细胞周期蛋白依赖性激酶样-5基因所致发育性癫痫性脑病的临床电生理特点

目的探讨细胞周期蛋白依赖性激酶样-5(Cyclin-dependent kinase-like 5,CDKL5)基因所致发育性癫痫性脑病(Developmental and epileptic encephalopathies,DEE)的临床及电生理特点。方法回顾性分析2016年6月-2024年5月就诊于北京大学第一医院儿童医学中心的CDKL5相关发育性癫痫性脑病(CDKL5-DEE)患儿临床资料和系列视频脑电图(Video electroencephalography,VEEG)。结果共纳入16例CDKL5-DEE患儿,其中女13例、男3例。所有患儿均为CDKL5基因新生变异,其中错义变异6例、移码变异5例、无义变异4例、大片段缺失1例。起病年龄为出生后8天龄(d)~1岁(y)10月龄(m),中位年龄(85.94±95.76)d。起病时癫痫发作类型:强直发作4例[起病年龄10~52 d,中位年龄中位年龄(25.5±15.84)d];局灶性发作5例[起病年龄8 d~8 m,中位年龄(77.76±85.97)d];癫痫性痉挛发作4例[起病年龄3 m~1 y 10 m,中位年龄(6.25±3.49)m];双侧强直-阵挛发作2例[起病年龄30~40 d,中位年龄(35.00±5.00)d];局灶性发作并发癫痫性痉挛1例(起病年龄2 m)。16例患儿共进行了59次4 h VEEG监测。所有结果均为异常,其中背景正常26次、背景慢节律差25次、无背景8次;间期为后头部或局灶性放电16次、多灶放电19次、广泛性或伴局灶/多灶放电17次、高度失律7次;发作期监测到癫痫性痉挛发作33次、肌阵挛发作6次、局灶性发作5次、强直-阵挛发作2次、不典型失神发作2次、强直发作2次、肌阵挛序贯局灶性发作1次、局灶序贯成串痉挛1次、过度运动-强直-成串痉挛发作1次。6月龄以内的患儿背景均正常,随年龄增长,背景异常明显增多。发作间期2岁以内放电更多灶,2岁以后广泛性放电明显。结论CDKL5-DEE癫痫发作起病早且药物难治。癫痫性痉挛是每个患儿均出现的发作类型,且持续时间长,随年龄增长全面性发作明显增多。脑电图特点为6月龄以内背景正常,随年龄增长背景及间期放电均具有恶化趋势。

卡配因I-细胞周期依赖性蛋白激酶5通路在血管性痴呆小鼠海马中的变化

目的观察脑缺血-再灌注导致的血管性痴呆小鼠不同时间点海马组织卡配因I(CalpainI)-细胞周期依赖性蛋白激酶5(Cdk5)通路表达的变化。方法雄性昆明小鼠160只,随机分为假手术组(n=65)和模型组(n=95)。采用双侧颈总动脉反复缺血-再灌注的方法制备血管性痴呆(VD)模型。术后第4周和第6周应用水迷宫实验进行行为学测试,免疫组化观察海马CA1区CalpainI的表达,RT-PCR观察Cdk5的mRNA表达,Western-blot检测Cdk5的蛋白表达。结果术后第4周和6周时模型组小鼠的学习、记忆成绩均明显劣于假手术组小鼠(P<0.05)。术后第4周模型组海马CA1区神经元CalpainI表达的平均光密度值(0.0900±0.0100)较假手术组(0.0332±0.0043)显著增高(P<0.05),Cdk5 mRNA表达(0.91±0.07)较假手术组(0.35±0.02)显著增高(P<0.05);术后第6周模型组海马CalpainI表达的平均光密度值(0.1040±0.0084)较假手术组(0.0327±0.0045)显著增高(P<0.05),Cdk5 mRNA表达较假手术组显著增高(0.80±0.07vs0.53±0.05,P<0.05)。结论Calpain I-Cdk5通路参与了脑缺血-再灌注后小鼠VD的发生。

HSV-1感染后认知功能障碍小鼠海马组织细胞周期素依赖性蛋白激酶5mRNA的表达

目的探讨细胞周期素依赖性蛋白激酶5(CDK5)在单纯疱疹病毒-1型(HSV-1)感染后认知功能障碍小鼠海马组织中的表达变化及其作用。方法将雄性C57BL/6小鼠100只随机分为模型组、假手术组及正常组。采用颅内注射法建立单纯疱疹病毒性脑炎(HSE)动物模型,感染后20 d进行水迷宫实验评价认知功能,应用RT-qPCR方法检测小鼠海马组织CDK5 mRNA的相对表达量。结果与正常组及假手术组比较,模型组小鼠学习、记忆能力受损明显,模型组小鼠海马组织CDK5的表达水平明显升高(P<0.05)。结论 CDK5有可能参与了HSV-1感染后小鼠认知功能障碍的发生。

细胞周期蛋白依赖性激酶-2两种剪接体在SH-SY5Y细胞中共表达

目的观察细胞周期蛋白依赖性激酶-2(CDK-2)在SH-SY5Y细胞中的表达情况。方法采用RT-PCR方法研究CDK-2的表达,用DNA银染技术观察PCR产物,割胶回收后,克隆到载体上、测序。结果在聚丙烯酰胺胶上可以观察到两条DNA带,相对分子质量小的DNA带染色较弱;将两条DNA带切下,回收后与载体连接,测序证实两条DNA带均为CDK-2基因的产物。结论CDK-2的两种剪接形式在SH-SY5Y细胞中共表达,其中一种剪接形式是第五外显子缺如,但其表达量比较弱,其作用机制仍有待于进一步研究。

细胞周期依赖性蛋白激酶-5在C型尼曼-皮克病神经元变性中的作用

目的确定细胞周期依赖性蛋白激酶-5(cyclin dependent kinases-5,cdk5)在C型尼曼-皮克病(Niemann-Pickdisease type C,NPC)神经元变性过程中的作用,为NPC的临床治疗提供可能的药物作用靶点。方法将针对cdk5基因的si RNA序列克隆入rAAV-2载体,对4周龄npc-/-小鼠进行小脑rAAV-cdk5-si RNA-GFP注射(n=8),以空载体病毒(rAAV-GFP)注射组及非手术的同龄npc小鼠为对照(n=8)。在干预后4周连续观察小鼠脑内cdk5水平及小鼠神经生化和病理的改变。结果注射后1周可见针道附近、小脑深部核团及浦肯野细胞出现绿色荧光蛋白表达。与空载体病毒组相比,注射4周后小鼠脑内cdk5的表达水平降低34.17%(P<0.05,n=6);轴突球状体数量减少30.76%(P<0.05,n=6),存活浦肯野细胞数增加300%(P<0.05,n=8);细胞骨架蛋白磷酸化程度降低16.32%(P<0.05,n=6)。结论rAAV2-cdk5-si RNA小脑注射,能显著减轻npc小鼠神经生化和病理改变。cdk5的激活在NPC神经元变性过程中起到了关键性的作用,有可能成为NPC治疗的新靶标。

糖尿病大鼠脑细胞周期依赖性蛋白激酶5和蛋白激酶A参与调节Tau蛋白磷酸化

细胞周期依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase5,Cdk-5)及蛋白激酶A(protein kinaseA,PKA)是调节Tau蛋白磷酸化的重要激酶,其对糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠脑内Tau蛋白磷酸化的作用如何,目前尚不明确.为探讨胰岛素缺乏的DM大鼠海马Cdk-5及PKA对Tau蛋白磷酸化的作用,用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立DM大鼠模型,Fura-2负载及荧光测定细胞内游离Ca2+浓度,免疫沉淀法测定Cdk-5活性,放射性配体结合实验检测PKA的活性,蛋白质印迹检测Tau蛋白磷酸化的水平.结果提示:在DM大鼠海马神经元,Ca2+浓度升高,Cdk-5及PKA活性升高,Tau蛋白在Ser198/Ser199/Ser202和Ser396/Ser404位点的磷酸化增强.Cdk-5的特异性抑制剂roscovitine可降低DM大鼠Cdk-5活性,但不能降低PKA活性,使Tau蛋白在Ser198/Ser199/Ser202位点磷酸化水平降低,但不降低Ser396/Ser404位点的磷酸化,roscovitine处理正常大鼠后,上述酶的活性及Tau蛋白的磷酸化无明显变化.首次从整体水平上证实DM大鼠海马Cdk-5及PKA活性升高,协同促进Tau蛋白在Ser198/Ser199/Ser202位点和Ser396/Ser404位点的磷酸化,神经元内游离Ca2+浓度升高可能起重要作用.

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B反义RNA1靶向微小RNA-339-5p对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的 探讨长链非编码RNA细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B反义RNA1(lncRNA CDKN2B-AS1)对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及分子机制。方法 收集南阳市中心医院2017年1月2019年1月收治的37例乳腺癌患者的癌组织及癌旁组织。将MDA-MB-453细胞分为CDKN2B-AS1阴性对照(si-NC组)、CDKN2B-AS1小分子干扰RNA(si-CDKN2B-AS1组)、CDKN2B-AS1小分子干扰RNA+miR-339-5p阴性对照(si-CDKN2B-AS1+anti-miR-NC组)以及CDKN2B-AS1小分子干扰RNA+miR-339-5p特异性寡核苷酸抑制剂(si-CDKN2B-AS1+anti-miR-339-5p组)。采用RT-qPCR法对CDKN2B-AS1及微小RNA-339-5p(miR-339-5p)表达水平进行检测;细胞周期及增殖活性检测分别采用流式细胞术及MTT实验;采用Transwell小室技术对细胞迁移和侵袭进行检测;采用Western blotting法对增殖标记蛋白细胞增殖核抗原-67(Ki67)、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(P21)、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达进行检测;荧光素酶报告实验检测CDKN2BAS1对miR-339-5p的靶向调控。结果 在乳腺癌组织中CDKN2B-AS1表达水平上调[(2.23±0.08)比(1.00±0.06)](P<0.05)。抑制CDKN2B-AS1可增加G0期细胞比例[(43.29±3.76)%比(30.25±3.01)%]、P21表达水平升高,S期细胞比例[(21.91±3.10)%比(34.19±3.32)%]、细胞存活率[(53.02±5.38)%比(100.00±7.12)%]、迁移、侵袭数以及Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.05)。CDKN2B-AS1靶向调控miR-339-5p,抑制miR-339-5p逆转抑制CDKN2B-AS1对MDA-MB-453细胞增殖、迁移、侵袭的作用。结论 抑制CDKN2B-AS可抑制乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖、迁移、侵袭,且靶向调控miR-339-5p表达。

微小RNA-K1-5p调控G1/S期相关基因的表达影响内皮细胞周期

目的探讨卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS)相关疱疹病毒(KSHV)编码的微小RNAs(miR),如miR-K1-5p,对KS细胞周期的调控作用及其机制。方法该研究进行于2020年1—12月,人脐静脉内皮细胞购自美国ScienCell。生物信息学软件预测miR-K1-5p的靶基因。双萤光素酶试验验证miR-K1-5p的靶基因[细胞周期素依赖性激酶抑制剂4(CDKN4)]。将miR-K1-5p模拟物转染后,行蛋白质印迹法(Western blotting)和q-PCR检测,分析G1/S期相关基因CDKN4、细胞周期蛋白A/细胞周期素依赖性激酶2(Cyclin A/CDK2)、细胞周期蛋白D2/细胞周期素依赖性激酶4(Cyclin D2/CDK4)的表达。碘化丙啶(PI)染色检测miR-K1-5p对内皮细胞(HUVECs)周期的影响。结果miR-K1-5p靶向CDKN4(miR-K1-5p mimics+CDKN4-WT组、mimics NC+CDKN4-WT组、miR-K1-5p mimics+CDKN4-MUT组、mimics NC+CDKN4-MUT组萤光素酶活性分别为0.42±0.05、0.81±0.04、0.82±0.03、0.80±0.05),负性调控CDKN4的表达(P<0.001),正性调控Cyclin A/CDK2和CyclinD2/CDK4的表达(P<0.05)。此外,miR-K1-5p可以加速细胞周期进程,促进G1/S期转换[S+G2期/G1+S+G2期:mimics组(23.37±0.29)%比mimics NC组(15.00±0.75)%,G1期:mimics组(76.63±0.28)%比mimics NC组(85.00±0.76)%,S期:mimics组(15.34±0.36)%比mimics NC(8.45±0.20)%,G2期:mimics组(8.02±0.17)%比mimics NC组(6.55±0.80)%]。结论miR-K1-5p调控G1/S期相关基因的表达影响内皮细胞周期。

抑制细胞周期依赖性蛋白激酶-5表达对C型尼曼-皮克病小鼠的神经保护作用

目的:观察抑制细胞周期依赖性蛋白激酶-5(cdk5)的表达对C型尼曼-皮克病(NPC)小鼠(npc-/-)的治疗作用。方法:采用携带cdk5特异性小干扰RNA(cdk5-siRNA)的重组腺相关病毒rAAV-cdk5-siRNA-GFP,对出生三天内的npc-/-小鼠进行双侧侧脑室注射,以rAAV-GFP注射组及非手术的同龄npc小鼠为对照(n=6～10/组);采用免疫组织化学染色、HE染色和小鼠衣架悬挂试验来评价小鼠脑内的神经病理改变和运动功能。结果:rAAV2-cdk5-siR-NA-GFP能显著减少轴突球状体的数量,延缓浦肯野细胞的死亡并改善npc-/-小鼠的运动功能。结论:降低cdk5的活性对npc-/-小鼠的神经元有一定的保护作用。

周期蛋白依赖性激酶-5在创伤性脑损伤中的表达变化研究

目的:探讨周期蛋白依赖性激酶-5(cyclin-dependent kinase-5,CDK5)在创伤性脑损伤(traumaticbrain injury,TBI)组织中的表达变化及其意义。方法:建立成年SD(Sprague-Dawley)大鼠TBI模型,应用免疫荧光方法检测CDK5在大鼠脑组织中的细胞定位,Western blot和RT-PCR方法检测大鼠脑组织中CDK5蛋白和mRNA的时间表达变化。结果:免疫荧光双标结果显示,CDK5与小胶质细胞的标记物CD11b、神经元的标记物NeuN共定位。CDK5在大鼠脑组织损伤后蛋白表达迅速升高,在3d升至最高点,之后逐渐降低,7d达到最低,14d后趋于平稳;RT-PCR的结果与Western blot相似。结论:急性脑损伤可诱导CDK5的表达变化和mRNA表述,这种改变可能参与脑损伤后小胶质细胞的活化和增殖过程,并与神经元的凋亡有关。

细胞周期调控基因及Bcl-2、c-Jun基因在人肝细胞脂肪变性过程中的表达变化

目的观察细胞周期调控基因及Bcl-2、c-Jun基因在人肝细胞L02脂肪变性过程中的表达变化。方法以油酸和软脂酸(2∶1)混合液处理L02细胞0、5、10、20 h,建立人肝细胞脂肪变性模型。用油红O染色检测L02细胞内脂质含量;用荧光定量PCR技术检测L02细胞脂肪变性过程中CDK2、CDK4、Cyclin D1、Bcl-2、c-Jun mRNA表达。结果随造模时间延长,L02细胞内橘红色脂滴聚集越来越多,至造模20 h,肝细胞染成橘红色。L02细胞内CDK2 mRNA相对表达量逐渐升高,造模5 h达最高(P均<0.05),随后逐渐下降;CDK4 mRNA相对表达量逐渐升高,造模10 h达最高(P均>0.05),随后逐渐下降,造模20 h最低(P均>0.05);不同时间点Cyclin D1 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P均>0.05);Bcl-2 mRNA相对表达量随造模时间延长而升高,造模10 h达最高(P<0.05),随后降低;造模5、10、20 h的c-Jun mRNA相对表达量均较造模0 h高(P均<0.05),但无变化规律。结论人肝细胞L02脂肪变性过程中癌症相关基因CDK2、CDK4、Bcl-2、c-Jun表达先升高后降低,Cyclin D1表达变化不明显。

细胞周期蛋白依赖性激酶样5缺乏症相关癫痫治疗药物——加奈索酮

加奈索酮被FDA批准其用于治疗与细胞周期蛋白依赖性激酶样5(CDKL5)缺乏症(CDD)相关的癫痫发作。其作用机制通过对突触和突触外γ-氨基丁酸(GABA)A受体的作用,发挥出抗癫痫活性。临床试验结果表明,与安慰剂相比,加奈索酮显著降低了CDD患者相关癫痫的发作频率,且该药物在患者中具有比较好的安全性和耐受性。本文对其药物代谢动力学、药物有效性、药物安全性及药物相互作用等内容进行总结,旨在为临床用药提供基本参考。

治疗儿童细胞周期蛋白依赖性激酶样5缺乏症相关癫痫发作新药Ztalmy

Ztalmy口服混悬剂于2022年3月由美国食品药品监督管理局(FDA)正式批准用于2岁及以上与细胞周期蛋白依赖性激酶样5缺乏症(CDD)相关的癫痫发作患者。Ztalmy的主要活性成分是ganaxolone,是一种神经活性类固醇衍生物,为突触和突触外γ-氨基丁酸A(GABAA)受体的选择性阳性变构调节剂,从而增加突触GABAA受体的阶段性抑制,同时增加突触外受体的强直抑制,具有抗癫痫和抗焦虑活性。现对其作用机制、药效学、药代动力学、临床研究及安全性等作一介绍。

老年慢性阻塞性肺疾病患者外周血miR-2682-5p、CDKN1A水平与病情程度及预后的关系

目的探讨老年慢性阻塞性肺疾病患者外周血微小RNA-2682-5p(miR-2682-5p)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(CDKN1A)水平与病情程度及预后的关系。方法选取2017年8月至2021年8月在该院诊治的老年慢性阻塞性肺疾病患者110例作为研究组,根据病情严重程度分为轻度组(42例)、中度组(37例)和重度组(31例)。另选取同期在该院进行体检的110例健康者作为对照组。根据随访中患者预后情况将研究组进一步分为不良组(25例)和良好组(85例)。采用实时荧光定量PCR法测定miR-2682-5p水平,酶联免疫吸附试验法测定CDKN1A水平。采用Pearson法分析miR-2682-5p、CDKN1A水平与炎症因子、肺功能指标相关性,Logistic回归分析影响老年慢性阻塞性肺疾病发生预后不良的影响因素,受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-2682-5p、CDKN1A水平预估老年慢性阻塞性肺疾病发生预后不良的临床诊断价值。结果研究组miR-2682-5p及肺功能指标第1秒用力呼气容积(FEV_(1))、第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV_(1)%pred)和第1秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV_(1)/FVC)明显降低,CDKN1A及炎症因子白细胞介素-33(IL-33)、降钙素原(PCT)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平明显升高(P<0.05)。Logistic比较结果显示,随着病情越加重,miR-2682-5p水平显著降低(P<0.05),而CDKN1A水平显著升高(P<0.05)。miR-2682-5p水平与炎症因子水平呈负相关,与肺功能指标水平呈正相关(P<0.05),而CDKN1A水平与炎症因子水平呈正相关(P<0.05),与肺功能指标水平呈负相关(P<0.05)。不良组血清miR-2682-5p及肺功能指标水平明显降低(P<0.05),CDKN1A、PCT水平明显升高(P<0.05)。miR-2682-5p、FEV_(1)是影响老年慢性阻塞性肺疾病发生预后不良的保护因素,CDKN1A是影响老年慢性阻塞性肺疾病发生预后不良的危险因素。miR-2682-5p、CDKN1A联合检测老年慢性阻塞性肺疾病发生预后不良的曲线下面积(AUC)明显高于单独诊断(P<0.05)。结论miR-2682-5p、CDKN1A二者联合可较好地评估老年慢性阻塞性肺疾病患者的病情严重程度及预后不良发生情况。

miR-K1-5p相关的G1/S期基因编码的蛋白在卡波西肉瘤中的表达

目的研究miR-K1-5p相关的G1/S期基因编码的蛋白在卡波西肉瘤中表达的意义。方法利用生物信息软件miRDB和TargetScan Custom筛选miR-K1-5p的靶基因。使用生物信息数据库确定靶基因参与的信号通路,分析通路上的关键基因。应用免疫组化法检测靶基因及关键基因(miR-K1-5p相关的G1/S期基因)编码的蛋白在卡波西肉瘤和作为对照的血管瘤中的表达,并分析患者性别、年龄与蛋白表达以及各蛋白表达之间的相关性。结果细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂4(CDKN4)是miR-K1-5p的靶基因,参与细胞周期信号通路,通路下游关键基因为细胞周期蛋白A(CCNA)、细胞周期蛋白D2(CCND2)、周期素依赖性激酶2(CDK2)、周期素依赖性激酶4(CDK4)。免疫组化检测各基因编码的蛋白,CDKN4在卡波西肉瘤中的阳性率低于血管瘤,CCNA、CCND2、CDK2、CDK4在卡波西肉瘤中的阳性率高于血管瘤(P均<0.05);在卡波西肉瘤中CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2和CDK4的表达与性别、年龄均无关(P均>0.05);在卡波西肉瘤中CDKN4与CCNA、CCND2、CDK2和CDK4的表达均呈负相关,CCNA、CCND2、CDK2、CDK4各蛋白之间的表达互为正相关(P均<0.05)。结论miR-K1-5p相关的G1/S期基因编码的蛋白(CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4)的异常表达在卡波西肉瘤发生、发展中可能发挥重要作用。

类细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5基因突变相关癫痫性脑病1例

类细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5（cyclin dependent kinase-like 5,CDKL5）基因突变相关的早发癫痫性脑病近年来屡见报道,但国内相关报道较少。本文就1例诊断明确的CDKL5基因突变相关的早发癫痫性脑病患儿临床过程报告如下并总结其临床特点。1临床资料患儿女,1岁8个月。因＂反复抽搐1年2个月＂于2014-09-02在福建省泉州市儿童医院小儿神经科入院治疗。

转染ELF5基因的人卵巢癌干细胞增殖、周期、凋亡及成瘤能力变化

目的观察转染ELF5基因的人卵巢癌干细胞增殖、周期、凋亡及成瘤能力变化。方法将人卵巢癌干细胞(具有CD133+、CD117+特征的人卵巢癌细胞株HO8910)分为重组质粒组、空质粒组和空白对照组,重组质粒组转染真核细胞表达载体pc DNA3.1-ELF5+EGFP,空质粒组转染空载质粒pc DNA3.1-EGFP,空白对照组不做转染;分别于培养24、48、72、96 h后采用CCK-8法观察细胞增殖能力,于培养48 h后采用流式细胞仪观察细胞周期分布情况、测算细胞凋亡率,于培养48 h后采用Western blotting法检测各组细胞中的p21、Caspase-3蛋白。将重组质粒组、空质粒组和空白对照组细胞分别接种于雌性裸鼠右腋窝皮下制作卵巢癌移植瘤,每组接种5只;待移植瘤形成后取肿瘤组织,测量肿瘤最大直径及质量,测算细胞凋亡率,检测细胞中的p21、Caspase-3蛋白。结果重组质粒组培养24、48、72、96 h后细胞增殖能力较空质粒组和空白对照组明显下降(P均<0.05)。重组质粒组中阻滞于G0/G1期的细胞比例、细胞凋亡率及细胞中p21、Caspase-3蛋白相对表达量均高于空质粒组和空白对照组(P均<0.05)。重组质粒组移植瘤最大直径和肿瘤质量小于空质粒组、空白对照组(P均<0.05)。重组质粒组移植瘤组织中细胞凋亡率及p21、Caspase-3蛋白相对表达量高于空质粒组和空白对照组(P均<0.05)。结论转染ELF5基因的人卵巢癌干细胞增殖受抑制、细胞周期阻滞、细胞凋亡增多、成瘤能力减弱,机制可能与p21、Caspase-3蛋白表达上调有关。

2型糖尿病患者外周血淋巴细胞中CDKAL1基因及其剪接异构体的表达水平和临床意义

目的:探讨2型糖尿病(T2DM)患者外周血淋巴细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶5调节亚基相关蛋白1类似物1(CDKAL1)基因及其剪接异构体的表达水平,并探讨其临床意义。方法:收集65例糖尿病患者,其中T2DM患者20例(T2DM组)、糖尿病肾病(DN)患者23例(DN组)和糖尿病视网膜病变(DR)患者22例(DR组),并选择同期健康体检者28名(健康对照组)。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组研究对象外周血淋巴细胞中CDKAL1基因及其2种剪接异构体CDKAL1-X1和CDKAL1-X2表达水平,分析其表达与T2DM及其糖尿病微血管并发症的关系。结果:与健康对照组比较,T2DM组患者外周血淋巴细胞中CDKAL1基因表达水平升高(Z=4.705,P<0.01),CDKAL1-X1表达水平升高(Z=2.698,P=0.007)。与健康对照组比较,DR组和DN组患者外周血淋巴细胞中CDKAL1基因和CDKAL1-X1表达水平升高(P<0.05);DR组患者外周血淋巴细胞中CDKAL1基因表达水平高于DN组(P<0.05)。结论:T2DM患者外周血淋巴细胞中CDKAL1基因和CDKAL1-X1表达水平升高可能参与糖尿病及其并发症的发生发展。

miR-142-5p通过影响上皮间质转化抑制肺腺癌H1650细胞的侵袭与迁移

目的:探讨肺腺癌组织中miR-142-5p的表达及其对H1650细胞增殖、侵袭、迁移及上皮间质转化(epithelieal-mesenchymal transition,EMT)的影响及其作用机制。方法:收集2014年1月至2015年1月在河北医科大学第四医院胸外科行肿瘤切除并经病理证实的107例肺腺癌患者的癌组织及其癌旁组织标本,以及人肺腺癌细胞系H1650、HCC827、A549、H1975、PC9和人支气管上皮细胞BEAS-2B,用qPCR实验检测肺腺癌组织及细胞中miR-142-5p的表达水平及其与患者临床特征的关系。分别用miR-142-5p模拟物(mimics)、miR-阴性对照质粒(miR-NC)转染H1650细胞后,用CCK8、细胞划痕愈合和Transwell侵袭实验分别检测H1650细胞的增殖、侵袭和迁移能力。使用生物信息学工具预测miR-142-5p的靶基因,通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-142-5p对靶基因的调控作用,Western blotting检测细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase 5,CDK5)及EMT相关蛋白的表达水平。结果:肺腺癌组织及细胞系中miR-142-5p表达水平显著低于癌旁组织及BEAS-2B细胞(均P<0.01);107例肺腺癌组织中,61例(57.01%)低表达miR-142-5p,其表达水平与患者的TNM分期、淋巴结转移密切相关(均P<0.01)。转染miR-142-5p模拟物后,H1650细胞中miR-142-5p高表达,细胞的增殖、侵袭和迁移能力显著降低(均P<0.05或P<0.01)。生物信息学工具预测CDK5是miR-142-5p的靶基因,经双荧光素酶报告基因验证,miR-142-5p可显著降低H1650细胞中CDK5的表达水平,显著提高E-cadherin表达,降低N-cadherin和Snail的表达水平(均P<0.01)。结论:miR-142-5p在肺腺癌组织和细胞中呈低表达状态,其通过下调CDK5表达影响EMT抑制H1650细胞的侵袭与迁移能力。

LncRNA PVT1对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞活性的影响及其机制

目的 探究长链非编码RNA(LncRNA)浆细胞瘤变体异位基因1(PVT1)对弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞生物学行为的影响,并分析其潜在机制。方法 收集41例DLBCL病人和15例淋巴结反应性增生(RLH)病人的组织标本,体外培养人正常B淋巴细胞GM12878和人DLBCL细胞(OCI-Ly3、U2932、TMD8),对TMD8细胞进行转染,将其分为control组(只转染Lipofectamine-2000)、si-NC组(转染si-NC)、inhibitor-NC组(转染inhibitor-NC)、si-PVT1组(转染si-PVT1)、miR-145-5p inhibitor组(转染miR-145-5p inhibitor)、si-PVT1+miR-145-5p inhibitor组(转染si-PVT1和miR-145-5p inhibitor)。应用qRT-PCR方法检测各组细胞PVT1 mRNA和miR-145-5p表达,Western Blot方法检测CDK6蛋白表达,CCK-8法检测TMD8细胞增殖,流式细胞术检测TMD8细胞周期变化,Transwell实验检测TMD8细胞迁移和侵袭能力,RNA pull down和双荧光素酶报告基因法验证PVT1、miR-145-5p与细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)的靶向关系。结果 DLBCL组织PVT1 mRNA、CDK6蛋白的表达水平高于RLH组织,miR-145-5p表达低于RLH组织(t=14.264~24.445,P<0.05)。与GM12878细胞比较,OCI-Ly3、U2932、TMD8细胞中PVT1 mRNA、CDK6蛋白表达均增加,miR-145-5p表达均减少(F=69.557~234.718,P<0.05)。6组细胞PVT1 mRNA、miR-145-5p、CDK6蛋白表达及增殖率、G0/G1期细胞比例、S期细胞比例、迁移和侵袭细胞数差异有统计学意义(F=25.589~319.150,P<0.05);与control组比较,si-PVT1组细胞PVT1 mRNA、CDK6蛋白、增殖率、S期细胞比例、迁移和侵袭数量降低,miR-145-5p表达、G0/G1期细胞比例升高(P<0.05),miR-145-5p inhibitor组呈相反变化(P<0.05);下调miR-145-5p表达可减弱敲低PVT1对TMD8细胞恶性生物学行为的抑制作用(P<0.05)。过表达PVT1 mRNA增高CDK6蛋白表达、细胞增殖率、S期细胞比例、迁移和侵袭数量,降低miR-145-5p表达、G0/G1期的细胞比例(F=38.025~327.887,P<0.05)。miR-145-5p是PVT1的靶基因,且miR-145-5p可靶向下调CDK6表达。结论 敲低PVT1可抑制DLBCL细胞恶性生物学行为,其作用机制可能与调控miR-145-5p/CDK6轴有关。