细胞培养/链特异性RT-PCR方法检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒滴度

目的建立检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒滴度的细胞培养/链特异性逆转录聚合酶链式反应(strand-specific reverse transcriptase-polymerase chain reaction,strand-specific RT-PCR)方法。方法根据甲型肝炎病毒(HAV)L-A-1株基因组序列,设计5条特异性引物。将甲型肝炎减毒活疫苗原液感染2BS细胞,收获增殖高峰期的HAV,提取RNA,进行2轮链特异性PCR扩增,检测HAV复制过程中的负链RNA,通过Reed-Muench公式计算HAV病毒滴度,并对建立的细胞培养/链特异性RT-PCR法进行特异性及敏感性验证,同时用该方法检测4批冻干甲型肝炎减毒活疫苗病毒滴度,并与《中国药典》三部(2010版)中甲型肝炎减毒活疫苗病毒滴度检测方法(细胞培养时间为28 d/ELISA法)进行比较。结果 HAV负链RNA经2轮扩增获得阳性扩增条带,大小与预期相符。该方法检测HAV复制过程中的负链RNA,特异性、敏感度均较好。两种方法检测的病毒滴度接近,差异无统计学意义(P>0.05)。结论建立的细胞培养/链特异性RT-PCR方法检测周期短,灵敏度、特异性好,可用于疫苗的滴度检测。

口蹄疫病毒链特异性荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了定量检测口蹄疫病毒(FMDV)的正链和负链RNA,揭示FMDV复制的分子机制,试验采用链特异性荧光定量RT-PCR(ssqRT-PCR)方法提取了FMDV的RNA,在FMDV链特异性反转录引物的5'端引入非病毒基因序列标签进行反转录,再经链特异性ssqRT-PCR扩增进行灵敏性、特异性、重复性检测。结果表明:FMDV基因组正链、负链RNA的链特异性ssqRT-PCR方法构建成功,该方法对FMDV正链和负链RNA检测的灵敏度达到1×101拷贝,具有较好的重复性和特异性。

链特异性RT-PCR方法检测口蹄疫病毒负链RNA

旨在建立一种快速、灵敏、特异的检测口蹄疫病毒在复制过程中产生的负链RNA的方法。根据口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)病毒5'-非编码区(5'-UTR)基因序列,设计了5条引物链特异性RT-PCR引物,建立检测口蹄疫病毒负链RNA的链特异性RT-PCR方法。提取FMD病毒RNA,应用设计的正向引物T1-H1做反转录引物,经反转录和RNA酶A消化后,再经两轮链特异性PCR扩增,可特异性地检测FMDV在复制过程中产生的负链RNA。所建立的检测口蹄疫病毒负链RNA的链特异性RT-PCR方法是一种可靠的方法,在确定细胞培养物和动物感染FMDV的病毒复制和了解病毒的致病性研究中具有应用前景。

实时RT-PCR法检测非小细胞肺癌淋巴微转移

目的以Lunx和血管内皮生长因子C(VEGF-C)及其受体为靶基因,实时PT-PCR法检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者癌旁组织、手术切除区域淋巴结微转移,探讨人肺特异性X蛋白(humanlung-specificXprotein,Lunx)、VEGF-C、VEGF受体3(VEGFR-3)的敏感性和特异性。方法以肺部良性病变切除的20枚淋巴结为对照,采用SYBRGreenⅠ嵌合荧光实时RT-PCR检测NSCLC手术切除区域淋巴结60枚LunxmRNA表达并与常规病理比较;以肺部良性病变切除的组织20例为对照,检测VEGF-C、VEGFR-3在30例癌旁组织中的表达。结果30例NSCLC患者癌旁组织VEGFCR-3、VEGF-C阳性率分别为60%(18/30)、77%(23/30),分别与病理阳性率37%(11/30)比较,均有显著差异(χ2=4,P<0.05;χ2=6.72,P<0.01);60枚NSCLC患者手术切除区域淋巴结Lunx阳性率78.3%(47/60),与病理阳性率55%(33/60)比较有显著差异(χ2=7.68,P<0.01)。结论VEGFCR-3、VEGF-C、Lunx均可作为NSCLC淋巴微转移的分子标志物,与病理比较有较高的敏感性;实验采用一种新颖的荧光实时RT-PCR相对定量方法分析结果,有助于早期肺癌转移的检测。

运用链特异性RT-PCR法进行脊髓灰质炎灭活疫苗的灭活验证

运用链特异性逆转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)建立了一种快速、灵敏、特异的脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)的灭活验证体系.以Sabin株脊髓灰质炎病毒悬液作为阳性对照,对脊髓灰质炎灭活疫苗进行检测.结果表明,链特异性RT-PCR法对具有活性的脊髓灰质炎病毒检测为阳性,而对脊髓灰质炎灭活疫苗的检测结果为阴性.链特异性RT-PCR法可作为一种简便、快速、灵敏的脊髓灰质炎灭活疫苗灭活验证方法,大大缩短了检测周期,在脊髓灰质炎灭活疫苗灭活验证的常规检测中具有较好的实际应用价值.

微小RNA-101通过USP22抑制人肝癌MHCC97H细胞的上皮-间质转化功能

目的研究微小核糖核酸(miR)-101对人肝细胞癌(肝癌)MHCC97H细胞的上皮-间质转化功能的影响及其相关机制。方法 MHCC97H肝癌细胞株分别转染miR-101 mimics和negative control mimic,分别作为M101组、NCM组,并设立未转染对照(control)组,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组细胞miR-101含量。Transwell实验检测3组细胞迁移能力和侵袭能力。Western-blot法检测3组细胞vimentin、α-catenin、E-cadherin和USP22表达水平。双荧光素酶实验检测miR-101与USP22的关系。结果 M101组miR-101的表达水平明显上调,表达水平约为control组的761倍(P<0.05)。M101组迁移细胞数量明显低于control组的[(15.7±1.6)个比(94.1±1.8)个,P<0.05]。M101组侵袭细胞数量明显低于control组的[(9.1±0.4)个比(51.6±0.9)个,P<0.05]。M101组细胞vimentin蛋白表达量明显降低,α-catenin及E-cadherin蛋白表达量明显升高,USP22蛋白表达量明显降低。双荧光素酶检验结果显示USP22为miR-101的下游靶基因。结论 miR-101可能通过降低下游靶基因USP22水平影响EMT相关蛋白表达,抑制MHCC97H肝癌细胞的上皮-间质转化功能。

人脂肪细胞总RNA的抽提及对脂联素mRNA的扩增

目的建立一种提取脂肪组织总RNA并能够有效地进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法。方法利用Trizol试剂提取人皮下脂肪组织总RNA,用紫外分光光度法鉴定其产率及纯度,用琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR鉴定所提取的总RNA的完整性。结果采用选择性mRNART-PCR试剂盒特异性地扩增出脂联素(adiponectin)和β肌动蛋白(β-actin)的mRNA。结论在脂肪组织总RNA抽提中容易混入基因组DNA,而采用选择性mRNART-PCR只针对mRNA进行特异的扩增。

聚合酶链反应在前列腺癌诊断中的应用

着重介绍反转录PCR(RT -PCR)检测前列腺肿瘤标志物如前列腺特异抗原 (PSA)和α -甲酰基辅酶A消旋酶 (AMARC)诊断前列腺癌的意义及进一步研究的方向。还介绍了利用甲基化特异性PCR技术检测π类谷胱苷肽 -S -转移酶I(GSTP1)CpP岛甲基化程度在诊断前列腺癌中的意义。

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV），采用MHV－3，MHV－A59病毒株感染DBT细胞，37℃培养，待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物，进行RT－PCR扩增，结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA，同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。

uc.12+A及其宿主基因SFPQ在小鼠B淋巴瘤细胞中的表达研究

目的利用链特异性逆转录聚合酶链式反应(strand-specific reverse transcriptase-polymerase chain reaction,strand-specific RT-PCR)方法,检测超保守RNA uc.12+A及其宿主基因SFPQ在小鼠B淋巴瘤细胞(38B9、myc3)中的表达水平,并与普通RT-PCR方法相比较。方法根据uc.12+A的序列设计链特异性逆转录引物,以小鼠B淋巴瘤细胞的RNA为模板进行反转录获得c DNA。随后通过实时荧光定量PCR技术,检测uc.12+A在小鼠B淋巴瘤细胞中的表达水平,并与普通RT-PCR的表达结果进行对比。在同样的淋巴瘤细胞株中通过RT-PCR与western blot检测宿主基因SFPQ的表达。结果在小鼠B淋巴瘤细胞株中,sfrand-specific RT-PCR检测到的uc.12+A表达较普通RT-PCR检测到的水平低,2种方法检测的uc.12+A在小鼠B淋巴瘤细胞中表达均显著高于小鼠正常B细胞中的水平。SFPQ在B淋巴瘤细胞中的表达亦显著高于正常B细胞。结论 uc.12+A与宿主基因SFPQ在小鼠B淋巴瘤细胞中的表达显著增高。

用简化RT-PCR诊断猪的瘟病毒感染

波兰研究人员对应用简化RT-nPCR诊断猪瘟(CSF)进行了研究。用TRIZOL从250μl含有病毒的细胞培养物上清中提取总RNA。将5μlRNA进行逆转录并用两种方法扩增:标准的三步法和改进并密闭的单管法。每种方法用两组引物。第一种引物根据瘟病毒基因组5′UTR,这种引物对所有瘟病毒都特异。第二种引物根据用于特异性检测CSFV株的E2蛋白编码区设计。

用RT-PCR检测乳样中的BVDV

反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)实验,检测乳样品体细胞的BVDV。本实验采用RNA提取试剂盒和RT-PCR程序构形。通过检查80群有BVD史的乳样,并与类似大小对照组样品的结果作对比。证明本实验特异性高,在20.5％有BVD史牛群中显示阳性结果,而对照群则无阳性者。

用RT-PCR鉴别口蹄疫病毒

比利时研究人员用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)同时,快速和准确鉴别组织培养中生长的口蹄疫病毒(FMDV)7个血清型。用引物P33和P32进行PCR检测所有这些血清型的FMDV。用2种含有可以区分这7种血清型的特异性引物的多引物PCR混合物测定阳性eDNA。

一种甲型肝炎灭活疫苗灭活验证试验方法的建立

目的探讨细胞培养/链特异性RT-PCR方法可否作为甲型肝炎(甲肝)灭活疫苗(L-A-1减毒株)的病毒灭活验证试验方法。方法根据甲肝病毒(HAV)L-A-1株基因组序列,设计5条基因特异性引物,提取HAV基因组RNA,应用设计的正向引物进行反转录,再进行两轮PCR扩增,通过检测HAV复制过程中的负链中间体,对甲肝灭活疫苗灭活验证试验方法进行探讨,并与《中华人民共和国药典》甲肝灭活疫苗HAV灭活验证试验方法进行比较。结果细胞培养/链特异性RT-PCR方法对HAV负链RNA特异、敏感。通过方法学验证试验表明,该方法的特异性、敏感性和重复性均良好。利用此方法对5批甲肝灭活疫苗(L-A-1减毒株)进行检测,结果全为阴性,与《中华人民共和国药典》甲肝灭活疫苗HAV灭活验证试验测定结果相同。结论细胞培养/链特异性RT-PCR方法快速、灵敏可靠,可作为检测甲肝灭活疫苗(L-A-1减毒株)HAV灭活验证试验的方法。

前列腺增生与前列腺癌特异性膜抗原mRNA的表达

目的以实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术研究良性前列腺增生(BPH)与前列腺癌(Pca)组织标本PSMmRNA的表达,探讨前列腺特异性膜抗原(PSM)在前列腺癌诊断的特异性意义。方法通过实时荧光定量PCR对23例PCa、37例BPH及3例正常前列腺组织PSMmRNA的表达,比较其在3种组织定量的差异。结果BPH与PCa组织PSMmRNA的定量表达值分别为1.54±0.21与4.95±0.78,差异有统计学意义(P<0.05)。结论实时荧光RTPCR定量检测PSMmRNA为前列腺癌的诊断、治疗、预后监测等提供了更为可靠的辅助指标。

抗人p185^(erbB2)人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建表达及活性测定

目的 :HER2 /neu过度表达见于多种恶性肿瘤。作为肿瘤抗原 ,p185 erbB2 是一个理想的肿瘤治疗靶点。本实验在既往工作基础上 ,构建嵌合型抗p185 erbB2 单克隆抗体 (单抗 )的真核表达载体 ,并在CHO dhfr-细胞中表达 ,从而降低鼠源性抗体的免疫原性 ,为进一步的应用研究奠定基础。方法 :RT -PCR扩增p185 erbB2 单抗 1 2的轻、重链可变区基因 ,插入嵌合抗体真核表达载体pWSD2中 ,脂质体转染CHO dhfr-细胞。经RT -PCR、间接ELISA、Westernblot检测人 -鼠嵌合抗体的表达水平 ,用ELISA、免疫沉淀方法对嵌合抗体的亲和力和特异性进行初步鉴定。此外 ,采用MTT比色法检测嵌合抗体对高表达p185 erbB2 的乳腺癌细胞系SKBR3的生长抑制作用。结果 :用RT -PCR、间接ELISA、Westernblot方法证明人 -鼠嵌合抗体在CHO dhfr-细胞中表达 ;ELISA检测提示嵌合抗体与高表达p185 erbB2的细胞反应阳性 ,与低表达p185 erbB2 的细胞反应阴性 ;免疫沉淀结果表明嵌合抗体可与p185 erbB2 分子特异性结合 ;MTT比色法检测表明嵌合抗体对过表达p185 erbB2 的乳腺癌细胞SKBR3的生长有抑制作用。结论 :CHO dhfr-细胞表达的人 -鼠嵌合抗体可与p185 erbB2 特异性结合 ,并可抑制高表达p185 erbB2 的肿瘤细胞生长 ,表明抗人p185 erbB2 人

抗CD20嵌合抗体的表达与活性检测

表达了基因重组抗CD20嵌合抗体并对其生物学活性进行了初步鉴定。设计合成轻、重链可变区序列;提取血液RNA,通过RT-PCR得到人κ、IgG1的轻、重链恒定区序列。运用重叠延伸PCR,连接可变区与恒定区,将轻、重链基因连接至pIRES双表达载体。将质粒以阳离子脂质体转染CHO细胞,ELISA挑选阳性克隆,共获得7株表达较高的克隆,表达量约为2mg/L。扩大培养阳性克隆anti-CD20-1B3,收获上清,以蛋白A进行亲和层析纯化表达蛋白。SDS-PAGE检测表明纯化纯度达到95%,蛋白相对分子量与理论值吻合。以CD20+细胞Raji、Daudi、Ramous检测,表明该抗体能与CD20抗原特异性结合,体外杀伤试验说明抗体能够杀伤CD20+淋巴瘤细胞。

猫衣原体病的诊断

诊断衣原体病最直接的方法是以细胞培养物分离衣原体,但对基层兽医实验室有许多困难。当今俄生产的试剂,广泛用于诊断动物衣原体病。取急性型或潜伏型家禽和哺乳动物的病料检测,其特异性可达100％,灵敏度为85—91％。

临床医学

S854.43 960861微载体细胞培养技术在兽医领域的应用/杨颐(上海农科院畜牧兽医研究所 200030),刘洪云,陈谊//上海畜牧兽医通讯.-1995,(3):-26～27细胞培养是组织培养中的一种,是将原代外植块生长晕用机械法或酸法分离细胞,作成细胞悬液,再培养于固体基质上,或单层细胞生长。