拮抗CC趋化因子受体5信号诱导肿瘤细胞凋亡并调节肿瘤微环境抑制肿瘤生长

目的探索拮抗CC趋化因子受体5(CCR5)信号通路对肿瘤生长和肿瘤微环境的影响。方法采用CCK8细胞毒试验研究CCR5选择性拮抗剂Maraviroc体外对小鼠Lewis肺腺癌细胞增殖的影响,并运用流式细胞术和RT-PCR检测肿瘤细胞凋亡和Caspase 8基因的表达。然后采用免疫荧光组织化学染色法研究了Maraviroc对小鼠体内肿瘤生长和肿瘤微环境中CD4^(+)和CD8^(+)以及Foxp3^(+)细胞比例的影响。结果拮抗CCR5信号在体内外均能够抑制癌细胞的生长。体外研究发现:CCR5拮抗剂可通过增强凋亡基因Caspase 8表达而诱导肿瘤细胞凋亡。在小鼠体内,CCR5拮抗剂可明显增加肿瘤微环境中CD4^(+)和CD8^(+)细胞的浸润而减少Foxp3^(+)细胞的浸润。结论拮抗CCR5信号可能通过诱导肿瘤细胞凋亡,逆转免疫抑制性肿瘤微环境而抑制肿瘤生长。

凋亡诱导因子基因敲减对骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的影响

背景:众多基础与临床试验证实:骨髓间充质干细胞移植后的低存活率严重制约着其发挥长期的治疗效果。课题组前期研究发现凋亡相关因子在骨髓间充质干细胞凋亡过程中发挥了重要作用,其中凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)蛋白可能是其中一个关键因子。目的:将AIF敲减的骨髓间充质干细胞移植至小鼠梗死心肌中,验证低AIF表达骨髓间充质干细胞移植后的存活情况以及对进一步改善心功能的重要性。方法:首先,通过LV-AIF-shRNA慢病毒感染骨髓间充质干细胞下调AIF蛋白表达,应用流式细胞术及Western blot、RT-qPCR检测慢病毒的感染效率,CCK-8检测AIF敲减骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的细胞活力;然后,构建急性心肌梗死小鼠模型,分别将正常及AIF敲减的骨髓间充质干细胞移植至心肌梗死区域,免疫荧光检测AIF蛋白的表达,ELISA检测血清脑钠尿肽水平,心脏超声检测心功能,Masson染色观察心肌纤维化情况,RT-qPCR检测AIF敲减骨髓间充质干细胞移植后SRY基因表达反映细胞存活情况。结果与结论:①LV-AIF-shRNA慢病毒感染成功构建AIF基因敲减的骨髓间充质干细胞,感染效率为97.7%,且AIF表达有显著下降(P<0.001);②在缺血缺氧培养状态下,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞较正常骨髓间充质干细胞的细胞活力显著增加;③与移植正常骨髓间充质干细胞相比,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞移植后在梗死心肌中的存活数目显著升高至3.71倍(P<0.001),并且显著减少了梗死区域AIF蛋白表达、心肌纤维化程度;④与移植正常骨髓间充质干细胞相比,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞移植后血清脑钠尿肽水平显著降低(P<0.05),左室射血分数、左室缩短分数均有显著改善(P<0.05);⑤结果表明:AIF基因敲减可通过增强骨髓间充质干细胞移植后的细胞活力、增加骨髓间充质干细胞在供体内的存活从而减少心肌纤维化,改善急性心肌梗死后心功能。

岩藻黄质活化核因子E2相关因子2改善糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡

背景:骨质疏松症发病率高,易导致骨折等并发症的发生,而现有药物干预不良反应大,难以满足临床需求。目的:探索岩藻黄质对糖皮质激素诱导成骨细胞骨质疏松症模型的作用与潜在机制。方法:将原代大鼠成骨细胞接种于6孔板内,待细胞融合度达到80%后分4组干预:对照组单纯培养24 h,糖皮质激素组使用地塞米松干预24 h,岩藻黄质组使用岩藻黄质干预24 h,糖皮质激素+岩藻黄质组使用地塞米松与岩藻黄质同时干预24 h。干预结束后,检测细胞增殖、凋亡、细胞内活性氧含量以及凋亡相关蛋白、骨形成相关蛋白、细胞核核因子E2相关因子2的蛋白表达。结果与结论:①CCK-8检测显示,与对照组比较,糖皮质激素组细胞活性降低(P<0.05);与糖皮质激素组比较,糖皮质激素+岩藻黄质组细胞活性升高(P<0.05);②JC-1线粒体膜电位染色与流式细胞学检测显示,与对照组比较,糖皮质激素组细胞凋亡比例增加(P<0.05);与糖皮质激素组比较,糖皮质激素+岩藻黄质组细胞凋亡比例减少(P<0.05);③Western Blot检测显示,与对照组比较,糖皮质激素组BAX、裂解聚ADP核糖聚合酶的蛋白表达升高(P<0.05),BCL2、Ⅰ型胶原蛋白α1肽链、碱性磷酸酶、骨钙蛋白、RUNX2的蛋白表达降低(P<0.05);与糖皮质激素组比较,糖皮质激素+岩藻黄质组BAX、裂解聚ADP核糖聚合酶的蛋白表达降低(P<0.05),BCL2、Ⅰ型胶原蛋白α1肽链、碱性磷酸酶、骨钙蛋白、RUNX2的蛋白表达升高(P<0.05);④荧光探针检测显示,与对照组比较,糖皮质激素组活性氧含量增加(P<0.05);与糖皮质激素组比较,糖皮质激素+岩藻黄质组活性氧含量减少(P<0.05);⑤免疫荧光染色与Western Blot检测显示,与对照组比较,糖皮质激素组细胞核核因子E2相关因子2的蛋白表达降低(P<0.05);与糖皮质激素组比较,糖皮质激素+岩藻黄质组细胞核核因子E2相关因子2的蛋白表达升高(P<0.05);⑥结果表明,岩藻黄质通过活化核因子E2相关因子2改善糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡与骨形成相关分子表达。

胰岛素样生长因子结合蛋白2对高血糖环境诱导人足细胞凋亡的影响及机制研究

背景糖尿病肾病患者日益增加,仍有患者在现有治疗中进展为终末期肾病,因此迫切需要新型治疗靶点。目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin like growth factor binding protein 2,IGFBP2)对高血糖环境诱导人足细胞凋亡的影响及机制。方法体外培养的人足细胞随机分为正常血糖(normal glucose,NG)组(5 mmol/L)以及高血糖(high glucose,HG)24 h组、HG 48 h组、HG 72 h组(30 mmol/L)。采用RT-qPCR法检测IGFBP2、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)和细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)mRNA表达水平,Western blot检测IGFBP2和Cleaved Caspase 3蛋白表达水平,以此确定后续实验HG处理的最佳时间点。将IGFBP2小干扰RNA转染进入足细胞并分为NG组、阴性对照干预组(NG-NC-siRNA)、IGFBP2敲低siRNA干预组(NG-IGFBP2-siRNA1、NG-IGFBP2-siRNA2、NG-IGFBP2-siRNA3),RT-qPCR检测IGFBP2 mRNA表达水平,选择敲低效率最高的IGFBP2-siRNA用于后续实验。根据实验内容将足细胞随机分为:(1)NG组和HG组;(2)NG组和NG+125 ng/mL rhIGFBP2组;(3)HG组和HG-IGFBP2-siRNA组。(1)(2)(3)均通过RT-qPCR检测TNF-α和ICAM-1 mRNA表达水平,JC-1染色法检测线粒体膜电位,共聚焦显微镜检测线粒体超氧化物和活性氧荧光强度,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果随HG处理时间增加,RT-qPCR结果显示IGFBP2、TNF-α和ICAM-1 mRNA水平随时间升高,Western blot结果显示IGFBP2和Cleaved Caspase 3蛋白水平随时间升高。与NG组比较,RT-qPCR结果显示IGFBP2、TNF-α和ICAM-1均在HG 72 h时mRNA水平最高(P<0.05),Western blot结果显示IGFBP2在HG 72 h时和Cleaved Caspase 3在HG 48 h时蛋白水平最高(P<0.05),据此选72 h为后续实验诱导时间点。RT-qPCR检测结果显示,与NG组相比,阴性对照干预组mRNA表达无统计学差异(P>0.05),NG-IGFBP2-siRNA2组IGFBP2 mRNA表达水平最低(P<0.05),敲除效率最高,因此选择IGFBP2-siRNA2进行后续实验。与NG组相比较,HG组线粒体膜电位绿/红色荧光强度比值、线粒体超氧化物和活性氧荧光强度以及细胞凋亡率均增强(P<0.05)。与NG组相比较,NG+125 ng/mL rhIGFBP2组的TNF-α和ICAM-1 mRNA水平、线粒体膜电位绿/红色荧光强度比值、线粒体超氧化物和活性氧荧光强度以及细胞凋亡率均升高(P<0.05)。与HG组相比较,HG-IGFBP2-siRNA组的TNF-α和ICAM-1 mRNA表达水平、线粒体膜电位绿/红色荧光强度比值、线粒体超氧化物和活性氧荧光强度以及细胞凋亡率均降低(P<0.05)。结论敲除IGFBP2后通过减弱高血糖处理下的线粒体功能紊乱和氧化应激降低人足细胞凋亡,因此抑制IGFBP2的表达有望成为糖尿病肾病的潜在治疗策略。

circCBLB抑制类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞增殖促进细胞凋亡并增加抗炎细胞因子水平

目的 探讨环状RNA Cbl原癌基因B(circCBLB)/miR-486-5p功能轴对类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(RA-FLS)增殖、凋亡及炎症因子产生的影响。方法 人RA-FLS,用100μL的10 ng/mL肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激RA-FLS建立模型。采用双荧光素酶靶向验证circCBLB/miR-486-5p的结合关系。构建pcDNA3.1/siRNA-circCBLB、阴性对照(pcDNA3.1-NC/si-NC)和mimics-miR-486-5p,分别转染至RA-FLS。实验分为对照组、 TNF-α处理的RA-FLS、 pcDNA3.1-circCBLB组、 pcDNA3.1-NC组、 si-circCBLB组、 si-NC组、 pcDNA3.1-circCBLB联合miR-486-5p-mimics组。采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡,平板集落形成实验检测细胞平板集落形成能力,实时定量PCR检测各组circCBLB、 miR-486-5p表达水平,ELISA检测各组细胞上清液抗炎因子白细胞介素4(IL-4)、 IL-10,促炎因子IL-6、 TNF-α水平。结果 双荧光素酶报告基因结果示circCBLB与miR-486-5p的3′非翻译区(3′UTR)结合;与同一时间点模型组细胞相比,过表达组细胞活力降低,干扰组升高;与模型组相比,过表达组凋亡率升高、 S和G2期的比例升高、集落形成率降低、 miR-486-5p表达水平降低、 IL-4、 IL-10水平升高,IL-6、 TNF-α水平降低;干扰组凋亡率降低、 S和G2期的比例降低、集落形成率升高、 miR-486-5p表达水平升高、 TNF-α水平升高;pcDNA3.1-circCBLB联合miR-486-5p-mimics组在circCBLB过表达的基础上,在细胞活力、细胞凋亡率、细胞周期、集落形成能力、抗炎因子的提高、促炎因子的降低方面对circCBLB的效应产生了抵消与逆转。结论 circCBLB抑制RA-FLS活力、提高细胞凋亡率、延长细胞周期降低细胞集落能力、提高抗炎因子,降低促炎因子,miR-486-5p则与circCBLB调控能力相反,且对circCBLB的效应具有一定的抵消与逆转能力。

成纤维细胞生长因子2通过抑制TET2/UQCRH表达拮抗血管平滑肌细胞凋亡和促进其增殖

[目的]探讨10-11转位蛋白2(TET2)/泛醌细胞色素C还原酶铰链蛋白(UQCRH)轴在成纤维细胞生长因子2(FGF-2)抑制血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡中的作用。[方法]正常培养的VSMC分为对照组、FGF-2组、FGF-2+成纤维细胞生长因子受体(FGFR)泛抑制剂LY2874455组。TET2基因过表达(OETET2)或UQCRH基因过表达(OEUQCRH)的VSMC分为对照组、FGF-2组、OETET2+FGF-2组或OEUQCRH+FGF-2组。采用Hoechst33342和PI染色检测细胞凋亡,CCK-8实验检测细胞增殖,Western blot检测凋亡相关蛋白pro-Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2及TET2、UQCRH表达水平。运用NCBI、methprimer网站预测分析UQCRH基因启动子CpG岛位点。[结果]FGF-2可抑制VSMC凋亡、促进其增殖,下调促凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、Bax和TET2、UQCRH表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达(与对照组相比,P<0.05),但不影响pro-Caspase-3表达(与对照组相比,P>0.05),LY2874455可对抗FGF-2的作用(与FGF-2组相比,P<0.05)。TET2或UQCRH过表达可逆转FGF-2对VSMC抗凋亡、促增殖的作用,促进促凋亡相关蛋白表达上调,抗凋亡蛋白表达下调(与FGF-2组相比,P<0.05)。UQCRH基因启动子区域存在3个CpG岛。过表达TET2能上调FGF-2处理的VSMC中UQCRH表达(与FGF-2组相比,P<0.05)。[结论]FGF-2通过抑制TET2和UQCRH表达,减少VSMC凋亡,促进其增殖。

线粒体裂变因子对OGD/R诱导的PC12细胞线粒体凋亡通路的影响

目的探究线粒体裂变因子(mitochondrial fission factor,MFF)在氧糖剥夺/复氧(oxygen glucose deprivation/re-oxygenation,OGD/R)处理的PC12细胞中的表达及其对线粒体凋亡通路的影响。方法选用PC12细胞系构建体外缺血性神经元损伤模型。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)实验明确MFF mRNA和蛋白在不同处理时间点的表达情况。通过RNA干扰技术沉默MFF基因表达,利用qRT-PCR、Western blot检测MFF mRNA和蛋白的表达情况;CCK-8检测沉默MFF对OGD/R处理的PC12细胞活力的影响;JC-1和试剂盒检测线粒体膜电位、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平变化;Western blot检测细胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)、Bax和Bcl2的表达;酶联免疫吸附法(ELISA)检测Caspase-3和Caspase-9的活性变化。结果MFF在体外OGD/R诱导的PC12细胞中的mRNA和蛋白含量明显升高。MFF沉默增强了OGD/R损伤后PC12细胞的活力,降低了细胞凋亡率,并促进Bcl2和抑制Bax蛋白的表达。敲低MFF明显提高了OGD/R处理后PC12细胞的线粒体膜电位,促进ATP合成,降低ROS含量,抑制线粒体细胞色素C释放和Caspase-3和Caspase-9的活性。结论沉默MFF基因显著提高了OGD/R处理后PC12细胞的存活率,改善了线粒体功能。

Y-box结合蛋白1通过沉默信息调节因子1 mRNA稳定性调节抑制人颗粒细胞凋亡在早发性卵巢功能不全中的作用与机制

目的:探讨Y-box结合蛋白1(YBX1)调节沉默信息调节因子1(SIRT1)对颗粒细胞增殖和凋亡的影响,研究YBX1和SIRT1在早发性卵巢功能不全(POI)患者及卵巢功能正常患者间表达水平差异及临床意义。方法:留取2022年6月至2023年7月于江苏大学第四附属医院生殖医学中心进行体外受精(IVF)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)助孕的POI患者(POI组)及卵巢储备功能正常患者(对照组)的颗粒细胞和血清,利用免疫印迹(WB)检测YBX1蛋白表达水平;利用实时荧光定量核酸扩增法(RT-qPCR)检测YBX1及SIRT1 mRNA表达水平,并分析血清中其与卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E_(2))、抗苗勒管激素(AMH)、窦卵泡数(AFC)的相关性;利用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(EdU)、细胞计数试剂8(CCK8)检测细胞增殖、原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡;RT-qPCR检测细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤因子-2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表达情况;RNA免疫沉淀(RIP)实验检测YBX1与SIRT1的相互作用。结果:与对照组患者相比,POI组患者颗粒细胞和血清中YBX1蛋白及SIRT1 mRNA的表达降低(P<0.05);血清中YBX1、SIRT1 mRNA表达与FSH、LH负相关(r<0,P<0.05),与E_(2)、AMH、AFC正相关(r>0,P<0.05);在颗粒细胞中上调YBX1后SIRT1蛋白表达量、SIRT1 mRNA的稳定性、EdU阳性率、细胞活性、PCNA mRNA表达量、Bcl2/BAX比值均增加(P<0.05),Caspase-3 mRNA表达量、TUNEL阳性率均降低(P<0.05)。结论:YBX1和SIRT1在POI患者中表达水平显著下调,且其表达水平与临床卵巢功能指标相关;YBX1结合SIRT1 mRNA增强其稳定性,可能促进颗粒细胞增殖,抑制细胞凋亡,提示YBX1和SIRT1有望成为POI诊疗的新靶点。

干扰素刺激因子对脂多糖诱导的小鼠树突状细胞坏死性凋亡的影响

目的 探讨干扰素刺激因子(STING)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠树突状细胞(DC)坏死性凋亡的影响。方法 LPS 1μg/mL刺激第3~10代对数生长期小鼠DC2.4细胞系,将DC分为对照组、LPS 6 h组、LPS 12 h组、LPS 24 h组和LPS 72 h组,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测磷酸化干扰素刺激因子(P-STING)、STING、磷酸化混合系激酶区域样蛋白(P-MLKL)、MLKL蛋白的表达。将转染含STING基因小干扰RNA序列慢病毒的DC分为敲减STING+磷酸盐缓冲液(PBS)组、敲减STING+LPS组,将转染空载慢病毒的DC分为空载体+PBS组、空载体+LPS组,给予相应刺激并培养12 h,通过流式细胞术检测细胞凋亡率,行核酸染料(SYTOX Green)染色观测细胞凋亡情况并计算凋亡率,Western blot检测P-STING、STING、P-MLKL、MLKL蛋白表达。结果 与对照组比较,LPS 12 h组STING蛋白表达显著升高(P<0.05),LPS 12 h组、LPS 24 h组P-MLKL/MLKL比值均显著升高(P<0.05),将12 h作为后续刺激时长。培养12 h,与PBS组比较,LPS组细胞的凋亡率显著上升,且LPS组细胞器普遍肿胀,细胞质中出现大量空泡,细胞膜完整性被破坏,细胞发生崩解。空载体组与敲减STING组细胞转染慢病毒72 h后,Western blot检测提示,sh1-STING敲减组STING蛋白较空载体组、sh2-STING敲减组和sh3-STING敲减组表达显著降低(P<0.05)。培养12 h,流式细胞术检测显示,空载体+PBS组、空载体+LPS组、sh1-STING敲减+PBS组、sh1-STING敲减+LPS组细胞凋亡率分别为(36.34±24.42)%、(52.57±35.77)%、(37.81±28.9)%、(46.45±32.44)%。培养12 h, SYTOX Green染色检测显示,空载体+PBS组、空载体+LPS组、sh1-STING敲减+PBS组、sh1-STING敲减+LPS组细胞凋亡率分别为(13.4±6.3)%、(67.6±24.0)%、(2.0±1.1)%和(7.1±4.2)%。培养12 h,与空载体+LPS组比较,sh1-STING敲减+LPS组细胞凋亡率以及细胞中P-MLKL/MLKL比值均显著降低(P<0.05);与空载体+PBS组比较,空载体+LPS组P-MLKL/MLKL比值明显升高(P=0.011);但与敲减STING+PBS组比较,敲减STING+LPS组P-MLKL/MLKL比值差异不显著(P=0.889)。结论 LPS刺激下小鼠DC中STING蛋白表达增强,并于12 h达到活化高峰,且活化的STING蛋白对细胞坏死性凋亡具有显著的促进效应。

X-染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1通过自噬途径调控Caspase 1介导的胃肠道间质瘤细胞焦亡

目的:探究X-染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF1)对人胃肠道间质瘤(GIST)细胞中半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase 1)介导的细胞焦亡的影响及机制。方法:实时荧光定量PCR和Western blot检测人正常胃黏膜上皮细胞系(RGM-1)和GIST细胞系(GIST-T1、GIST-430、GIST-882)中XAF1的表达水平;采用脂质体介导转染法将pcDNA3.1-XAF1重组质粒染进GIST-882细胞,以构建高表达XAF1的GIST-882细胞。GIST-882细胞分为对照组、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1空载体质粒)、pcDNA3.1-XAF1组(转染pcDNA3.1-XAF1重组质粒)、pcDNA3.1-XAF1+Rap组(转染pcDNA3.1-XAF1重组质粒并给予自噬激活剂雷帕霉素处理),免疫荧光染色检测各组细胞内微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达情况,Western blot检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与Beclin1蛋白表达水平,ELISA法检测各组细胞上清中白细胞介素,IL-1β、IL-18含量,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测各组细胞LDH释放率,Western blot检测各组细胞中Caspase-1及其活化形式cleaved-Caspase-1、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、消皮素D(GSDMD)蛋白表达水平。结果:与RGM-1细胞比较,GIST-T1、GIST-430、GIST-882细胞中XAF1 mRNA和蛋白相对表达量显著减少(P<0.05);细胞转染后,pcDNA3.1-XAF1组GIST-882细胞中XAF1 mRNA和蛋白相对表达量均显著高于pcDNA3.1组、对照组(P<0.05)。与对照组比较,pcDNA3.1-XAF1组GIST-882细胞内LC3荧光强度明显减弱,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白相对表达量显著减少(P<0.05),细胞上清液IL-1β、IL-18含量及LDH释放率显著升高(P<0.05),Caspase-1、cleaved-Caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相对表达量也显著增加(P<0.05);与pcDNA3.1-XAF1组比较,pcDNA3.1-XAF1+Rap组GIST-882细胞内LC3荧光强度明显增强,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白相对表达量显著增加(P<0.05),同时,细胞上清液IL-1β、IL-18含量及LDH释放率显著下降(P<0.05),Caspase-1、cleaved-Caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相对表达量也显著减少(P<0.05)。结论:XAF1在GIST细胞中表达下降,提高XAF1表达能通过抑制自噬从而促进Caspase 1介导的GIST细胞焦亡,发挥抗肿瘤作用。

利拉鲁肽通过抑制线粒体依赖性凋亡及缺氧诱导因子1α表达对脊髓损伤的保护作用

探究利拉鲁对脊髓损伤的保护作用及其相关机制。方法 选取18只SD大鼠,分为三组,Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组,分别为对照组、应用等量生理盐水及利拉鲁肽组,每组6只,检测大鼠的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、凋亡相关因子配体(FASL)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、细胞色素c(Cyt-c)、Caspase3、Smac/Diablo,以及凋亡相关蛋白指标,对大鼠的下肢运动功能进行评估。结果 检测结果显示,利拉鲁肽对Caspase3、TNF-α、FASL、HIF-1α、P53、Cyt-c、Smac/Diablo有明显的抑制作用,并且能够逆转凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达。利拉鲁肽应用14d后,大鼠的下肢运功功能出现明显改善。结论 利拉鲁肽对脊髓损伤有保护作用,可以抑制线粒体依赖性凋亡,以及缺氧诱导因子1α表达,从而发挥显著的效果。

miR-660-3p靶向NFAM1对RSV诱导支气管上皮细胞凋亡及炎症因子分泌的影响

目的探讨微小RNA-660-3p(miR-660-3p)靶向具有ITAM基序1的NFAT活化蛋白(NFAM1)对呼吸道合胞病毒(RSV)诱导支气管上皮细胞凋亡和炎症因子分泌的影响。方法体外传代培养人支气管上皮细胞16HBE。取对数生长期16HBE细胞,随机分为对照组、RSV组、miR-660-3p+RSV组、miR-NC+RSV组、pcDNA-NC+RSV组、pcDNA-NFAM1+RSV组、miR-660-3p+pcDNA-NC+RSV组、miR-660-3p+pcDNA-NFAM1+RSV组,miR-NC+RSV组转染NC mimics,miR-660-3p+RSV组转染miR-660-3p mimics,pcDNA-NFAM1+RSV组转染pcDNA-NFAM1,pcDNA-NC+RSV组转染pcDNA-NC,miR-660-3p+pcDNA-NC+RSV组共转染pcDNA-NC和miR-660-3p mimics,miR-660-3p+pcDNA-NFAM1+RSV组共转染pcDNA-NFAM1和miR-660-3p mimics,对照组和RSV组不予转染;除对照组外,其余各组均予RSV感染,MOI设定为0.0001。收集各组细胞,采用RT-qPCR法检测miR-660-3p、NFAM1 mRNA表达,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用Western blotting法检测Cleaved-Caspase-3、NFAM1蛋白表达;收集各组培养上清液,采用ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1β。通过starBase数据库预测NFAM1与miR-660-3p的靶向结合位点,并采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-660-3p与NFAM1的靶向调控关系。结果与对照组比较,RSV组miR-660-3p表达降低,NFAM1 mRNA与蛋白及Cleaved-Caspase-3蛋白表达升高,细胞凋亡率及培养上清液TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高(P均<0.05)。与miR-NC+RSV组比较,miR-660-3p+RSV组miR-660-3p表达升高,Cleaved-Caspase-3蛋白表达以及细胞凋亡率和培养上清液TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低(P均<0.05)。与pcDNA-NC+RSV组比较,pcDNA-NFAM1+RSV组NFAM1 mRNA、Cleaved-Caspase-3蛋白表达以及细胞凋亡率和培养上清液TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高(P均<0.05)。经starBase数据库预测,NFAM1的3′非翻译区存在与miR-660-3p的结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示,相较于共转染NC mimics与NFAM1-WT的16HBE细胞,共转染miR-660-3p mimics与NFAM1-WT的16HBE细胞荧光素酶活性下降(P<0.05);相较于共转染NC mimics与NFAM1-MUT的16HBE细胞,共转染miR-660-3p mimics与NFAM1-MUT的16HBE细胞荧光素酶活性变化不明显(P>0.05)。与miR-660-3p+pcDNA-NC+RSV组比较,miR-660-3p+pcDNA-NFAM1+RSV组Cleaved-Caspase-3蛋白表达以及细胞凋亡率和培养上清液TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高(P均<0.05)。结论miR-660-3p可通过靶向负调控NFAM1抑制RSV诱导支气管上皮细胞凋亡及炎症因子分泌。

生长分化因子15抑制心肌梗死大鼠细胞凋亡的实验研究

目的:探讨生长分化因子15对心肌梗死大鼠的作用。方法:18只SPF级雄性SD大鼠根据随机数字表法分为模型组、实验组(A组GDF-15低剂量组10 ng/mL、B组GDF-15高剂量组50 ng/mL),每组6只,适应性喂养1周后,每天给药1次,连续1周,末次给药6 h后,各组大鼠均结扎冠状动脉左前降支进行心肌梗死造模。采用TUNEL/DAPI双染色法观察大鼠心肌细胞凋亡情况,分别统计凋亡细胞数及细胞总数,计算出细胞凋亡率。结果:与模型组相比,对照组B的细胞凋亡率显著减少(P Objective: To investigate the effect of growth differentiation factor 15 on myocardial infarction in rats. Methods: 18 SPF grade male SD rats were divided into model group and experimental group according to random number table method (group A, low-dose GDF-15 group, 10 ng/mL, group B, high-dose GDF-15 group, 50 ng/mL), with 6 rats in each group. After adaptive feeding for 1 week, the rats were given the drug once a day for 1 week. The left anterior descending branch of the coronary artery was lapped in each group for myocardial infarction modeling. TUNEL/DAPI double staining was used to observe the apoptosis of rat cardiomyocytes. The number of apoptotic cells and the total number of apoptotic cells were counted, and the apoptosis rate was calculated. Results: Compared with model group, the apoptosis rate of control group B was significantly decreased (P < 0.01), and GDF-15 reduced the apoptosis rate in a dose-dependent manner (P < 0.05). Conclusion: Growth differentiation factor 15 can reduce apoptosis in rats with myocardial infarction.

可溶性肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导因子在斑秃病人血清及皮损中的表达及临床意义

目的检测可溶性肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导因子(sTWEAK)在斑秃病人血清及皮损中的表达水平,并探讨其在斑秃发病过程中的作用及临床意义。方法以2017年10月至2018年11月在首都医科大学附属北京友谊医院确诊并治疗的斑秃病人70例为斑秃组,依据病情分为轻症组(44例)、重症组(26例)。同期该院因色素痣或皮肤良性肿瘤进行头皮手术的人群65例作为对照组。比较各组sTWEAK及相关细胞因子白细胞介素(IL)-4、IL-12、γ干扰素(IFN-γ)蛋白及mRNA表达水平;采用Pearson法分析两指标间相关性。多元线性回归分析各指标与sTWEAK或脱发严重度工具(SALT)评分的关系。结果斑秃组血清及皮损中sTWEAK表达水平[(196.73±32.48)ng/L,(2.35±0.62)ng/L]高于对照组[(121.75±19.62)ng/L,(1.49±0.45)ng/L](P<0.05)。斑秃组血清及皮损中细胞因子IL-12、IFN-γ表达水平高于对照组(P<0.05),IL-4表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。斑秃病人血清及皮损中sTWEAK表达水平与IL-12及IFN-γ呈正相关,与IL-4表达水平无明显相关性。轻症组血清及皮损中sTWEAK[(173.25±26.84)ng/L,(2.04±0.57)ng/L]、IL-12及IFN-γ表达水平低于重症组[(236.47±42.02)ng/L,(2.87±0.70)ng/L](P<0.05);轻症组、重症组血清及皮损中IL-4表达水平差异无统计学意义(P>0.05);斑秃病人血清、皮损处sTWEAK、IL-12、IFN-γ与SALT评分均呈正相关(P<0.05)。多元线性回归分析显示,IL-12、IFN-γ与血清和皮损处sTWEAK呈显著正相关;血清及皮损处sTWEAK、IL-12、IFN-γ与SALT评分存在正相关性(P<0.05)。结论斑秃病人血清及皮损中sTWEAK表达水平增加,与IL-12及IFN-γ呈正相关,sTWEAK、IL-12及IFN-γ均与斑秃病情严重程度密切相关,sTWEAK可能参与斑秃炎症反应过程。

缺氧诱导因子-1α通过调控MDA和SOD抑制急性缺血性脑卒中小胶质细胞焦亡的体外实验研究

目的体外实验探究缺氧诱导因子-1α(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)调控丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)对急性期缺血性脑卒中小胶质细胞(BV2)焦亡的调节作用及机制。方法构建小胶质细胞急性期氧糖剥夺复氧模型(OGD/R),应用CCK-8法确定模型最佳干预时机。对HIF-1α进行稳定剂GF-4592过表达和HIF-1α小分子干扰RNA(HIF-1α-siRNA)抑制表达,分为空白组(A组)、OGD/R模型组(B组)、OGD/R+FG-4592干预组(C组)、OGD/R+siRNA阴性对照组(D组)、OGD/R+HIF-1α-siRNA组(E组)。通过CCK-8法检测5组细胞增殖情况,流式细胞技术检测细胞焦亡情况。ELISA检测MDA、SOD、细胞上清IL-18、IL-1β水平。Western blot法检测不同组HIF-1α、GSDMD-D、GSDMD-N、cle-Caspase-1和NLRP3蛋白表达水平。结果确定缺氧6 h复氧12 h为最佳干预时间。与B组和D组比较,C组细胞增殖升高,细胞焦亡降低,MAD、SOD、IL-18、IL-1β水平显著降低,GSDMD-D、GSDMD-N、cle-Caspase-1和NLRP3靶蛋白的表达水平明显降低(P<0.05);而E组细胞增殖降低,细胞焦亡增加,MAD、SOD、IL-18,IL-1β,GSDMD-D、GSDMD-N、cle-Caspase-1和NLRP3靶蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论HIF-1α因子能有效调控小胶质细胞焦亡。HIF-1α可能通过调控MDA和SOD抑制急性缺血性脑卒中小胶质细胞焦亡。

针刺对脑心综合征大鼠脑组织细胞凋亡、炎症因子及丝裂原活化蛋白激酶/核因子-κB/激活蛋白-1信号通路的影响

目的探讨针刺对脑心综合征大鼠脑组织细胞凋亡、炎症因子及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)信号通路的影响。方法将36只SD大鼠随机分为针刺组、模型组和对照组,各12只。采用胶原酶加肝素联合注射大鼠尾状核制备脑心综合征大鼠模型,对照组给予等剂量生理盐水向大鼠尾状核注入,手术操作过程同模型组。模型组和假手术组均不予针刺;针刺组选心俞穴、内关穴、风府穴和水沟穴,每日针刺1次,连续3天。采用原位末端凋亡(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)法测定脑组织细胞凋亡情况;神经功能采用Zea-Longa法评估;运用酶联免疫法测定白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α水平;采用Western Blot法测定MAPK、NF-κB、AP-1蛋白表达。结果模型组和针刺组大鼠脑组织细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠脑组织AI低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠神经行为评分高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠神经行为评分低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠MAPK蛋白灰度值、NF-κB蛋白灰度值和AP-1蛋白灰度值高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠MAPK蛋白灰度值、NF-κB蛋白灰度值和AP-1蛋白灰度值低于模型组(P<0.05)。结论脑心综合征大鼠采用针刺可减轻大鼠脑组织细胞凋亡,减轻大鼠炎症因子,且可下调MAPK/NF-κB/AP-1信号通路表达。

阿奇霉素对胃癌细胞增殖、凋亡及炎症因子表达水平的影响

目的探讨阿奇霉素对人胃癌细胞(AGS细胞)上清液中炎症因子表达、增殖和凋亡的影响及核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的调控作用。方法体外培养AGS细胞,将其分为对照组(不进行干预)和不同水平(12.5、25.0、50.0、100.0μg/mL)阿奇霉素组,干预24 h,筛选阿奇霉素最适水平用于后续实验。细胞分组:对照组、阿奇霉素组(50.0μg/mL阿奇霉素)、阳性药物组(50.0μg/mL 5-氟尿嘧啶)、抑制剂组(50.0μg/mL阿奇霉素+1.0μmol/L NF-κB通路抑制剂BAY11-7082)和激活剂组(50.0μg/mL阿奇霉素+1.0μmol/L NF-κB通路激动剂Prostratin),干预24 h。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞活力;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞上清液中的炎症因子[白细胞介素(IL)-10及IL-1β]水平;采用5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)测定细胞增殖率;采用Hoechst33258染色试剂盒测定细胞凋亡率;采用蛋白免疫印迹(WB)法测定增殖细胞核抗原(PCNA)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及NF-κB通路相关蛋白表达水平。结果用CCK-8检测AGS细胞活力,根据实验结果选择50.0μg/mL阿奇霉素用于后续实验。与对照组比较,阿奇霉素组和阳性药物组AGS细胞上清液中IL-1β水平、细胞增殖率、PCNA表达水平、磷酸化(p)NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα明显降低(P<0.05),IL-10水平、细胞凋亡率和Caspase-3表达水平明显升高(P<0.05);与阿奇霉素组比较,抑制剂组中BAY11-7082的出现增强了阿奇霉素对AGS细胞的作用(P<0.05),激活剂组中Prostratin的出现则削弱了阿奇霉素对AGS细胞的作用(P<0.05)。结论阿奇霉素能抑制AGS细胞的炎症和增殖,并诱导其凋亡,其作用机制可能与阻滞NF-κB通路信号转导有关。

复方万年青胶囊联合化疗对中晚期非小细胞肺癌患者辅助性T细胞17/调节性T细胞失衡和血清凋亡因子的影响

目的 探讨复方万年青胶囊联合吉西他滨+顺铂(GP)化疗方案对中晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)失衡和血清凋亡因子的影响。方法 选择2018年3月至2021年2月西安医学院第一附属医院收治的98例中晚期NSCLC患者。按照随机数字表法将患者分为对照组和观察组,各49例。对照组接受GP化疗方案治疗;观察组在对照组基础上联合复方万年青胶囊口服治疗。以21 d为1个疗程,完成4个疗程的化疗。比较2组临床疗效以及治疗前后血清Th17、Treg、Th17/Treg比值、肿瘤标志物水平、凋亡因子水平。观察2组治疗期间不良反应发生情况。所有患者随访2年,记录无进展生存期(PFS)和总生存期。结果 治疗后,观察组客观缓解率和疾病控制率均高于对照组(均P<0.05)。治疗后,2组Treg均低于治疗前、且观察组低于对照组[(2.9±0.5)%比(4.8±0.8)%],2组Th17、Th17/Treg比值均高于治疗前、且观察组均高于对照组[(1.42±0.13)%比(1.25±0.11)%、(0.49±0.10)比(0.26±0.08)](均P<0.05);2组癌胚抗原、细胞角蛋白19片段、糖类抗原125、B淋巴细胞瘤基因2(Bcl-2)水平均低于治疗前、且观察组均低于对照组,2组Bcl-2相关X蛋白水平均高于治疗前、且观察组高于对照组(均P<0.05)。2组治疗期间不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组中位PFS、中位总生存期均长于对照组(均P<0.01)。结论 复方万年青胶囊联合GP化疗方案治疗中晚期NSCLC患者,可有效控制疾病进展,延长生存期,调节血清肿瘤标志物和血清凋亡因子水平,改善免疫功能。

中风活心软胶囊通过靶向微小RNA-126诱导缺氧诱导因子-1α/促凋亡调节蛋白BNIP3信号通路促进自噬减轻脑缺血再灌注损伤大鼠神经损伤的作用机制研究

目的探讨中风活心软胶囊通过靶向微小RNA(miRNA)-126诱导缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/促凋亡调节蛋白BNIP3信号通路促进自噬减轻脑缺血再灌注损伤大鼠神经损伤的作用机制。方法选取30只无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠,随机分为空白组、模型组与治疗组,每组10只。采用Zea Longa法建立右侧大脑中动脉缺血(MCAO)大鼠模型。治疗组给予中风活心软胶囊。采用改良神经功能损害评分(mNSS)评估大鼠神经功能缺损情况,透射电镜观察缺血半暗区皮质神经元及自噬囊泡超微结构,蛋白质免疫印迹(WB)法和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法分别检测缺血半暗区皮质雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、HIF-1α蛋白及其mRNA和miR-126的表达水平。结果模型组、治疗组mNSS评分均高于对照组,但治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1α蛋白表达水平均高于对照组,但治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1αmRNA表达水平均高于对照组,miR-126表达水平低于对照组,但治疗组mTOR、HIF-1αmRNA表达水平低于模型组,miR-126表达水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组缺血半暗区皮质神经元及电镜下自噬囊泡数量明显增加,细胞结构损坏减轻。结论中风活心软胶囊可显著提高脑缺血大鼠缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1α因子表达,其作用机制可能是通过激活miR-126表达进而靶向调控mTOR/HIF-1α信号通路,促进自噬,从而发挥其脑保护效应。

桃仁膝康丸对骨性关节炎相关细胞因子和软骨细胞凋亡的影响

目的:用细胞学方法探讨桃仁膝康丸治疗骨性关节炎的作用和机制。方法:人滑膜成纤维细胞采用肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)-α诱导建立急性炎症模型,采用脂多糖诱导建立巨噬细胞M1极化模型,人软骨细胞采用CoCl_(2)诱导建立缺氧凋亡模型,通过CCK-8法检测桃仁膝康丸对细胞的毒性,Western Blot检测全长基质金属蛋白酶9(Full-length Matrix Metalloproteinase-9,Full MMP9)、裂解基质金属蛋白酶9(Cleaved Matrix Metalloproteinase-9,Cleaved MMP9)、TNF-α、白细胞介素(Interleukin,IL)-6、全长半胱氨酸蛋白酶3(Full Caspase-3)和裂解半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)的表达。结果:1μL/mL及以下浓度的桃仁膝康丸不影响细胞活力;Western Blot结果显示,桃仁膝康丸显著抑制滑膜成纤维细胞MMP9生成、活化,以及M1巨噬细胞炎症因子生成和软骨细胞Caspase-3活化。结论:桃仁膝康丸可通过抑制基质降解酶的生成与活化、炎症因子的生成及软骨细胞凋亡发挥治疗骨性关节炎功能,其机制涉及软骨基质降解、炎症生物学过程和细胞凋亡通路,验证了网络药理学分析结果。