点M组BBB评分均低于C组(P<0.05)。术后各时点C组Cdh1 mRNA表达比较,差异无显著性意义,M组Cdh1mRNA表达逐渐降低(P<0.05)。与C组相比,M组术后第1天Cdh1 mRNA的表达增加(P<0.05),术后第5、7天Cdh1mRNA的表达减少。结论:大鼠SCI后损伤区脊髓组织Cdh1 mRNA表达降低,提示APC-Cdh1可能参与SCI后的病理生理过程。

大鼠脊髓部分横切损伤后APC-Cdh1在损伤脊髓组织中的表达

目的观察大鼠脊髓部分横切损伤后损伤脊髓组织中APC-Cdh1 mRNA的表达变化,探讨APC-Cdh1在脊髓损伤修复中的作用。方法建立成年SD大鼠脊髓部分横切模型(T_(10)～T_(11)),将40只成年雄性SD大鼠随机分成对照组和模型组,于损伤后不同时间点按实验性脊髓损伤神经功能综合评分标准进行CBS评估,采用实时荧光定量PCR检测损伤区脊髓组织APC-Cdh1 mRNA的表达,并用免疫组化染色检测Cdh1表达的部位。结果对照组和模型组术后不同时间点CBS评分差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,术后第1天Cdh1 mRNA表达减少(P<0.05),术后第7天显著升高(P<0.05),术后第14天又降低(P<().05)。免疫组化检测结果显示在脊髓前角和后角中有大量APC-Cdh1表达。结论 APC-Cdh1在损伤脊髓组织中大量表达,表明其可能参与脊髓损伤修复的病理生理过程。

大鼠局灶性脑缺血后Cdh1 mRNA水平及Cdh1蛋白分布的改变

目的:探讨大鼠局灶性脑缺血损伤后Cdh1 mRNA水平的变化及其在不同类型神经细胞中的分布变化。方法:雄性成年SD大鼠30只,线栓法建立右侧大脑中动脉缺血模型,分别于缺血前和缺血再灌注后1、3、7d采用实时荧光定量PCR技术检测缺血侧和非缺血侧脑组织中Cdh1 mRNA的水平;缺血再灌注后7d免疫荧光双标法检测Cdh1在神经元和星形胶质细胞中的分布情况。结果:脑缺血前,两侧脑组织中Cdh1 mRNA的水平差异无统计学意义。缺血再灌注后1、3、7d,缺血侧脑组织Cdh1 mRNA水平均低于非缺血侧脑组织(P<0.05);缺血再灌注后7d,与非缺血侧相比,缺血侧神经元明显减少,星形胶质细胞增多;在非缺血侧Cdh1主要表达于神经元,星形胶质细胞中表达较少,在缺血侧Cdh1在神经元及激活的星形胶质细胞中均有表达。结论:大鼠局灶性脑缺血损伤后,缺血侧Cdh1 mRNA的水平较非缺血侧降低,且Cdh1在神经元和星形胶质细胞中分布情况发生变化。

大鼠全脑缺血-再灌注损伤后APC-Cdh1蛋白的表达

目的探讨大鼠全脑缺血-再灌注损伤后APC-Cdh1蛋白的表达变化。方法雄性SD大鼠60只,体重280～350g,随机分成假手术组和缺血-再灌注组。采用改良Pulsinelli4-VO法建立SD大鼠全脑缺血模型,在损伤后不同时间点,免疫组化染色检测Cdh1的表达部位并且采用Western blotting检测大鼠海马组织APC-Cdh1蛋白的表达。结果免疫组化检测显示APC-Cdh1在海马区及皮层区中均有大量表达。与假手术组相比,缺血-再灌注组术后第1天APC-Cdh1蛋白表达减少,术后第3天升高(P<0.05),术后第7天又降低。结论APC-Cdh1可能与中枢神经系统损伤有着密切的关系。

大鼠全脑缺血再灌注损伤后APC-Cdh1mRNA的表达变化

目的研究大鼠全脑缺血再灌注损伤后APC-Cdh1的表达变化。方法雄性SD大鼠60只,体重280～350g,随机分成假手术组(SH组)、模型组(IR组)。采用改良4-VO法建立SD大鼠全脑缺血模型,在损伤后不同时间点,免疫组化染色检测Cdh1的表达部位并且采用实时荧光定量PCR检测大鼠海马组织APC-Cdh1的表达。结果与对照组相比,术后1dCdh1mRNA表达减少,术后3d显著升高,术后7d又降低。免疫组化检测显示APC-Cdh1在海马区及皮质区中均有大量表达。结论 APC-Cdh1可能与中枢神经系统的发育及损伤有着密切的关系。

大鼠永生化神经前体细胞CDH1小干扰RNA真核载体的构建

目的构建大鼠永生化神经前体细胞（INPC）CDH1小干扰RNA（siRNA）真核载体。方法根据大鼠CDH1基因的编码序列设计3个小发夹RNA（shRNA）干扰序列及1个阴性对照序列，根据pENTR／H1／TO中间载体说明书设计并合成相应的DNA单链，退火后分别连接到pENTR／H1／TO线性载体上，形成完整载体，提取CDH1 siRNA真核载体后（分别为CDH1 siRNA1、CDH1 siRNA2、CDH1 siRNA3和CDH1 siRNA对照），进行DNA测序鉴定。采用Lipofectamine 2000法，分别将成功构建的CDH1 siRNA真核载体转染大鼠INPC，于转染24h和48h时计算INPC转染效率=INPC成功转染数／细胞总数，于转染48h时提取细胞总RNA，采用实时定量PCR法检测INPC CDH1 mRNA的表达。结果经DNA测序鉴定构建的3个CDH1 siRNA真核载体和1个阴性对照载体所插入的RNA干扰序列均正确，无碱基突变或缺失；INPC转染24h与48h时转染效率分别为（54±5）％和（36±4）％；CDH1 sinNA2转染INPC 48h时INPC CDH1 mRNA表达水平较CDH1 siRNA3降低，且两者均低于CDH1 siRNA1（P〈0．05）。结论本研究成功构建大鼠INPC CDH1 siRNA真核载体。