人干细胞因子受体膜外区1～3免疫球蛋白样结构域的表达、纯化及活性

目的 在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体（c-Kit）配体结合区膜外N端1～3免疫球蛋白样结构域（c-Kit/Ig1～3）,研究其配体结合活性.方法 采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1～3双突变片段（c-Kit/Ig1～3DM）,构建pET16b-c-Kit/Ig1～3DM表达质粒,转化E.coli BL21（DE3）诱导表达,稀释复性,镍柱纯化.将C端添加组氨酸标签的c-Kit/Ig1～3基因克隆入真核表达载体pEAK12中,转染HEK293 ET细胞构建c-kit/Ig1～3高效表达细胞株,从细胞培养上清中使用镍金属螯合柱收集纯化蛋白.His-tag pull-down和酶联免疫结合实验检测融合蛋白配体结合活性.结果 在大肠杆菌中c-Kit/Ig1～3^DM以包涵体形式表达,复性后配体结合活性很低.在HEK293 ET细胞中筛选到2个高效表达c-Kit/Ig1～3的细胞株,上清表达量为2μg/ml,融合蛋白相对分子质量为58 000;受体配体结合实验显示真核表达的c-Kit/Ig1～3有明显的干细胞因子特异结合活性,解离常数Kd值为9.39 nmol/L.结论获得了具有较高配体结合活性的c-Kit/Ig1～3融合蛋白.

盘状结构域受体1通过调控NF-κB/NLRP3信号通路介导的细胞焦亡对高糖诱导血管内皮功能障碍的影响

目的 探究盘状结构域受体1 (discoidin domain receptor 1,DDR1)对高糖诱导血管内皮细胞功能障碍的作用机制。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HU VECs),首先分为对照组(Control)、高糖诱导组(high glucose,HG),采用33 mmol·L^(-1) D-glucose处理48 h构建HUVECs功能障碍。碘化丙啶染色(PI)检测细胞焦亡情况;酶联免疫吸附法(ELISA)测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、IL-1β、IL-18水平;Western blot检测DDR1、NF-κB/NLRP3信号通路蛋白及细胞焦亡相关蛋白表达;随后,实验分为C ontrol组、HG组、HG+DDR1 NC组、HG+DDR1 siRNA组。转染DDR1 siRNA 24 h后观察HG对HUVECs增殖和迁移能力的影响;ELISA检测内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、细胞间黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)及LDH、IL-1β、IL-18水平;PI检测细胞焦亡情况;Western blot检测DDR1、NF-κB/NLRP3信号通路蛋白及细胞焦亡相关蛋白表达。结果 与Control组相比,HG组细胞eNOS含量降低,VCAM-1、ICAM-1含量升高,细胞活力及迁移能力降低,DDR1、p-NF-κB、NLRP3及细胞焦亡相关蛋白表达均明显升高,且LDH、IL-1β、IL-18水平及细胞焦亡率均增加(P<0.05)。与HG组相比,DDR1siRNA能够促进eNOS分泌,降低VCAM-1、ICAM-1、LDH、IL-1β、IL-18水平,增加细胞活力和迁移能力,降低p-NF-κB、NLRP3及细胞焦亡相关蛋白表达,抑制高糖诱导的HU VECs焦亡(P<0.05)。结论基因沉默DDR1能够改善高糖诱导的血管内皮细胞功能障碍,其机制与抑制NF-κB/NLRP3信号通路介导的细胞焦亡相关。

抑制lncRNA TUG1下调核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白1炎症小体在延缓阿尔茨海默病进展的作用

目的探讨敲低长链非编码RNA(lncRNA)牛磺酸上调基因1(TUG1)抑制核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白1(NLRP1)炎症小体在缓解阿尔茨海默病进展中的作用。方法选取9~10周龄遗传背景为C57/BL6的野生型小鼠(WT组,10只)或淀粉样前体蛋白(APP)/早老素1(PS1)转基因小鼠(30只)。APP/PS1转基因小鼠随机分为模型(model)组,模型+敲低lncRNA TUG1组[model+lncRNA TUG1短发夹RNA(shRNA)组]和model+shRNA非靶标(NT)组,每组10只。分别采集12周龄第1天(3月龄)和32周龄第1天(8月龄)小鼠外周血和脑皮质组织,并分离皮质中的原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞,每个时间点每组5只小鼠。Real-time PCR分别测定3月龄和8月龄上述4个分组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)mRNA的水平,以及原代星形胶质细胞中补体蛋白C1r和C1s mRNA的水平。ELISA法测定其外周血浆中MIF含量。对3月龄和8月龄小鼠脑皮质原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞共培养。CCK-8法测定上述2种细胞的增殖能力。Western blotting分别测定3月龄和8月龄上述4个分组小鼠脑皮质组织中MIF、白细胞介素1β前体(pro-IL-1β)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)、NLRP1及NLRP3蛋白的表达水平。采用免疫荧光染色法测定8月龄各分组小鼠脑皮质组织中β淀粉样蛋白(Aβ)表达。结果3月龄和8月龄时,与WT组小鼠相比,model组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF相对表达水平显著上调,原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞增殖能力增强(P<0.05)。与model组相比,model+lncRNA TUG1 shRNA组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF的相对表达水平显著降低,原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞增殖能力降低(P<0.05)。与WT组相比,model组小鼠外周血浆中MIF含量显著升高;小鼠脑皮质组织中pro-IL-1β、ASC、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)、NLRP1以及NLRP3的蛋白表达水平显著升高;Aβ免疫荧光强度明显增强(P<0.05)。与model组相比,model+lncRNA TUG1 shRNA组小鼠外周血浆中MIF含量显著降低;小鼠脑皮质组织中pro-IL-1β、ASC、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)和NLRP1的蛋白表达水平显著降低,Aβ免疫荧光强度明显降低(P<0.05),而NLRP3蛋白质的表达水平无明显变化(P>0.05)。与model组相比,model+shRNA NT组小鼠上述所有检测指标差异均无显著性(P>0.05)。结论APP/PS1转基因小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF因子表达上调与脑皮质内NLRP1炎症小体激活成正相关,敲低lncRNA TUG1可缓解阿尔茨海默病的进展。

水稻中两个同源异型结构域转录因子的亚细胞定位

为了对水稻同源异型结构域转录因子HD-ZipⅢ家族中的HDZ1和HDZ2进行亚细胞定位,利用RT-PCR技术从水稻cDNA中扩增HDZ1和HDZ2的编码区(去除终止密码子序列),与绿色荧光蛋白GFP编码框融合,构建2个转录因子的瞬时表达载体,采用农杆菌介导的转化方法转化至烟草中进行瞬时表达分析.结果表明:PCR扩增所得为目的基因片段HDZ1和HDZ2;二者与载体质粒pCAMBIA35S-GFP连接获得的融合表达载体成功移至烟草中并表达;确定HDZ1主要定位于烟草叶片的气孔中,而HDZ2定位于烟草表皮细胞的细胞膜上.二者在亚细胞中的定位不同,可能在水稻生长发育中所起的作用也不相同.

神经营养因子受体同源物2通过上调proNGF、sortilin、p75NTR表达诱导脑出血后血肿周围脑组织细胞凋亡

目的探讨脑出血后不同时期血肿周围脑组织中神经营养因子受体同源物2(NRH2)、神经生长因子前体(pro NGF)、sortilin、神经营养因子受体p75(p75NTR)表达及与细胞凋亡的关系。方法收集临床脑出血后实施血肿清除术的周围组织标本,根据脑出血距离标本取出时间,分为6h以内(包括6h)、6h以上至24h(包括24h)、24h以上至72h(包括72h)、72h以上4组,同时取10例手术过程中血肿远隔部位掉落的组织块作为对照组,通过末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法(TUNEL)测定脑细胞的凋亡指数(AI),采用实时荧光定量PCR、Western blot法分别检测脑组织中NRH2、pro NGF、sortilin、p75NTR mRNA和蛋白表达,Western blot法检测脑组织中Bcl-2、Bax的表达。体外培养大鼠皮层星形胶质细胞,经NRH2 siRNA或scramble siRNA转染后,Western blot法检测pro NGF、sortilin、p75NTR蛋白表达。结果与对照组以及6h以内的脑出血组相比,脑出血后6h以上各组AI升高,以24h以上至72h内组为最高,但6h以内的脑出血组AI与对照组无区别。随着脑出血时间的延长,pro NGF、p75NTR mRNA和蛋白表达水平逐渐升高,24h以上至72h达到高峰,72h后仍处于较高水平。与对照组和6h以内的脑出血组比较,脑出血后6h以上至24h内(包括24h),脑组织NRH2、sortilin的mRNA与蛋白表达水平及Bax表达水平即增加,24h以上至72h内达高峰,72h后仍维持在较高水平。但与对照组比较,6h以内的脑出血组上述指标无显著性差异。与对照组相比,6h以内的脑出血组Bcl-2表达水平无明显变化,脑出血后6h以上的脑出血各组脑组织Bcl-2表达水平降低,以24h以上至72h内处于最低值。NRH2 siRNA组pro NGF、sortilin、p75NTR蛋白表达水平明显低于空白对照组、scramble siRNA组。结论 NRH2在脑出血后血肿周围脑组织中表达增加,通过促进pro NGF、sortilin、p75NTR表达增加Bax/Bcl-2比率,从而诱导脑细胞凋亡。

人胰岛素样生长因子1受体β结构域蛋白的原核表达及活性检测

目的构建人胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)β亚基胞外结构域(ED)和胞内激酶(PKD)结构域的原核表达载体,获得纯化的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法用PCR方法从乳腺cDNA文库中扩增IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体。重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用Western blot法检测融合蛋白表达,最后用GST pull-down技术检测纯化蛋白与已知蛋白表皮生长因子受体2驱动的细胞运动调节蛋白(MEMO)的相互作用。结果构建得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,测序后与目的序列一致;在Rossate菌中诱导表达出与预期位置相符的目的蛋白,并经过Western blot检测,融合蛋白成功表达;纯化得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD两个融合蛋白,GST pull-down证明蛋白GST-IGF1Rβ-PKD可以和MEMO相互作用。结论成功克隆GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因,并获得活性良好的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD蛋白。

白血病抑制因子受体细胞内区对HL-60细胞表达CD14和CD15的影响

观察白血病抑制因子 (LIF)受体gp190亚基完整的细胞内区和gp190胞内区C末端片段(190CT)对人白血病系HL 6 0表达CD14、CD15的影响 ,进一步了解LIF引发白血病细胞增殖抑制和分化的关系 .用基因重组技术将LIF另一亚基gp130的细胞内区换成gp190的细胞内区 ,用PCR技术扩增gp190细胞内区C末端的一个多肽的编码序列 ,构成嵌合体受体基因 130 /190及 190CT片段 ,并分别在HL 6 0细胞表达 .用免疫组化和流式细胞术检测分析在LIF的诱导下 ,HL 6 0细胞表达CD14、CD15的水平 .转染pcDNA130 /190的HL 6 0细胞 ,CD15表达量明显增高 ;转染pcDNA190CT的细胞 ,CD15的表达量降低 ;但 2组细胞的CD14表达量均较低且水平接近 .LIF可能诱导HL 6 0细胞向粒细胞而不向单核细胞分化 ,该效应是由gp190亚基细胞内区介导的 ,而gp190C末端片段可干扰LIFα受体介导的信号传导效应 .

血管内皮生长因子激酶功能区受体基因沉默抑制肺癌A549细胞增殖并增强其对多西他赛的敏感性

目的研究沉默血管内皮生长因子激酶功能区受体(kinase.domain insert containing receptor,KDR)基因对人肺癌A549细胞增殖以及对化疗药物多西他赛敏感性的影响。方法设计合成:KDR的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列,Lipofectamine^(TM)2000转染入A549细胞。通过反转录-聚合酶链反应和Western Blot检测KDR基因沉默后KDR mRNA及蛋白的表达情况,利用流式细胞仪检测A549细胞的周期变化。采用四甲基偶氮唑盐比色法及细胞克隆形成实验观察,沉默KDR基因后A549细胞对多西他赛的敏感性。结果KDR基因经48 h沉默后,A549细胞的KDR基因和蛋白的表达出现较明显的下降(P<0.05)。A549细胞的周期在G0/G1期阻滞,S期细胞数目减低(P<0.05)。在KDR基因沉默组,A549细胞对多西他赛的敏感性有明显的增强(P<0.05)。结论KDR-siRNA能够明显沉默A549细胞KDR基因和蛋白的表达,并能抑制A549细胞的增殖,增强其对多西他赛的敏感性。

胰高血糖素样肽-1受体激动剂对糖耐量减低大鼠胰岛β细胞胰腺十二指肠同源盒因子-1的影响

糖耐量减低（IGT）是2型糖尿病（T2DM）患者的必经阶段,近20年来T2DM呈迅猛发展,Yang等[1]研究显示,城市、乡镇和富裕农村20岁以上人群中糖调节受损的患者达15.5%,平均每年有10%～15%的发展为糖尿病。

含锌指和BTB结构域7B(ZBTB7B/ThPOK)及其相关因子在T细胞分化及功能中的作用

含锌指和BTB结构域7B(ZBTB7B/ThPOK)是CD4谱系分化中的关键转录因子,并抑制CD8谱系生成。ThPOK蛋白表达促进CD4谱系分化,维持CD4谱系稳定性,并抑制CD8谱系分化。首先在胸腺内,ThPOK基因表达受T细胞受体(TCR)信号、基因增强子、基因沉默子等调节,且ThPOK表达受GATA结合蛋白3(GATA3)、Runt相关转录因子3(Runx3)、白血病/淋巴瘤相关因子(LRF)、胸腺细胞选择相关性高迁移率族盒基因(TOX)、Myc关联的锌指蛋白相关因子(MAZR)、E1A结合蛋白p300(P300)等转录因子影响,进而影响CD4、CD8谱系分化。而在外周T细胞中,ThPOK影响CD_4^+T细胞亚群、CD_8^+T细胞分化及功能。在此基础上,正逐步展开针对外周疾病中ThPOK作用的研究。

成纤维细胞生长因子受体3胞外配体结合区的重组表达及其与A型肉毒毒素重链C端的相互作用

目的:实现成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)胞外配体结合区FGFR3D23的表达与纯化,并鉴定其与A型肉毒毒素重链C端(Bo NT/AHc)的相互作用。方法:全基因合成的FGFR3D23基因片段经酶切连入p TIG(+)质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达,获得的包含体经Ni2+柱纯化,透析复性后通过pull-down及ELISA检测纯化蛋白与Bo NT/AHc的相互作用。结果与结论:SDS-PAGE分析结果显示得到相对分子质量约27×103的蛋白特异表达条带,表达量为1.39 mg/L,包含体占73.4%;纯化和复性得到的目的蛋白纯度约96%,复性率约3%;pull-down及ELI-SA实验结果证明FGFR3D23可以与Bo NT/AHc特异性地相互作用。

Eps15同源结构域包含蛋白2通过调控Cyclin D1-CDK4-pRb信号轴影响食管鳞癌细胞的增殖

微丝结合蛋白是微丝细胞骨架的重要组成成分,它们通过促进微丝的聚合和解聚来影响微丝的动力学。大量研究已经表明,微丝和微丝结合蛋白参与细胞癌变的所有阶段。我们通过对食管癌蛋白质组数据挖掘结果显示,微丝结合蛋白Eps15同源结构域包含蛋白2(EHD2)在食管癌组织中低表达,且EHD2低表达的食管癌患者预后不良。以往的研究已经证明,EHD2参与调控糖代谢、自噬和肿瘤迁移。然而,EHD2在食管癌进展中的作用和机制仍不清楚。本研究旨在探究EHD2在食管鳞癌细胞中的影响及其作用机制。免疫荧光和细胞组分分离结果显示,EHD2不仅定位于细胞膜和细胞质,还存在于细胞核中。使用克隆形成实验、EdU细胞增殖实验和细胞流式术检测EHD2对食管鳞癌细胞增殖能力的影响。结果显示,过表达EHD2和EHD2-3×NLS(核定位信号)抑制食管鳞癌细胞增殖和细胞周期G_(1)/S转换;同时,双荧光素报告基因结果显示,过表达EHD2和EHD2-3×NLS抑制Wnt信号通路活性。而siRNA敲降则获得相反的结果。免疫共沉淀和Duolink-PLA实验证明,EHD2与Wnt信号通路关键分子β-连环蛋白(β-catenin)和T细胞因子3(T-cell factor 3,TCF3)相互作用。蛋白质印迹和荧光定量PCR结果证实,过表达EHD2和EHD2-3×NLS抑制TCF3下游与增殖和细胞周期相关的靶基因的转录,以及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白激酶4(CDK4)和pRb的蛋白质表达。以上结果表明,核EHD2与β-catenin和TCF3复合体相互作用,通过Cyclin D1-CDK4-pRb信号轴来调控食管鳞癌细胞的增殖和细胞周期进程。

TRGV及预后相关趋化因子/受体基因在T细胞淋巴瘤中的表达变化

目的分析非γδ T细胞型的T细胞淋巴瘤患者外周血中T细胞受体γ(TCR γ)亚家族可变区Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(TRGVⅠ、Ⅱ、Ⅲ)基因和预后相关趋化因子及其受体基因(CCL20、CCR6、CCL17、CCL22以及CCR4)的表达情况,探讨γδ T细胞与趋化因子/受体表达的相关性及其与疾病转归的相关性。方法收集27例非γδ T细胞型的T细胞淋巴瘤患者外周血样本,同时收集9例健康志愿者外周血样本作为对照。采用荧光实时定量PCR检测T细胞淋巴瘤患者以及正常人外周血中TRGVⅠ~Ⅲ亚家族基因以及CCL20/CCR6、CCL17/CCL22/CCR4基因的表达水平。结果初发组、难治复发组和缓解组的TRGVⅠ~Ⅲ亚家族的表达水平与正常组相比均有不同程度的增高,且TRGV亚家族表达模式发生改变。初发组和难治复发组的CCL22和CCR4的表达水平显著高于正常组,而CCL17表达水平显著低于正常组。初发、缓解和难治复发组的患者外周血中TRGV各亚家族基因与各趋化因子及受体基因表达水平的相关性模式也发生改变。初发组和难治复发组存在低表达的TRGVⅡ亚家族,治疗缓解后TRGVⅡ亚家族的表达升高。结论 TRGVⅡ亚家族可能是抗T细胞淋巴瘤的T细胞功能亚群,可能与疾病的发病和转归相关。T细胞淋巴瘤中高表达水平的CCL22/CCR4,可能与疾病的发病有关。

非小细胞肺癌组织及胸水中EGFR基因TKD结构域突变的临床病理研究

目的检测非小细胞肺癌(NSCLC)EGFR基因酪氨酸蛋白激酶结构域(TKD)18～21外显子突变情况;比较常见突变(19号外显子的缺失突变及21号外显子错义突变-L858R)和非常见突变患者的临床病理改变。方法从91例NSCLC组织及胸水标本中提取基因组DNA;巢式PCR方法扩增EGFR基因18～21外显子;应用PCR-LIS-SSCP及直接测序方法检测EGFR基因18～21外显子突变情况;对存在常见及非常见突变患者的组织病理、酪氨酸蛋白激酶小分子抑制剂(TKIs)的治疗反应和预后等的临床病理改变进行分析。结果91例NSCLC患者中27例存在EGFR基因TKD突变,其中常见突变19例,突变率为20.9%(19/91);非常见突变8例(其中4例为20号外显子的短片段插入突变),突变率为8.8%(8/91)。两组患者组织学类型均为腺癌,且对TKIs治疗均有较好反应。2例非常见突变患者化疗时出现肺间质纤维化(ILD)。结论NSCLC患者EGFR基因TKD存在多种非常见突变;具有非常见突变的患者可能存在独特的临床病理改变。

死亡结构域沉默子和p65在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达及与化疗的关系

目的探讨凋亡调控基因死亡结构域沉默子(SODD)在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)中的表达、临床意义及与磷酸化-NF-κB-p65表达的相关性,研究ALL2种常用化疗药物对SODD表达的影响,试图寻找化疗新靶点。方法免疫组织化学SABC法检测25例儿童ALL骨髓细胞SODD、p65蛋白表达水平;长春新碱(VCR)处理Jurkat细胞后,Annexin-V-Fluorescence/PI双标记的流式细胞术检测细胞凋亡发生率,免疫印迹法检测SODD及p65在化疗药物作用下的表达变化。结果25例ALL中,SODD和p65表达的阳性率较健康对照组高,其中高危病例组SODD阳性表达率较标危病例组阳性表达率高,有显著性差异(Pa<0.05),且骨髓细胞中SODD与p65表达呈正相关(r=0.69P<0.01);VCR能有效诱导Jurkat细胞凋亡,在该凋亡过程中,SODD及p65表达下调,并呈时间依赖性,但柔红霉素(DNR)不能有效下调SODD的表达。结论SODD和p65均参与了ALL的发生发展,且存在一定的协同关系,SODD与ALL临床分型及预后有密切关系;VCR特异下调白血病细胞中SODD的表达及抑制NF-κB的活化,恢复白血病细胞的凋亡敏感性。

肿瘤坏死因子Ⅰ型受体及其在细胞增殖和凋亡调节中的作用研究进展

肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）及其受体（tumor necrosis factor receptor,TNFR）在机体生命活动中发挥重要作用,对TNF/TNFRs的功能和起源的研究经历了相当长的时间[1]。这个历史可以追溯到19世纪后期,当时观察到人类感染某些细菌后出现某些肿瘤的退化现象。这些结果导致肿瘤学家W Coley用命名为＂Coley＇s toxin＂的细菌提取物治疗人类癌症[2]。

基于NOD样受体热蛋白结构域3/胱天蛋白酶-1通路探讨鱼腥草注射液缓解脂多糖诱导的小鼠急性肺炎肺损伤的作用机制

目的探究鱼腥草注射液(HHI)对急性肺炎小鼠的保护作用及对NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)/胱天蛋白酶-1(caspase-1)通路的调控作用。方法2019年7月至2020年6月,将购自广东省医学实验动物中心的90只BALB/c雄性小鼠分为正常对照组、模型组、HHI低(10 mL/kg)及高(30 mL/kg)剂量组、NLRP3激动剂(DDC)组(300 mg/kg)、HHI+DDC组(30 mL/kg+300 mg/kg),每组15只。除正常对照组外,其余各组均通过雾化吸入脂多糖(LPS)2.5 g/L建立急性肺炎模型。末次给药后检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)水平、中性粒细胞数目;取右肺,检测右肺湿重/干重(W/D);左肺组织病理损伤情况,肺组织凋亡相关斑点样蛋白(ASC)mRNA及蛋白、NLRP3 mRNA及蛋白、TNF-α、IL-6、caspase-1蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,模型组小鼠出现肺泡破坏及炎性细胞浸润等病理损伤现象,W/D、IL-6[(1692.06±95.26)µg/L比(569.91±50.89)µg/L]、TNF-α[(1846.24±99.26)µg/L比(506.99±55.48)µg/L]水平及中性粒细胞数目[(66.24±2.56)×10^(6)个/毫升比(5.09±1.98)×10^(6)个/毫升]、肺组织NLRP3 mRNA及蛋白(1.01±0.13比0.22±0.12)、ASC mRNA及蛋白(1.03±0.13比0.29±0.11)、caspase-1(1.06±0.14比0.25±0.12)、TNF-α、IL-6蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,HHI低、高剂量组肺泡破坏及炎性细胞浸润等现象缓解,W/D、小鼠BALF中炎性因子IL-6[(1069.13±75.12)µg/L、(889.02±65.13)µg/L比(1692.06±95.26)µg/L]、TNF-α[(1225.33±84.02)µg/L、(806.63±69.12)µg/L比(1846.24±99.26)µg/L]含量及中性粒细胞数目[(45.33±2.22)×10^(6)个/毫升、(22.63±2.02)×10^(6)个/毫升比(66.24±2.56)×10^(6)个/毫升]、肺组织中NLRP3 mRNA及蛋白(0.83±0.11、0.52±0.12比1.01±0.13)、ASC mRNA及蛋白(0.82±0.12、0.54±0.11比1.03±0.13)、caspase-1(0.80±0.15、0.59±0.12比1.06±0.14)、TNF-α、IL-6蛋白表达降低(P<0.05);DDC组小鼠上述指标与HHI低、高剂量组相反(P<0.05)。结论HHI可通过抑制NLRP3/caspase-1通路激活,改善肺炎小鼠炎症反应,缓解肺损伤。

EGFR胞内酪氨酸激酶结构域在人肿瘤细胞中的稳定表达

目的:探讨在人肿瘤细胞中稳定表达EGFR-TKD的方法。方法:采用磷酸钙共沉淀基因转染技术,将已构建的pEF-BOS/GST-EGFR-TKD质粒DNA与pBabe-puro质粒DNA共同导入体外培养的人非小细胞肺癌细胞系H1299中。加入嘌呤霉素,对转染的细胞加压筛选,以获得成功转染的细胞。免疫荧光法对重组质粒在H1299中的表达水平及定位进行检测。结果:经嘌呤霉素筛选,8d后对照组细胞全部死亡。转染组部分细胞存活,形成单克隆集落,经多次传代培养后,荧光显微镜下观察见多数集落的细胞胞质内表达GST-EGFR-TKD。结论:通过磷酸钙共沉淀法可成功转染H1299细胞,获得稳定表达EGFR-TKD的人肿瘤细胞。

同源结构域相互作用蛋白激酶2的研究进展

同源结构域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)是一个核内丝氨酸／苏氨酸激酶,作为辅助因子,广泛参与转录调控。HIPK2位于核斑,在Sp100和TP53INPls的辅助下能够磷酸化p53的46位丝氨酸,加速p53的乙酰化,拮抗MDM2对p53的抑制作用,强化p53的功能。通过磷酸化,HIPK2加速CtBP和c- Myb被蛋白酶体降解,引起细胞发生不依赖p53的凋亡或分化。许多肿瘤细胞低表达HIPK2,表明HIPK2 可能是一个重要的抑癌基因。